Главная страница
Навигация по странице:

  • Аллергологические методы

  • Просвечивающий электронный микроскоп (рис. 1-7)

  • Сканирующий электронный микроскоп

  • Нативные препараты Нативные препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наиболь­шее распространение получили метод висячей капли, микрокамеры с плотными сре­дами

  • Отбор материала.

  • Специальные методы окраски бактерий.

  • Питательные среды для культивирования бактерий

  • Универсальные источники

  • Элективные и селективные среды

  • Дифференциально-диагностические среды

  • Среды, содержащие белки

  • Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты.

  • ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ. Организация лабораторной


    Скачать 399.79 Kb.
    НазваниеОрганизация лабораторной
    Дата28.02.2021
    Размер399.79 Kb.
    Формат файлаdocx
    Имя файлаОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ.docx
    ТипДокументы
    #180299
    страница3 из 6
    1   2   3   4   5   6

    Выбор лабораторных исследований


    Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроско­пические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы.
    Микроскопические методы

    Микроскопические методы включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носит ориенти­ ровочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как мно­гие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудите­лей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.
    Микробиологические методы

    Микробиологические методы — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт нали­ чия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроор­ганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимичес­ких, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.

    Биологические методы

    Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследу­емом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содер­жании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуе­мым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена, либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболева­ния и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведе­ния биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внут­ривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У живот­ных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки раз­личных органон, СМЖ, экссудат из различных полостей.

    Серологические методы

    Серологические методы выявления специфических АТ и Аг возбудителя – важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможности. При этом необходимо выявить повышение титров АТ, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). АТ обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов lg чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

    Аллергологические методы

    Аг многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в дианостике таких заболеваний как сап, мелиодиоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту. Используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.
    МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

    Микроскопия материала

    Любое бактериологическое исследование начинается с микроскопии материала и его последующего посева на питательные среды. Эффективность выделения возбудителя в значительной степени обусловлена правильной техникой отбора образцов клинического материала, своевре­менностью их доставки в лабораторию и правильным хранением образцов.

    Электронная микроскопия

    Теоретически разрешение просвечивающего элек­тронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное, разрешение современных микроскопов приближает­ся к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.

    Просвечивающий электронный микроскоп

    (рис. 1-7состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны наблюдают на флюоресцирующем экране и регистриру­ют при помощи фотопластинки.

    Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изоб­ражения поверхности исследуемого объекта.

    Подготовка материала к микроскопии

    В бактериологической практике микроскопически исследуют неокрашенные образцы (нативный материал) и окрашенные препараты (мазки или мазки-отпечатки), приготовленные из кли­нического материала или колоний выросших микроорганизмов.

    Нативные препараты

    Нативные препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наиболь­шее распространение получили метод висячей капли, микрокамеры с плотными сре­дами и негативные методы исследования живых бактерий. Для прижизненного ис­следования также часто применяются исследование в тёмном поле и фазово-контрас тная микроскопия. Подобные приёмы часто используют для диагностики сифилиса и предварительной диагностики диарей, вызванных кампилобактерами, а также для определе­ния подвижности микроорганизмов.

    Окрашенные препараты

    Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

    Отбор материала. Тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу (рис. 1-8А); с их помощью также готовят мазки из непрозрачных жидкостей, например взвеси испражнений (рис. 1-8Б). Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенцией готовят растиранием их между двумя предметными стёклами (рис. 1-9). Прозрачные жидкости (например, мочу или СМЖ) можно нанести в виде капли на предметное стекло (рис. 1-10, А), при этом границы капли желательно обвести маркёром. Лучшие результаты даёт предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной па­лочки (рис. 1-10, Б).

    Фиксация. В практической бактериологии наиболее распро­странена термическая фиксация (над пламенем горелки) — метод грубый, но сохраняющий морфологию и отношение к кра­сителям у бактерий. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращаю­щие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие мак­ромолекулы путём химического их сшивания. Для светооптической микроскопии используют формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты и др. Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нано­ся фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

    Окрашивание. Стандартные красители, используемые для окраски бактерий, — карболовый фуксин Циля, фуксин Пфайф-фера и метиленовый синий по Лёффлеру. Для получения болееинформативных результатов в светооптической микроскопии используют специальные и дифференцирующие методы окраски.











    Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена (рис. 1-11).

    Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

    Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4 .

    Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата [обычно растворами таннина, KAl(SO4 )2 , HgCl2 ] и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

    Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

    Питательные среды для культивирования бактерий

    Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать



    -
    вещества, утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов.

    Универсальные источники азота и углерода — бел- ковые гидролизаты (содержат полный набор аминокис- лот), пептиды и пептоны. Универсальные источники
    витаминов и микроэлементов — экстракты белков жи-
    вотного или растительного происхождения и белковые гидролизаты.

    рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность
    бактерий сопровождается сдвигом рН в кислую или
    щелочную сторону, что требует внесения в среды раз-­
    личных буферных систем (обычно применяют фосфат­-
    ный буфер). Сбалансированные среды отличают высо­-
    кая буферность и стабильный оптимум рН. Важно так­
    же создание оптимальной концентрации О2 и СО2 . ;

    Классификации сред

    Среды классифицируют по консистенции, составу, про­исхождению, назначению и загрязнённости материала.

    По консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие.

    По составу выделяют белковые, безбелковые и ми­ неральные среды.

    По происхождению среды разделяют на искусствен­ные и естественные (природные).

    Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

















    Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворот­ка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

    По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортиров­ки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культиви­ рования (универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентифи­кации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

    По загрязнённости материала . Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контами­нации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селек­ тивные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации) среды.

    Характеристики сред

    Консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), гипертонический ра­створ, глицериновый консервант с LiCl2 , раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия (среда Бенгсанга-Эллиота).

    Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолятная среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания усло­вий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества — соли жёлчных кислот, тетратионат Na+ , теллурит К+ , антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, брилли­антовый зелёный и др.

    Элективные и селективные среды (например, среды Уйлсона-Блэра, Эндо, Плбскирева, Мак-Конки) предназначены для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры. Среды готовят с учётом биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Соответственно, выделяют кровяные и сывороточные среды (например, Лёффлера, Бордё-Жангу), яичные среды (например, Лёвенштайна-Йенсена) и др

    Дифференциально-диагностические среды (например, среды Хисса, Кларка) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липилы) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спир­ тами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды так­же часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андраде, бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить изме­нение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андраде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив Андраде и индикатор бром- тимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разде­ляют на четыре основные группы.

    Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатина, молоко и др.), применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространены мясопептонная желатина (МПЖ), свер­нувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

    Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты. Ферментативное расщепле­ние субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бром-тимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда Минкевича) и среды Хисса. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахари­ ды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).
    1   2   3   4   5   6


    написать администратору сайта