ГФ11-1. Общие методы анализа редакционная коллегия государственной фармакопеи ссср
 Скачать 1.83 Mb.
|
|
Нитрометан (ч.) СH3NO2 М.м. 61,04 Прозрачная бесцветная жидкость со своеобразным запахом, напоминающим горький миндаль. Смешивается с 95% спиртом и эфиром, мало растворим в воде. Температура кипения 101 град. С. Плотность от 1,130 до 1,132. Показатель преломления от 1,382 до 1,383. При нагревании нитрометана выше 100 град. С под давлением, особенно в присутствии окисляющих веществ, следует соблюдать осторожность, так как иногда при этом происходит взрыв. Пиридин (ч.д.а.) С6Н5N М.м. 79,10 Бесцветная подвижная жидкость с характерным запахом, гигроскопична. Смешивается во всех соотношениях с водой, 95% спиртом, эфиром, хлороформом. Легко воспламеняется. Содержание пиридина 99,0%. Температура кипения от 114 до 116 град. С. Плотность от 0,982 до 0,985. Содержание воды не более 0,1%. Высушивание пиридина проводят следующим образом. К 1 л пиридина прибавляют 50 г сульфата натрия, предварительно высушенного при температуре от 100 до 110 град. С и охлаждавшегося в эксикаторе. После 10-минутного встряхивания и настаивания фильтруют в перегонную колбу и перегоняют. Сохраняют в склянках с притертыми пробками в защищенном от света месте. Ртути окисной ацетат (ч.д.а.) Нg(CH3COO)2 M.м. 318,68 Бесцветные кристаллы, легко растворимые в воде, растворимые в 95% спирте и уксусной кислоте. Ядовит. Содержание ртути окисной ацетата не менее 97,0%. Около 0,5 г препарата (точная навеска) растворяют в 50 мл воды, прибавляют 5 мл разведенной азотной кислоты и титруют раствором роданида аммония (0,1 моль/л) до перехода светло - зеленого окрашивания в желтоватое (индикатор - железоаммониевые квасцы). 1 мл раствора роданида аммония (0,1 моль/л) соответствует 0,01593 г Нg(СН3СОО)2. Остаток после прокаливания не более 0,02%. Хлоридов не более 0,013%, сульфатов не более 0,005%. Железа не более 0,001%. Ртути окисной ацетата раствор 5 г ацетата окисной ртути помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в теплой ледяной уксусной кислоте. После охлаждения объем раствора доводят ледяной уксусной кислотой до метки. Сохраняют в склянках оранжевого стекла в защищенном от света месте. Спирт метиловый, очищенный от карбонилсодержащих примесей 1 л метилового спирта нагревают три часа с 10 г 2,4-динитрофенилгидразина и 2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты с обратным холодильником на кипящей водяной бане. Затем метиловый спирт два раза перегоняют на колонке, собирая фракцию, кипящую при 64,5 град. С. Примечание. Проверка на отсутствие альдегидов: к 25 мл метилового спирта в колбе вместимостью 300 мл прибавляют 75 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, нагревают на водяной бане с обратным холодильником 24 ч, спирт отгоняют, разводят до 200 мл 2% раствором серной кислоты и оставляют на 24 ч. Не должны образовываться кристаллы. Тетраэтиламмоний - йодид (ч.) (C2H5)4 NI M.м. 257,16 Белые прозрачные кристаллы без запаха. Легко растворим в воде, трудно растворим в 95% спирте. Водные растворы имеют нейтральную реакцию. Температура разложения 250 град. С. Уксусная кислота ледяная (х.ч.) СН3СООН М.м. 60,05 Температура кипения от 118 до 119 град. С. Содержание уксусной кислоты не менее 99,8%. В коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой наливают 10 мл воды, прибавляют около 2 г (точная навеска) испытуемой уксусной кислоты и титруют раствором едкого натра (1 моль/л) до слабо - розового окрашивания (индикатор - фенолфталеин). 1 мл раствора едкого натра (1 моль/л) соответствует 0,06005 г СН3СООН. Нелетучий остаток не более 0,001%. Хлоридов не более 0,0002%. Сульфатов не более 0,0003%. Тяжелых металлов не более 0,0002%. Железа не более 0,0002%. 2 мл испытуемой кислоты (с точностью до 0,1 мл) помещают в колбу, прибавляют 10 мл воды и 0,1 мл раствора перманганата калия (0,1 моль/л). Розовое окрашивание должно сохраняться в течение 30 мин. Ледяная уксусная кислота, применяемая в качестве растворителя при неводном титровании, должна выдерживать следующее дополнительное испытание. 10 мл испытуемой кислоты (с точностью до 0,1 мл) помещают в колбу, прибавляют 10 мл концентрированной серной кислоты, смесь охлаждают до температуры 5 град. С, прибавляют 1 мл 5% раствора бихромата калия и перемешивают. Одновременно готовят контрольный раствор, для чего в колбу прибавляют 10 мл воды, 10 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл 5% раствора бихромата калия и перемешивают. Испытуемый и контрольный растворы оставляют на 30 мин. Затем к обоим растворам прибавляют по 50 мл воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры. По охлаждении к растворам прибавляют по 2 г йодида калия и выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия (0,1 моль/л) до обесцвечивания раствора. Разность между количеством тиосульфата натрия, пошедшего на титрование испытуемого и контрольного растворов, не должна быть более 0,4 мл. Уксусный ангидрид (ч.д.а.) (СН3СО)2О М.