ГФ №11, том 1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи СССР
 Скачать 2.11 Mb.
|
|
Ј Ј 0 Ј Ј 0 Ј Ј2 Ј у2 Ј у1 Ј ДЕЛЬТА2 = у1 - у2 Ј “””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤ Ј Ј Ј 0 Ј 0 Ј Ј3 Ј у1 Ј у2 Ј ДЕЛЬТА3 = у2 - у1 Ј “””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤ Ј Ј Ј 0 Ј 0 Ј Ј4 Ј у2 Ј у1 Ј ДЕЛЬТА4 = у1 - у2 Ј ђ””””””””‘””””””””””””‘””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””””‰ При таком построении испытания надо пользоваться формулами: ______ ______ ______ ______ E = (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА2 + ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.13) ______ ______ ______ ______ F = (ДЕЛЬТА1 + ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.14) ______ 2 ______ 2 SUM (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА1) + SUM (ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА2) n n V = ------------------------------------------------------ + 8n(n - 1) (II.3.15) ______ 2 ______ 2 SUM (ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА3) + SUM (ДЕЛЬТА4 - ДЕЛЬТА4) n n + -----------------------------------------------------; 8n(n - 1) 2 А = V/2, B = V/(2I ). (II.3.16) Дальнейшие расчеты производят по формулам II.3.5 - II.3.10, причем t(P, f) берется из табл. II приложения для числа степеней свободы f = 4 (n - 1). Пример II.5. В табл. II.3.3. приведены результаты испытания (стандартизация образца АКТГ), построенного по методу двойного перекреста (в примере II.4 эти же данные были использованы в умышленно рандомизированном виде, чтобы не сказывался эффект сопряженности тест - объектов). По формулам II.3.13 - II.3.16 (получаем): Е = (-90 - 66 - 68 - 101)/4 = -81,25; F = (-90 + 66 + 68 - 101)/4 = -14,25; V = (1178 + 104 + 258 + 546)/(8 х 3 х 2) = 43,46; 2 А = 43,46/2 = 21,73; В = 43,46/(2 х 0,602 ) = 59,96 (I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602); кроме того, f = 4 х 2 = 8, t (95%, 8) = 2,306. Теперь по формулам II.3.5-II.3.10 находим: Ь = -81,25/0,602 = -135,0; 0 M = -14,25 / (-135,0) = 0,1056; D /D = 127,6%; 2 2 g = 59,96 х 2,306 / (-135,0) = 0,0175; 1 - g = 0,9825; 0,1056 М = ------ +/- H,B 0,9825 -------------------------------- 2,306 / 2 +/- ---------------- / 21,73 х 0,9825 + 59,96 х 0,1056 = - 135,0 х 0,9825 = 0,1075 +/- 0,0816 = [0,0259; 0,01891]; 0 (D /D) = [106,1%; 154,6%]. H,B 0 Доверительный интервал для D /D получился более узким, чем без учета сопряженности тест - объектов (см. пример II.4), хотя использовано меньше результатов испытаний. Когда имеются результаты нескольких независимых определений эквивалентных доз, их можно объединить с целью получения более 0 точной оценки для D /D и более узкого доверительного интервала для этой величины. При этом пользуются приближенными формулами (точные формулы весьма громоздки): _ _ M M = ------ +/- t(P, f)S , (II.3.17) H,B 1 - g M _ M Mj ------ = SUM (Wj -----) / SUM Wj ; (II.3.18) 1 - g 1 - g j ------- S = 1 / / SUM Wj , (II.3.19) M 2 где весовыми коэффициентами Wj, служат