ГФ №11, том 1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи СССР
 Скачать 2.11 Mb.
|
|
. и D3, так что lg D2 находится посередине интервала lg D1 - lg D3. . В этом случае критерием линейности может служить отношение: _ _ _ у1 + у3 - 2у2 t = ------------------------- , (II.2.2) ------------------- / 2 / 2 SUM d / n(n - 1), / n 2 _ 2 _ 2 _ 2 где SUM d = SUM (у1 - у1) + SUM (у2 - у2) + SUM (у3 - у3) . n n n n Когда численности групп неодинаковы, для n = n1 + n2+ n3 производится замена: 2 2 SUM d SUM d n n 1 1 1 ---------- -> ----------------- (--- + --- + ---). (II.2.3) n(n - 1) n1 + n2 + n3 - 3 n1 n2 n3 Если значение t, вычисленное по II.2.2, окажется больше критического значения t (P, f) для числа степеней свободы <*> f = 3 x (n - 1), то гипотезу о линейности связи между у и lg D можно отвергнуть с вероятностью, большей Р. -------------------------------- <*> f = n1 + n2 + n3 - 3 при неравных численностях групп. Если гипотеза о линейности связи не опровергается, то переходят к проверке значимости наклона прямой, выражающей зависимость эффекта от дозы. Для этого вычисляют величину: ------------- / 3n(n - 1) _ _ t = / ----------- (у3 - у1). (II.2.4) / 2 / 2 SUM d / n Если эта величина окажется меньше, чем t(95%, f) при f = 3(n - 1), то можно считать, что эффект не зависит от дозы; если же t > t(95%, f), то эффект зависит от дозы <*>. -------------------------------- <*> Может показаться, что если эффект не зависит от дозы, то теряет смысл проверка линейности связи между у и lg D, и анализ надо начинать с применения критерия II.2.4, а не II.2.2. Но это не так. Если зависимость нелинейна, то критерий II.2.4 относится к среднему наклону, который может оказаться равным нулю, хотя активность при разных дозах различна. Когда линейный характер зависимости у от lg D известен для препарата данного состава из предыдущих исследований и требуется лишь проверить значимость наклона прямой, выражающей эту зависимость, то можно обойтись испытаниями только для двух доз D1 и D2. В этом случае вместо II.2.4 для вычисления t применяют формулу: ----------- / n(n - 1) _ _ t = / ---------- (у2 - у1). (II.2.5) / 2 / SUM d / n Љ 2 _ 2 _ 2Ї Јf = 2(n - 1), причем SUM d = SUM (у1 - у1) + SUM (у2 - у2) Ј. ђ n n n ‰ При различных численностях групп в II.2.5 производят замену, аналогичную II.2.3. Если по критерию II.2.4 или II.2.5 установлено, что эффект зависит от дозы, то оценку констант Ь и у0 проводят по формулам: _ _ у3 - у1 b = -------------; (II.2.6) lg D3 - lg D1 _ _ _ у0 = (у1 + у2 + у3) / 3 - b(lg D1 + lg D3) / 2 (II.2.7) при использовании трех доз и _ _ у2 - у1 b = -------------; (II.2.8) lg D2 - lg D1 Љ _ _ Ї y0 = Ј(у1 + у2) - b(lg D1 + lg D2)Ј / 2 (II.2.9) ђ ‰ при использовании двух доз. Доверительные интервалы для этих параметров строятся с использованием их стандартных ошибок, равных при трех дозах: ------------------- ---------- / 2 / 2 /2 SUM d / n(n - 1) / SUM d / n / n s = ------------------------ ; s = / --------------- , b lg D3 - lg D1 у0 / 2n(n - 1) (II.2.10) а при двух дозах ------------------- ----------- / 2 / 2 /2 SUM d / n(n - 1) / SUM d / n / n s = ------------------------ ; s = / --------------- , b lg D2 - lg D1 у0 / 2n(n - 1) (II.2.11) Оценки параметров Ь и у0 получаются более точными, если испытания проведены при большем числе доз. В этом случае вычисления должны производиться по общим формулам регрессионного анализа. В частности (см. раздел I.6), SUM (xу) - SUM x SUM у/n n n n b = ------------------------, (II.2.12) 2 2 SUM x - (SUM x) / n n n у0 = (SUM у - bSUM x) / n, (II.2.13) n n где x = lg D, a n - общее число экспериментальных точек для всех доз. Достаточно хорошее приближение получается, если в эти формулы _ вместо индивидуальных значений у подставить значения у для каждой из доз; в этом случае n будет означать число доз, а значения х и 2 х будут входить в соответствующие суммы по одному разу. II.