м. 102,09 Бесцветная прозрачная жидкость с резким запахом. В водных растворах быстро гидролизуется, образуя уксусную кислоту. Содержание уксусного ангидрида не менее 99,0%. Температура кипения от 138 до 141 град. С. Плотность от 1,0790 до 1,0820. Хлоридов не более 0,0001%. Сульфатов не более 0,0005%. Тяжелых металлов не более 0,0001%. Нелетучий остаток не более 0,002%. Хлорная кислота, 72% и 57% водные растворы (х.ч.) НСlО4 М.м. 100,46 Бесцветная или со слабым желтоватым оттенком прозрачная жидкость. Плотность около 1,7 и 1,5 соответственно. Хлоридов не более 0,0002%. Сульфатов не более 0,001%. Железа не более 0,00015%. Окислителей не более 0,00025%. Тяжелых металлов не более 0,001%. Около 2,5 г хлорной кислоты (точная навеска) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. 10 мл полученного раствора разбавляют 100 мл воды и титруют раствором едкого натра (0,1 моль/л) (индикатор - метиловый - оранжевый). 1 мл раствора едкого натра (0,1 моль/л) соответствует 0,01005 г хлорной кислоты. Сохраняют в склянках с притертыми пробками вдали от горючих веществ. Серебра окись (ч.) Аg2О М.м. 231,74 Коричнево - черный тяжелый порошок без запаха. Практически нерастворим в воде, легко растворим в разведенной азотной кислоте и концентрированном растворе аммиака. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ Электрофорез - метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза. При электрофорезе на носителях (твердая среда) на подвижность и эффективность разделения дополнительное влияние оказывают: адсорбция, неоднородность вещества носителя и его ионообменные свойства, электроосмос и капиллярный эффект. Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность измеряется в сантиметрах в секунду под влиянием градиента потенциала 1 В на 1 см и выражается в -1с - 1 кв. см х В . Относительная электрофоретическая подвижность есть отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт. Существуют два различных метода электрофореза: фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез - в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему: источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы "Реанал"), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). Примерная схема проведения электрофореза: - подготовка среды (носителя); - нанесение веществ, подлежащих разделению; - проведение электрофореза; - обнаружение и количественная оценка разделенных веществ. Фронтальный электрофорез Электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде в кювете, которая представляет собой разборный U-образный канал. В кювете создают четкую границу между исследуемой смесью веществ и буферным раствором. В процессе электрофореза первоначальная граница постепенно расходится на ряд границ по числу компонентов смеси. Метод является единственным способом прямого определения абсолютной электрофоретической подвижности. Его применяют для веществ с высокой молекулярной массой, которые обладают слабой диффузией. Зональный электрофорез Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических зон. В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет много вариантов. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СВОБОДНОЙ ЖИДКОСТИ Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и рН. Градиент рН достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или экспериментально подобранных смесей, которые при приложении электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих изоэлектрических точек (рI). В результате в колонке создается градиент рН от 1 до 11. При электрофоретическом разделении, например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до зоны, соответствующей его рI. Метод позволяет разделять вещества, различие в рI которых составляет до 0,02, а также определять их рI. В обоих методах полностью исключена адсорбция, что позволяет обнаруживать и количественно оценивать вещества во фракциях непосредственно после электрофореза. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КРУПНОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ В качестве крупнопористых носителей применяют фильтровальную бумагу, крахмал, целлюлозу, порошкообразную пластмассу, агар - агар, ацетилцеллюлозу, стеклянный порошок. Электрофорез в блоке. В качестве носителя используют крахмал, который формируют в виде блока, помещают на лоток, соединенный с двумя электродными сосудами, заполненными буферным раствором. Раствор исследуемого препарата замешивают на сухом крахмале и вносят в узкую поперечную траншею, сделанную в середине блока. После прекращения электрофореза блок разрезают на поперечные доли из каждой элюируют и количественно определяют исследуемое вещество. Метод применяется для разделения веществ с молекулярной массой выше 30 000, так как вещества с меньшей молекулярной массой проникают и адсорбируются внутри крахмальных зерен. Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспендированным в буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных веществ (что имеет место для большинства биологических материалов) наносят в колонку сверху, а положительно заряженных - снизу. Сбор фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного элюирования буферным раствором. Электрофорез на проточных установках. Кювета проточной установки представляет собой полую стенку, которую заполняют носителем. Электрическое поле накладывают в поперечном направлении. В кювете создают равномерный ток буферного раствора сверху вниз. Наверх кюветы в одно и то же место непрерывно подают тонкую струйку фракционируемого раствора. Под совместным влиянием электрического и гравитационного полей исходная смесь по мере спускания разделяется на расходящиеся веером компоненты. Со дна кюветы фракции собирают в серию пробирок. Вариант этого метода на бумаге известен под названием вертикального электрофореза. Электрофорез на бумаге. Вещество, подлежащее фракционированию, наносят на пропитанную проводящей жидкостью полоску фильтровальной бумаги на расстоянии не менее 1 см от края и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивают, помещают в камеру, концы погружают в кюветы с проводящей жидкостью. После пропитывания бумаги жидкостью к ее концам подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают в токе воздуха и оценивают результаты в соответствии с указаниями в статьях. Для электрофореза пригодны только лучшие сорта хроматографической бумаги, которые должны содержать не менее 96% альфа - целлюлозы. Бумагу предварительно подвергают хроматографической очистке подходящими растворителями. Вместо бумаги могут быть использованы полоски ацетатцеллюлозы. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА МЕЛКОПОРИСТЫХ НОСИТЕЛЯХ На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в зависимости от молекулярной массы и формы молекул. Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1-2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя или ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге. Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5-6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3-0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двухмерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта - простота исполнения, вертикального - большая разрешающая сила. Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель (ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента, чаще всего N, N1-метиленбисакриламида. Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем практически отстутствуют адсорбция и электроосмос. ПАГ готовят на буфере, в котором растворяют акриламид, сшивку и катализатор. Можно получить гель с концентрацией акриламида от 2 до 50%. Повышение концентрации геля понижает его пористость. Буферная система и состав геля определяются природой разделяемого вещества. Концентрацию (с) акриламида подбирают с учетом средней молекулярной массы (М. м.) фракционируемых веществ: М. м. с, % 3 < 10 х 10 > 30,0 3 10-30 х 10 15,0-30,0 3 30-100 х 10 7,5-15,0 3 > 100 х 10 < 7,5 Электрофорез выполняют в установках вертикального или горизонтального типа. В ходе электрофореза необходимо следить за тем, чтобы кювета не перегревалась во избежание возникновения конвекционных токов. Диск - электрофорез представляет собой разновидность электрофореза в ПАГ. Метод имеет высокую разрешающую способность благодаря использованию двух физических явлений: 1) эффекта концентрирования анализируемой смеси в узкой стартовой зоне (бесконечность 10"ми"), который обусловлен автоматическим выравниванием скоростей движения ионов на границе Кольрауша; 2) эффекта молекулярного сита, т.е. разделения вещества по величине молекулярной массы и по форме молекул. Диск - электрофорез обычно проводят в узких стеклянных трубках, содержащих два разнопористых геля. В ходе электрофореза в верхнем относительно более крупнопористом геле происходит концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом - ее разделение. Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах, которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах. Схема проведения опыта: стеклянные трубки последовательно заполняют смесью реактивов, из которых вначале полимеризуется мелкопористый, а затем - крупнопористый гель, после чего трубки соединяют с электродными камерами, которые заполняют буферным раствором так, чтобы в него погрузились верхний и нижний концы трубок. Сверху под буфер в трубки вносят исследуемый образец. После электрофореза гель извлекают из трубок, фиксируют и определяют исследуемые вещества. Изотахофорез представляет собой также разновидность электрофореза в ПАГ с использованием прерывистой буферной системы, в которой ведущий ион имеет высокую подвижность, а замыкающий - низкую, что обеспечивает высокую разрешающую способность метода. КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ЗОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза с реакцией преципитации. Сначала проводят электрофорез белков в тонком слое геля. После электрофореза в геле в направлении движения белков делают боковые углубления, которые заполняют соответствующей антисывороткой. Затем пластинки на 1-2 сут помещают во влажные камеры, где в результате диффузии антигены взаимодействуют с антителами и образуют изогнутые зоны преципитации. Метод позволяет выявлять индивидуальные белки. |