обратные дисперсии 1 / s : Mj 2 2 b (1 - g ) 1 j j Wj = ---- = -------------------; (II.3.20) 2 2 s Аj(1 - g ) + BjMj Mj j j = 1, 2, ..., k есть номер испытания, a t(P, f) берется для числа степеней свободы, равного сумме чисел степеней свободы отдельных испытаний: f = SUM f . Доверительный интервал для усредненного 0 j отношения D /D находят по формуле: _ (D0/D) = antilg(2 + M ). (II.3.21) H,B H,B Законность указанного объединения (т. е. случайности различия между отдельными М) проверяют при помощи критерия "хи - квадрат": 2 Љ Ї2 2 Mj Ј Mj Ј "хи" = SUM (Wj --------- ) - ЈSUM (Wj ------)Ј / SUM Wj (II.3.22) 2 2 Ј 1 - g Ј (1 - g ) ђ j ‰ j 2 2 2 должно быть "хи" < "хи" (95%, f), где "хи" (95%, f) берут из табл. II Таблица II.3.3 Љ””””””’”””””””””””””””’”””””””””””””””’””””””’”””””””””””””””’””””Ї ЈГруппаЈ1-й день опыта Ј2-й день опыта Ј"ДЕЛЬ-Јd = "ДЕЛЬТА" - Ј 2 Ј Ј Ј Ј ЈТА" Ј ______ Јd Ј Ј Ј Ј Ј Ј- "ДЕЛЬТА" Ј Ј “””””””•”””””””””””””””•”””””””””””””””•””””””•”””””””””””””””•””””¤ Ј1 Ј 370Ј 273Ј- 97 Ј- 7 Ј49 Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Јy1 342Јy2 279Ј- 63 Ј 27 Ј729 Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ј ЈD1 = 0,1 ЕД 335ЈD2 = 0,4 ЕД 225Ј- 110 Ј- 20 Ј400 Ј Ј Ј ЈСумма Ј- 270 Ј 0 Ј1178Ј Ј Ј ЈСреднее Ј- 90 Ј Ј Ј Ј2 Ј 255Ј 313Ј 58 Ј- 8 Ј64 Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Јy2 268Јy1 340Ј 72 Ј 6 Ј36 Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ј ЈD2 = 0,4 ЕД 284ЈD = 0,1 ЕД 352Ј 68 Ј 2 Ј4 Ј Ј Ј ЈСумма Ј 198 Ј 0 Ј104 Ј Ј Ј ЈСреднее Ј 66 Ј Ј Ј Ј3 Ј 310Ј 247Ј- 63 Ј 5 Ј25 Ј Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Јy1 356Јy2 296Ј- 60 Ј 8 Ј64 Ј Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј ЈD1 = 0,1 ЕД 345ЈD2 = 0,4 ЕД 264Ј- 81 Ј- 13 Ј169 Ј Ј Ј ЈСумма Ј 204 Ј 0 Ј258 Ј Ј Ј ЈСреднее Ј- 68 Ј Ј Ј Ј4 Ј 276Ј 369Ј 93 Ј- 8 Ј64 Ј Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј Јy2 228Јy1 318Ј 90 Ј- 11 Ј121 Ј Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј ЈD2 = 0,4 ЕД 252ЈD1 = 0,1 ЕД 372Ј 120 Ј 19 Ј361 Ј Ј Ј ЈСумма Ј 303 Ј 0 Ј546 Ј Ј Ј ЈСреднее Ј 101 Ј Ј Ј ђ””””””‘”””””””””””””””‘”””””””””””””””‘””””””‘”””””””””””””””‘””””‰ приложения для числа степеней свободы f = k - 1 (k - число объединяемых испытаний). В частности, когда объединяются результаты двух испытаний, то Љ M1 M2 Ї W1W2Ј------ - ------ Ј 2 ђ1 - g1 1 - g2 ‰ "хи" = ------------------------- (II.3.23) W1 + W2 2 при f = 1, так, что "хи" (95%, 1) = 3,84. II.4. ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ЛАТИНСКОГО КВАДРАТА При биологическом испытании антибиотиков методом диффузии в агар на лотках наиболее употребительна схема латинского квадрата, позволяющая рандомизировать неоднородность бактериальной культуры по обоим направлениям поверхности питательной среды. Например, в случае испытания 2; 2 дозы могут располагаться следующим образом: 0 0 D1 D2 D1 D2 0 0 D2 D1 D2 D1 (II.4.1) 0 0 D1 D2 D1 D2 0 0 D2 D1 D2 D1 Здесь каждая доза встречается по одному разу в каждой строке и в каждом столбце. В данном случае последовательные