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКВИВАЛЕНТНЫХ ДОЗ Одной из основных задач биологического испытания является 0 установление эквивалентной дозы, т.е. той дозы D стандартного препарата, которой соответствует по своей биологической активности доза D испытуемого препарата. Биологическая активность последнего может очень сильно зависеть от особенностей выбранной группы тест - объектов, их физиологического состояния, времени года, деталей лабораторной методики и многих других факторов. Поэтому определение эквивалентных доз требует одновременного применения испытуемого и стандартного препаратов к двум подгруппам однородной группы тест - объектов. Определение эквивалентных доз требует также знания того, как биологическая активность зависит от дозы. Описанные ниже методы относятся к тому наиболее частому случаю, когда биологическая активность у связана линейно с логарифмом дозы D по уравнению II.2.1; проверка такой линейности производится при помощи критерия II.2.2. Испытуемый препарат может отличаться от стандартного как по наклону прямой (т.е. по значению коэффициента Ь), так и по ее положению (т.е. по значению постоянной у0). Если имеются основания предполагать, что наклоны обеих прямых одинаковы (Ь = Ь0) и, следовательно, различие между препаратами обусловлено лишь различными значениями параметра у0, то для установления эквивалентных доз достаточно определить активность одного из препаратов при двух различных дозах, а другого - при одной дозе. Разумеется, активность для каждой дозы должна определяться из нескольких измерений, так что речь идет здесь о средних активностях. Во всех случаях предполагается, что для каждой дозы использовано одно и то же число n тест - объектов и что все распределения случайных вариаций нормальны с дисперсией, не зависящей от самих активностей. Если нет достаточных оснований предполагать, что Ь = Ь0, то следует произвести для каждого препарата испытания по крайней мере 0 0 при двух дозах: D1, D2 и D1, D2; удобнее выбрать эти дозы так, 0 0 чтобы D2 / D1 = D2 / D1. Вообще же результаты испытания получаются тем точнее, чем больше доз использовано. Поэтому, помимо упомянутых выше испытаний, т. е. испытаний типов 1; 2 (или 2; 1) и 2; 2, в фармакопее предусматриваются также испытания других типов (см. табл. IV, приложения). По результатам испытаний вычисляют прежде всего средние эффекты при каждой из доз - отдельно для стандартного и испытуемого препаратов. Затем находят значения. _ "ФИ" = SUM "е "у / "z ", (II.3.1) ФИ ФИ где "ФИ" - общее обозначение для функций Е, F, G, Н (см. табл. IV, _ приложения), а через у обозначена вся совокупность средних _0 _0 _0 _0 _ _ _ значений у1, у2, у3, у4, у1, у2, у3, у4; множители "е ", и ФИ знаменатели "z " берутся из табл. IV приложения. Полученные ФИ величины характеризуют: Е - различие между эффектами вследствие различия доз; F - различие между эффектами вследствие различия между препаратами; G - параллельность дозовых зависимостей испытуемого и стандартного препарата; Н - линейность этих дозовых зависимостей. Для испытаний типов 2; 1,3; 1, 3; 2 и 4; 3 надо 0 _ переставить местами коэффициенты "е " для у и у, причем для F и ФИ G с изменением всех знаков на обратные, а для Е и Н - без изменения знаков; значения "z " и дисперсий остаются без ФИ _0 изменения. Значения Н должны вычисляться отдельно для набора у и _ отдельно для набора у, т.