строки получены циклической перестановкой из предыдущих строк, но это не единственный способ построения латинского квадрата. Например, можно переставлять столбцы или строки (или и то, и другое) из приведенной выше схемы по жребию. В руководствах по планированию эксперимента можно найти и другие схемы. Если для стандартного и испытуемого препаратов используются по три дозы, то соответствующий латинский квадрат будет иметь шесть строк и шесть столбцов и т.д. При двух дозах стандартного и двух дозах испытуемого препарата можно построить латинский квадрат 8х8, располагая дозы так, чтобы каждая встречалась по два раза в каждой строке и в каждом столбце. 0 Введем следующие обозначения: k - число строк в квадрате; r и r - соответственно число использованных доз стандартного и 0 испытуемого препаратов (например, при размещении четырех доз D1, 0 0 D2, D1, D2 в квадрате 8х8 будет k = 8, r = 2, r = 2, а для 0 квадрата II.4.1: k = 4, r = 2, r = 2); у - эффективность в ij ячейке квадрата на пересечении i-й строки и j-го столбца (независимо от того, относится эта эффективность к стандартному _ _ или испытуемому препарату); у = SUM у /k и у = SUM у / k - i j ij j ij средние эффективности соответственно для строки i и для столбца j; 2 _ _ у = SUM y /k = SUM у /k = SUM у / k i,j i,j i i j j - общая средняя эффективность для всего комплекса. Тогда 2 Љ 2 2Ї SUM d - k ЈSUM d + SUM d Ј j,i ђ i i j j‰ V = ----------------------------- , (II.4.2) 2 0 n(k - 2k - r - r + 2) 2 Љ _ 2Ї Љ _ 2Ї где SUM d = SUM ЈSUM (у - у ) Ј = SUM ЈSUM (у - у ) Ј, i ђ j i,j i ‰ j ђ i,j j ‰ 2 _ _ 2 2 _ _ 2 SUM d = SUM (у - у ) , SUM d = SUM (у - у ) , i i i j j j а n - число испытаний при каждой дозе стандартного или испытуемого препарата. Остальные расчеты производятся по формулам предыдущего параграфа, причем t(P, f) берутся из табл. II приложения для числа степеней свободы f = (k -1)(k - 2). Пример II.6. В табл. II.3.3 приведены результаты совместного испытания стандартного и испытуемого препаратов неомицина при дозах 100 и 200 мкг в 1 мл; активность характеризуется диаметром зоны угнетения в миллиметрах. Использован латинский квадрат вида (II.4.1). В этой же таблице показаны расчеты, приводящие к 2 2 величинам SUM d и SUM d , а в табл. II.4.2 показано вычисление i i j j 2 средних дозовых эффективностей и величины SUM d . i,j 2 Таким образом, SUM d = 14,00 + 28,75 + 5,00 + 8,75 = 56,50, i,j 0 а так как в данном случае n = 4, k = 4, r = 2, r = 2, то по формуле II.4.2 получаем: 56,50 - 4 x (5,125 + 2,125) V = --------------------------- = 1,146. 4 x (16 - 8 - 2 - 2 + 2) Данное испытание относится к типу 2;2, так что использование соответствующего раздела табл. IV приложения вместе с формулами II.3.4 - II.3.10 дает: G = 219,0 - 230,75 - 221,50 + 232,75 = - 0,50; --- V = 4 х 1,146 = 4,584; ЈGЈ / / V = 0,233 < 2,447 G / G (t(95%, f) для f = (4 - 1)(4 - 2) = 6), поэтому одинаковость наклонов двух дозовых прямых не отвергается; далее: Е = (- 219,0 + 230,75 - 221,50 + 232,75) / 2 = 11,50; F = (- 219,0 - 230,75 + 221,50 + 232,75) / 2 = 2,25; 2 A = V = 1,146; I = lg 200 - lg 100 = 0,301; B = V/I = 12,65; 0 b = 11,50/0,301 = 38,2; M = 2,25/38,2 = 0,0589; D /D = 114,5%; 2 2 g = 12,65 х 2,447 /38,2 = 0,052; 1 - g = 0,948; 0,0589 M = ------- +/- H, B 0,948 -------------------------------- 2,447 / 2 +/- ------------ / 1,146 х 0,948 + 12,65 х 0,0589 = 38,2 х 0,948 = 0,062 +/- 0,0718 = [- 0,0097; 0,1340]; 0 (D /D) = 97,8%; 136,1%. H, B При проведении испытания по методу латинского квадрата потеря отдельных результатов нарушает всю схему расчетов, поэтому необходимо "заместить" их надлежащими оценками. Проще всего это можно сделать, подставив на место выпавшего результата среднее из оставшихся результатов для той же дозы того же препарата. Применяемый в дисперсионном анализе более сложный способ оценки выпавшего значения не дает в задаче определения эквивалентных доз существенного повышения точности общих результатов испытания. Таблица II.4.1 Љ”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””’”””””””’””””””’”””””’””””””Ї Ј _ Ј Ј Ј Ј 2 Ј Ј Результаты испытания, у ЈSUM у Ј у Ј d Ј d Ј Ј ij Ј j ijЈ i Ј i Ј i Ј “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤ Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ју = 222 у = 229 у1 = 222 у2 = 235 Ј 908 Ј227,00Ј1,00 Ј1,0000Ј Ј 1 2 Ј Ј Ј Ј Ј “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤ Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ју2 = 231 у = 217 у = 231 у1 = 220 Ј 899 Ј224,75Ј-1,25Ј1,5625Ј Ј 1 2 Ј Ј Ј Ј Ј “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤ Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ју1 = 221 у2 = 233 у = 218 у = 228 Ј 900 Ј225,00Ј-1,00Ј1,0000Ј Ј 1 2 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤ Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј Ју = 235 у1 = 223 у2 = 232 у = 219 Ј 909 Ј227,25Ј1,25 Ј1,5625Ј Ј 2 1 Ј Ј Ј Ј Ј “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””‘””””””‘”””””‘””””””¤ Ј Ј 2 Ј ЈSUM у 909 902 903 902 Ј 3616 SUM d = 5,12 Ј Ј i i,j Ј i i Ј Ј Ј _ Ј Ју 227,25 225,50 225,75 225,50Ј у = 226,00 Ј Ј j Ј Ј Јd 1,25 - 0,50 - 0,25 - 0,50Ј Ј Ј j Ј Ј Ј 2 Ј 2 Ј Јd 1,5625 0,2500 0,0625 0,2500Ј SUM d = 2,125 Ј Ј j Ј j j Ј ђ”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””‰ Таблица II.4.2 Љ”””””””’””””””’”””’””’””””””’””””””’”””””””’””””””’”””””’””””’””””””’””””””’””””””Ї Ј Ј 0 Ј Ј 2Ј 0 Ј Ј 2 Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј y Ј d Јd Ј y Ј d Ј d Ј y1 Ј d Ј d Ј y Ј d Ј d Ј Ј Ј 1 Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј “”””””””•””””””•”””•””•””””””•””””””•”””””””•””””””•”””””•””””•””””””•””””””•””””””¤ Ј Ј 222 Ј 3 Ј9 Ј 229 Ј- 1,75Ј 3,0625Ј 222 Ј 0,5 Ј0,25Ј 235 Ј 2,25 Ј5,0625Ј Ј Ј 217 Ј- 2Ј4 Ј 231 Ј 0,25Ј 0,0625Ј 220 Ј- 1,5Ј2,25Ј 231 Ј- 1,75Ј3,0626Ј Ј Ј 218 Ј- 1Ј1 Ј 228 Ј- 2,75Ј 7,5625Ј 221 Ј- 0,5Ј0,25Ј 233 Ј 0,25 Ј0,0625Ј Ј Ј 219 Ј 0 Ј0 Ј 235 Ј 4,25Ј18,0625Ј 233 Ј 1,5 Ј2,25Ј 232 Ј- 0,75Ј0,5625Ј “”””””””•””””””•”””•””•””””””•””””””•”””””””•””””””•”””””•””””•””””””•””””””•””””””¤ ЈСумма Ј 876 Ј 0 Ј14Ј 923 Ј 0 Ј 28,75 Ј 886 Ј 0 Ј 5 Ј 931 Ј 0 Ј 8,75 Ј ЈСреднееЈ219,00Ј Ј Ј230,75Ј Ј Ј221,50Ј Ј Ј232,75Ј Ј Ј ђ”””””””‘””””””‘”””‘””‘””””””‘””””””‘”””””””‘””””””‘”””””‘””””‘””””””‘””””””‘””””””‰ II.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР НА ЧАШКАХ ПЕТРИ Описанная в предыдущем параграфе методика определения активности антибиотиков по схеме латинского квадрата предполагает использование лотков. Возможен и другой способ определения этой активности - по диффузии в агар на чашках Петри. Ниже описан трехдозный вариант этого метода <*>. -------------------------------- <*> Этот раздел основан на разработке Всесоюзного НИИ антибиотиков и Государственного НИИ по стандартизации и контролю лекарственных средств Министерства здравоохранения СССР. Стандартный (S) и испытуемый (U) образцы растворяют из расчета 1 мг в 1 мл (основной раствор), затем готовят по три концентрации S S S рабочих растворов стандарта (D1, D2, D3) и испытуемого образца U U U (D1, D2, D3), относящиеся друг к другу как 1:2:4. Все 6 растворов закапывают на одну чашку Петри, причем последовательность внесения растворов в цилиндры или в лунки должна быть случайной (возможные последовательности внесения растворов приведены в табл. II.5.1). Число чашек n должно быть не меньше 6. Для уменьшения влияния колебаний во времени между внесением различных растворов рекомендуется после внесения растворов выдерживать чашки в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После S U измерения зон угнетения роста результаты опыта у , и у i,j i,j (i = 1, 2, 3 - номера доз, j = 1, 2, ..., n - номера чашек) записывают в таблицу (как показано в приведенном ниже численном примере). Там же записывают получаемые расчетом следующие вспомогательные величины: S U Si = SUM у и Ui = SUM у (II.5.1) j i,j j i,j - суммы по чашкам для каждой дозы стандарта и испытуемого образца; S U Tj = SUM у + SUM у , (II.5.2) i i,j i i,j - суммы по всем дозам для каждой чашки; у = SUM у = (S1 + S2 + S3) +(U1 + U2 + U3) = SUM Tj (II.5.3) i,j i,j j - суммы всех диаметров зон задержки роста по всем дозам и чашкам. Далее вычисляют: S = S1 + S2 + S3 и U = U1 + U2 + U3 (II.5.4) - суммы всех диаметров зон задержки роста отдельно для стандарта и для испытуемого образца; L = S3 - S1 и L = U3 - U1 (II.5.5) S U - "линейные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца; Q = S1 - 2S2 + S3 и Q = U1 - 2U2 + U3 (II.5.6) S U "квадратичные контрасты" для стандарта и для испытуемого образца. Для проверки законности дальнейших расчетов следует провести дисперсионный анализ результатов опыта в соответствии с табл. II.5.2, а именно должно получиться F < F(95%; f, fост) для строк 2, 3, 4 и F > F (95%) для строки 1. Выполнение первого условия одновременно означает, что вариации в этих строках 2, 3, 4 должны рассматриваться как случайные, и поэтому их следует включить в остаточную вариацию, произведя также перерасчет значимости линейной регрессии (кстати, это относится и к вариациям в строках 5 и 6, если они окажутся незначимыми). |