е. линейность дозовой зависимости проверяется отдельно для стандартного и отдельно для испытуемого препаратов. По результатам испытания вычисляется также величина: Љ n _ 2 Ї SUM Ј SUM (у - у ) Ј i ђ j=1 ij i ‰ V = ----------------------- , (II.3.2) 0 (r + r)n(n - 1) _ где у - индивидуальные эффекты при i-й дозе, у , - средний ij 0 i эффект при этой дозе; r , r - соответственно число доз для стандартного и испытуемого препаратов; n - число испытаний при каждой дозе (оно должно быть одинаковым при всех дозах; нарушения этого исправляются так, как было описано в параграфе II.1). После этого по формулам в последнем столбце табл. IV приложения вычисляют величины А, В, V и V , необходимые для построения G H доверительных интервалов и проверки значимостей [при этом используется табличное значение t для числа степеней свободы f = 0 Р (r + r)(n - 1); I - разность логарифмов соседних доз]. Прежде всего проверяют (где это допускается числом использованных доз) линейность дозовых зависимостей и их параллельность, вычисляя H t = --------- ; (II.3.3) ---- / V / H G t = --------- . (II.3.4) ---- / V / G Полученные значения должны быть меньше t(95%, Р). Если нарушения линейности и параллельности дозовых зависимостей не обнаружено, то вычисляют: b = E / I (II.3.5) - наклон прямой дозовой зависимости (средний для обоих препаратов); M = F / b (II.3.6) - логарифм отношения эквивалентных доз, т. е. величину 0 М = lg (D / D); 0 D / D = antilg (2 + M) (II.3.7) - отношение эквивалентных доз (в процентах); t --------------- M P / 2 M = ----- +/- ---------- / A(1 - g) + BM (II.3.8) H;B 1 - g b(1 - g) / - Р-процентные доверительные границы для М, причем 2 2 g = Bt / b ; (II.3.9) P наконец, получают 0 (D / D) (II.3.10) H; B - Р-процентные доверительные границы для отношения эквивалентных доз (в процентах). Середины доверительных интервалов II.3.8 не совпадают со значениями М из II.3.6, особенно при больших значениях g. Величина g должна быть всегда меньше единицы, в противном случае весь опыт следует считать некорректным и нуждающимся в повторении. Если можно предположить, что активности испытуемого и стандартного препаратов отличаются незначительно, следует выбирать 1 0 0 дозы так, чтобы было соответственно lg D = --- (lg D1 + lg D2), 2 0 1 lg D = --- (lg D1 + lg D2) в испытаниях типа 2; 1 и 1; 2 либо 2 0 0 D1 = D1; D2 = D2 в испытании типа 2; 2 и т. д. При существенном отличии этих активностей такой выбор доз неоптимален и от него следует отказаться. В этом случае из значения М, полученного по 1 0 0 формуле II.3.6, следует вычесть величины lg D - - (lg D1 + lg D2), 2 0 1 0 lg D - --- (lg D1 + lg D2), lg D1 - lg D1 или др. в зависимости 2 от типа испытания. В формулы II.3.7 и II.3.8 должно войти уже скорректированное значение М. Пример II.4. В табл. II.3.1 приведены результаты испытания по стандартизации образца АКТГ; эффект характеризуется концентрацией (в мг%) аскорбиновой кислоты в надпочечнике. В данном случае мы имеем испытание типа 2; 3. По формуле II.3.1 получаем, используя _ значения "e " и "z " из табл. IV приложения, а значения у - из ФИ ФИ табл. II.3.1: _0 0 _ _ _ Е = [(-1)у1 + 1у2 + (-2)у1 + 0у2 + 2у3] / 5 = = (-351 + 269 - 2 х 336 + 2 х 189) / 5 = -75,2; F = (- 3 х 351 - 3 х 269 + 2 х 336 + + 2 х 256 + 2 х 189) / 6 = - 49,67; G = (2 х 351 - 2 х 269 - 336 + 189) / 2 = 8,5: Н = 336 - 2 х 256 + 189 = 13,0. Далее по данным из табл. II.3.1 находим: 2552 + 1660 + 1958 + 2802 + 1582 V = --------------------------------- = 70,36, (2 + 3) х 6 x (6 - 1) так что формулы последнего столбца табл. IV, приложения, дают значения: А = 5 х 70,36/6 = 58,63; B = 77,66; V = 175,90; V = 422,16. G H При вычислении B учтено, что I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602. Проверка на линейность дозовой зависимости и на параллельность прямых дает: --- ------- H / /V = 13,0 / / 422,16 = 0,633; / Н --- ------- G / /V = 8,5 / / 175,90 = 0,641. / G Таблица II.3.1 Уровни факторов (дозы) Љ””””””””””””””””’”””””””””””’”””””””””””’”””””””””””’”””””””””””’”””””””””””Ї Ј Ј 0 Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Эффекты Ј 0 y1, Ј 0 y2, Ј y1, Ј y2, Ј y3, Ј Ј ЈD1 = 0,1 ЕДЈD2 = 0,4 ЕДЈD1 = 0,1 ЕДЈD2 = 0,4 ЕДЈD3 = 1,6 ЕДЈ “””””””””””””””””•”””””””””””•”””””””””””•”””””””””””•”””””””””””•”””””””””””¤ Ј Ј 370 Ј 225 Ј 310 Ј 276 Ј 187 Ј Ј Ј 342 Ј 268 Ј 356 Ј 228 Ј 215 Ј Ј Ј 335 Ј 284 Ј 345 Ј 252 Ј 200 Ј Ј y Ј 369 Ј 247 Ј 313 Ј 273 Ј 168 Ј Ј ji Ј 318 Ј 296 Ј 340 Ј 279 Ј 193 Ј Ј _ Ј 372 Ј 264 Ј 352 Ј 228 Ј 171 Ј Ј y Ј 351 Ј 269 Ј 336 Ј 256 Ј 189 Ј Ј i Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј n _ 2Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј SUM (y - y) Ј 2552 Ј 1660 Ј 1958 Ј 2802 Ј 1582 Ј Ј j=1 ij Ј Ј Ј Ј Ј Ј ђ””””””””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‰ 0 Обе эти величины меньше, чем t(95%; f) = 2,060 [для f = (r + r) х (n - 1) = 25 степеней свободы], так что можно продолжать расчет. По формулам II.3.5 и II.3.6 получаем: Ь = - 75,2 / 0,602 = -124,9; M = - 49,67 / (-124,9) = 0,3977. Поскольку в данном испытании средние дозы стандартного и испытуемого препаратов не совпадают, то надо из M вычесть величину lg 0,l + lg 0,4 + lg l,6 lg 0,1 + lg 0,4 ------------------------ - --------------- = 3 2 = - 0,3980 + 0,6990 = 0,3010, так что 0 М = 0,3977 - 0,3010 = 0,0967; D /D = 124,9%. Далее вычисляем по формулам II.3.9 и II.3.8: 2 77,66 х 1,960 g = ------------- = 0,0191; 1 - g = 0,9809; 2 (- 124,9) 0,0967 1,96 M = ------- +/- ------------------ x H,B 0,9809 (- 124,9) х 0,9809 -------------------------------- x / 58,63 х 0,9809 + 77,66 х 0,0961 = [- 0,0235; 0,2207]. Окончательно получаем: 0 (D /D) = [94,7%; 166,2%]. H, B Доверительные интервалы во всех этих испытаниях могут быть сужены, если использовать в опыте сопряженные группы животных. Например, в испытании типа 2;2 целесообразно использовать n четверок животных, каждая из которых содержит животных из одного помета, одинакового пола и близкой массы тела; каждая четверка 0 0 животных используется для определения четверки значений: у1; у2, у1 и у2. При такой постановке опыта 2 2 SUM d - SUM "ДЕЛЬТА" V = ---------------------, (II.3.11) 3n(n - 1) 2 где d - числитель формулы II.3.2, а 2 0 0 _0 _0 _ _ 2 SUM "ДЕЛЬТА" = SUM [(у1 + у2 + у1 + у2) - (у1 + у2 + у1 + у2)] . (II.3.12) Число степеней свободы равно f = 3(n - 1). Доверительный интервал может быть также сужен, если методика испытания допускает выполнение повторных определений на каждом животном - с достаточным разрывом во времени, обеспечивающем восстановление исходного состояния после первого опыта. В повторном опыте те животные, на которых определялась активность 0 у , используются для определения у и наоборот. Кроме того, животные, получившие в первом опыте меньшую дозу, получают во втором опыте большую дозу и наоборот (метод двойного перекреста, см. табл. II.3.2). Таблица II.3.2 Љ””””””””’””””””””””””’””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””Ї Ј Группа Ј Первый Ј Второй Ј Разность результатов Ј ЈживотныхЈ опыт Ј опыт Ј Ј “””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤ Ј Ј 0 Ј Ј 0 Ј Ј1 Ј у1 Ј у2 Ј ДЕЛЬТА1 = у2 - у1 Ј “””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤ |