Сообщение по молекулярной медицине. Научное сообщение по молекулярке. Основы полимеразной цепной реакции. Компоненты реакционной смеси пцр
 Скачать 39.2 Kb.
|
|
Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Научное сообщение на тему: «Основы полимеразной цепной реакции. Компоненты реакционной смеси ПЦР». Дисциплина: молекулярная медицина Подготовила: Подчалимова Ольга Андреевна Институт клинической медицины им. Н.В. Склифосовского 2 курс, группа 01 г.Москва 23.11.2020 Содержание: ВВЕДЕНИЕ 1. Механизм полимеразной цепной реакции 1.1. Основные компоненты 1.2. Дополнительные компоненты 1.2.1. Положительный контроль 1.2.2. Отрицательный контроль 1.2.3. Внутренний контроль 1.2.4. Специальные контроли 1.3. Основные этапы ПЦР Заключение. Список использованной литературы. ВВЕДЕНИЕ Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации ДНК in vitro. С момента введения ПЦР в 1985 году она стала незаменимым методом для многих применений в научных исследованиях и клинических и судебных исследованиях. Здесь будут рассмотрены принцип и настройка ПЦР, а также методы анализа продуктов ПЦР. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментaльный метод молеку- лярной биологии, позволяющий добиться знaчительного увеличения малых концен- траций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) в биологическом мaте- риале (пробе). Стремительное развитие технологий высокопроизводительных генетических исследований дало возможность иначе взглянуть на подходы к получению информации о геноме человека. Молекулярно-генетические методы исследования, постоянно совершенствующиеся в последние десятилетия, значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболевaний. С каждым годом появляются новые методологические подходы, открывающие огромные перспективы успешного поиска генетических маркеров и факторов развития как моногенных, так и многофакторных заболеваний человекa. Несмотря на то, что методы данной группы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее результатов других aнaлизов. Медико-биологическое сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностики и начала лечения болезни до появления ее симптомов. Знание теоретических основ и владение данными технологиями необходимо для успешной профессионaльной деятельности специалиста в области генетики. Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно- биологических технологий. И. Мишер в 1869 году открыл ДНК, но биологическую функцию данного вещества на тот момент не выяснил. И лишь в 1944 году ученые О. Эвери, К. Маклеод и М. Маккарти, проведя ряд экспериментов по трансформации (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в нее мертвых болезнетворных бактерий) определили, что за осуществление этого процесса отвечают выделенные из пневмококков ДНК. Вплоть до 50-х годов XX века точное строение ДНК и способ передачи наследст- венной информaции оставались неизвестными, хотя и было доказано, что ДНК состо- ит из нескольких цепочек, состоящих из нуклеотидов. ДНК – полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков – нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фос- фатной группы. Связи между нуклеотидaми в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы (фосфодиэфирные связи). В подaвляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) мaкромолекулa ДНК состоит из двух цепей, ориентировaнных aзотистыми основaниями друг к другу. В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основaния одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин – только с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три-штрих) и 5' (пять-штрих). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путем присоединения новых нуклеотидов к свободному 3'-концу). Количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК были сформулированы в 1949-1951 гг. группой биохимика Э. Чаргаффа и получили название «правила Чaргaффa». Суть этих правил заключалась в следующем: 1) Количество аденина (А) равно количеству тимина (Т), а гуанина (Г) – цитозину (Ц): А = Т, Г = Ц. 2) Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А + Г = Т + Ц. Правила Чаргаффа наряду с данными рентгеноструктурного анализа сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году. В 1955 г. А. Корнберг открыл фермент ДНК-полимеразу, который в искусственных условиях катализирует реакцию достраивания участка искомой ДНК от затравки (праймера), которая комплементарно связана с цепью ДНК (матрицей). В качестве строительных блоков используются нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), поэтому для протекания данной реакции необходимо их наличие в растворе. В 1976 году Т. Брок и Х. Фриз впервые выделили из некоторой грамотрицательной палочковидной бактерии (Thermus aquaticus) Tag-полимеразу ( фермент, способный стабильно работать при повышенных температурах) , что дало возможность использования ПЦР в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот, ведь обнаруженная раннее ДНК-полимераза инактивируется в подобных условиях. К. Мюллис вместе с Ф. Фалуном разработали алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР. С момента своего внедрения в середине 80-х годов технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) была признана быстрым, чувствительным и специфичным молекулярным диагностическим инструментом для анализа микроорганизмов в клинических, экологических и пищевых образцах. Хотя этот метод может быть чрезвычайно эффективен с чистыми растворами нуклеиновых кислот, его чувствительность может быть резко снижена при непосредственном применении к биологическим образцам. Таким образом, репликация ДНК in vitro, главным образом с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет амплифицировать определенные последовательности ДНК. Экспоненциально усиливая целевую последовательность, ПЦР значительно повышает вероятность обнаружения целевых последовательностей генов в сложных смесях ДНК. Это также облегчает клонирование и секвенирование генов. Амплификация ДНК методом ПЦР и другими недавно разработанными методами применяется во многих областях биологических исследований, включая молекулярную биологию, биотехнологию и медицину, что позволяет проводить исследования, которые ранее были невозможны. Амплификация нуклеиновых кислот добавила новое и революционное измерение в молекулярную биологию. Имеют также большое значение принципы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее модификации: обратная транскрипция-ПЦР (от-ПЦР), вложенная ПЦР, полиморфизм длины рестрикционного фрагмента-ПЦР (РФЛП-ПЦР). Представлены различные методы обнаружения продуктов ПЦР, используемые в рутинной диагностике и исследованиях: методы электрофореза и хроматографии, иммуноферментные методы, гибридизация и секвенирование. Обсуждается применение ПЦР-реакции в диагностике инфекционных заболеваний (вирусных и бактериальных), генетических заболеваний и генотипирования в трансплантации, приводятся примеры коммерческих тестов на основе ПЦР-реакции и других методов молекулярной биологии, используемых в быстрой рутинной диагностике. Фенотипирование (картирование) амплификации сообщений-это чувствительный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на быстром определении фенотипа мРНК небольшого числа клеток. Выделенная мРНК подвергается обратной транскрипции (РТ) в ДНК, а затем фрагменты ДНК, соответствующие интересующим белкам или генам, специфически амплифицируются методом ПЦР. Этот метод, также называемый РТ-ПЦР, имеет широкое применение в биологии и медицине, и сравнение с биоанализами показывает, что картирование значительно экономит время и материал. Этот метод должен быть применим для анализа мРНК практически любого типа тканей или клеток. 1МЕХАНИЗМ ПОЛИМЕРАЗНОЙЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 1.1. Основные компоненты Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси (РС) ряда основных компонентов. 1) Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, выполняющие роль затравки для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы и играющие ключевую роль в образовании и накоплении продуктов реакции амплификации. Важно, чтобы праймеры отвечали ряду критериев: специфичность, не должны образовывать димеры и петли при отжиге на себя или друг с другом, область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. 2) Taq-полимераза – термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности. 3) Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), включающая (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) – строительный материал, используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. 4) Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Трис-HCl обеспечивает стабилизацию кислотности буфера в пределах 8,0-9,5, необходимой для поддержания стабильности и активности ДНК-полимеразы. Кофакторами являются ионы магния, входящие также в состав буфера обычно в концентрации 1,5 мМ. Более высокая концентрация магния говорит о низкой специфичности полимеразы с более высоким выходом конечного продукта, в то время как меньшая концентрация магния связана, наоборот, с повышенной специфичностью и пониженным выходом продукта. Стабилизируя отрицательные заряды фосфатных групп в скелете ДНК, ионы магния облегчают образование комплекса между праймерами и матрицами ДНК. KCl (ион K), являясь одним из компонентов Taq-полимеразы, способствует отжигу праймеров. Колониальная ПЦР является удобной альтернативой традиционному выделению плазмид и рестрикционному расщеплению для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных колоний. Однако перенос вставки из лигирующей смеси, приклеенной к колонии или агаровой пластине, приводит к значительному числу ложноположительных результатов. Чтобы избежать этого, был разработан простой однотрубный метод, включающий инкубацию нуклеазы перед ПЦР путем оптимизации буферной системы, которая обеспечивает последовательное действие нуклеазы и ПЦР-амплификацию. 5) Анализируемый образец – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую НК. 1.2. Дополнительные компоненты Одним из важнейших свойств полимеразной цепной реакции (ПЦР) является ее исключительная чувствительность. Однако высокая чувствительность ПЦР также делает ее склонной к ложноположительным результатам из-за, например, экзогенного загрязнения. Надлежащая лабораторная практика и специальные стратегии борьбы с загрязнением имеют важное значение для минимизации вероятности заражения. Некоторые из этих стратегий, например физическое разделение зон для обработки образцов и продуктов ПЦР, возможно, потребуется учитывать при создании лаборатории. В этой главе будут рассмотрены различные стратегии обнаружения, предотвращения и устранения ПЦР-контаминации. Исключительная чувствительность полимеразной цепной реакции означает, что загрязнение ДНК может разрушить весь эксперимент. Аккуратность и соблюдение строгого набора протоколов могут помочь избежать катастрофы. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) все чаще используется в качестве стандартного метода обнаружения и характеристики микроорганизмов и генетических маркеров в различных типах образцов. Однако этот метод подвержен воздействию ингибирующих веществ, которые могут присутствовать в анализируемом образце и которые могут повлиять на чувствительность анализа или даже привести к ложноотрицательным результатам. Ингибиторы ПЦР представляют собой разнообразную группу веществ с различными свойствами и механизмами действия. Некоторые из них преимущественно обнаруживаются в специфических типах образцов, что требует матрично-специфических протоколов подготовки нуклеиновых кислот перед ПЦР. Для удаления ингибиторов ПЦР были разработаны различные протоколы. Для удобства детекции и контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены дополнительные компоненты. 1.2.1. Положительный контроль Положительный контрольный образец (ПКО) представляет собой искусственно синтезированную олигонкулеотидную последовательность, строго соответствующую искомой. Соответственно, праймеры для ПКО и искомой мишени одинаковые, что позволяет удостовериться в работоспособности и сохранности компонентов РС, необ- ходимых для нормального прохождения ПЦР. 1.2.2. Отрицательный контроль Отрицательный контрольный образец (ОКО) включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата НК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемую ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов. 1.2.3. Внутренний контроль ВК – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, который имеет принципиально отличную от искомой олигонуклеотидную последовательность. Необходим для контроля хода амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью с целью исключения ошибочных результатов ПЦР в результате несоблюдения условий (например, не добавили какой-либо компонент или саму НК, несоблюдение температурного режима хранения наборов реагентов или отдельных их частей - размораживание и потеря активности ферментов, к тому же препарат НК может содержать примеси ингибиторов, которые заметно снижают эффективность ПЦР или приводят к полному её отсутсвию). Концентрация ВК в РС должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул НК. Наличие ампликонов ВК является свидетельством нормального прохождения реакции амплификации. Если ампликоны искомой НК отсутствуют, но не образовались также и ампликоны ВК, можно сделать вывод о технологических нарушениях либо о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей. 1.2.4. Специальные контроли 1) Маркеры длин фрагментов ДНК – фрагменты двухцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в гель-электрофорезе, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности. 2) Контроль фона используется для ПЦР с флуоресцентными методами детекции результатов. Фотохимический контроль полимеразной цепной реакции был достигнут путем включения в ДНК световых нуклеотидов. 3) Стандарт – произвольный фрагмент ДНК или РНК, ограниченный теми же праймерами, что и для искомой мишени. Известные концентрации стандарта соответствуют определенным значениям порогового цикла Ct. Стандарты и калибраторы наиболее часто используются при осуществлении количественного анализа методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. 4) Контроль взятия материала – ключевой момент в определении качества взятой для исследования пробы. 1.3. Основные этапы ПЦР Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами . Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (рис. 2): 1. Этап денатурации. Для расхождения цепей ДНК в результате разрушения водородных связей при 94 градусах в среднем достаточно 20-30 секунд. При очень низкой температуре отжигу праймеров может препятствовать неполностью денатурированная ДНК. В некоторых случаях до включения полимеразы в реакционную смесь (первый цикл) её предварительно прогревают в течение 2—5 минут с целью полной денатурации матрицы и праймеров - горячий старт, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции. Таким образом ДНК из двухнитевой формы переходит в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований противоположных цепей ДНК под воздействием высоких температур. 2. Этап отжига праймеров. Присоединение праймеров происходит только в присутствии искомого участка ДНК при температуре 58–70 градусов (зависит от нуклеотидного состава, но зачастую подбирается эмпирическим методом). Любые отклонения от необходимой для проведения реакции температуры влекут за собой нарушения данного этапа. Так, при завышенной температуре отжиг происходить не будет вовсе, в то время как при заниженной неспецифический отжиг резко увеличится. Например, при низкой температуре прймер гибридизуется без участия 3'-конца, а следовательно считывания происходить не будет. Праймер будет читаться с 3'- концевой области вне зависимости от специфического или нет отжигания, если имеет этой части гомологию к какому-то другому участку матрицы. Праймер-димеры образуются, если праймеры имеют одно или более комплементарных оснований на 3'-конце, так, что становится возможным комплементация между двумя 3'-концами двух праймеров. Целью горячей полимеразной цепной реакции (ПЦР) является оптимизация выхода желаемого амплифицированного продукта в ПЦР и одновременно подавление неспецифической амплификации и образования димеров праймеров. Это достигается путем удержания важного компонента ПЦР-ДНК-полимеразы или праймеров, например, - до тех пор, пока реакционная смесь не будет нагрета до температуры, препятствующей гибридизации праймеров друг с другом или с неспецифическими областями шаблона. Таким образом, присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени является основой второго этапа ПЦР. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегданаходится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцеп очечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). 3. Этап элонгации (синтеза). Данный этап синтеза начинается с присоединения дезоксинуклеотид-трифосфатов и достраивания ДНК под действием Taq-ДНК-полимеразы, активирующейся при температуре 72 градуса. За 20 секунд может быть синтезировано 500 пар нуклеотидов, за 40 – 1200. Температура осуществления данного этапа зависит от используемого фермента и размера получаемого фрагмента. Важно перед началом цикличного процесса провести денатурацию ДНК (разделение цепей), выступающей в качестве матрицы. Для этого температуру поднимают до 94 градусов и выдерживают её 4 минуты. Обычно для выявления целевой последовательности ДНК в геле с этидиумом бромидом достаточно не более 40 циклов амплификации, примерно 25-30 циклов. Накопление неспецифических продуктов пропорционально их увеличению. Приблизительно в количестве 100-1000 копий ДНК-матрица способна дать стабильный результат. Но чтобы произошла достройка всех необходимых участков после последнего цикла реакционную смесь инкубируют 5-15 минут при температуре 72 градуса. Значит, при оптиуме температуры применяемого фермента на третьем этапе синтез второй цепи ДНК происходит с максимальной эффекивностью. Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК с выходом около 78-97 процентов. Погрешность может быть меньше при наличии в пробе ингибиторов реакции. Следует отметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации, ограниченных на концах праймерами, активен только некоторое время. Это связано с накоплением продуктов ПЦР на последних циклах амплификации и называется эффектом плато. Скорость его возникновения зависит от степени утилизации субстратов, стабильности реагентов, количества ингибиторов, неспецифических продуктов или конкурирующих праймеров-димеров, концентрации специфического продукта и его неполной денатурации при высокой концентрации продуктов амплификации. Риск быстрого выхода на плато обратно пропорционален начальной концентрации ДНК-мишени. Существуют различные модификации ПЦР, которые используются в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудно амплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации, или как еще говорят при доамплификации, продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров, то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в первом раунде участка ДНК. В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, то есть одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК. На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить, что реакцию амплификации можно проводить не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементарные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase reaction in situ). До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 т.п.н. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 т.п.н. В частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со вставкой 8.5 т.п.н., равной целому геному вируса HIV 1 И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократно будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР, так как этот метод по праву стал один из основных в молекулярной диагностике наследственных болезней. Возможность очень точного и специфичного выбора участка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых молекул, их огромное количество облегчают молекулярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиолете в виде красной полосы после электрофоретического концентрирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом. Детекцию продуктов ПЦР-реакции проводят с помощью метода гель-электрофореза ДНК. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, ПЦР, являясь альтернативой клонированию, позволяет получить неограниченное количество интересующих ДНК-последовательностей. С помощью данного метода всего за несколько часов мы можем избирательно увеличить в количестве единственную молекулу ДНК до нескольких миллионов копий, что революционизировало как молекулярную диагностику, так и молекулярный анализ генетических болезней. Так как, ПЦР — ферментативная амплификация фрагмента ДНК, находящегося между двумя олигонуклеотидами, называемыми праймерами. Олигонуклеотидные праймеры фланкируют целевую последовательность таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности. Последовательность между праймерами затем используется ДНК-полимеразой как шаблон, синтезируются две новые нити ДНК, способные к тому же функционировать как матрица при синтезе новых копий ДНК. Но формирование новых последовательностей в ходе очередного цикла тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза возможно при условии наличия всех необходимых субстратов реакции. Важно отметить, что масштабные исследования в области медицины и биологии, прорыв в диагностике широкого спектра генетических и инфекционных заболеваний, онкопатологий были реализованы именно благодаря методу ПЦР. Полученная информация позволила сформировать совершенно новый персонифицированный подход к комплексному обследованию пациента и определить альтернативные варианты терапии с учетом особенностей его генотипа и популяционной принадлежности. Итак, несмотря на то, что с момента возникновения идеи многократного увеличения числа копий искомой молекулы ДНК прошло сравнительно немного времени, технология ПЦР совершила огромный рывок и стала неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики. Но развитие ПЦР на этом не остановилось, её механизмы продолжают изучать и модернизировать научные деятели со всего мира. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет проводить амплификацию фрагментов ДНК in vitro, начиная с крошечных количеств биологического образца и олигонуклеотидных праймеров, полученных на основе данных последовательностей. Поскольку метод является быстрым и легким, ПЦР перенесла ДНК-технологию в обычные лаборатории. Мы представляем обзор следующих применений ПЦР: 1) амплификация фрагментов генов как быстрая альтернатива клонированию. 2) модификация фрагментов ДНК. 3) чувствительное обнаружение патогенных микроорганизмов, при желании с последующим точным генотипированием. 4) анализ ДНК арахеологических образцов. 5) выявление мутаций, имеющих отношение к наследственным заболеваниям, злокачественным трансформациям или типированию тканей. 6) анализ генетических маркеров для судебно-медицинской экспертизы, для установления отцовства и для картирования наследственных признаков. 7) видоспецифическая амплификация сегментов ДНК между элементами с перемежающимися повторами. 8) изучение экспрессии генов. Список использованной литературы: 1.Зорина В.В.(сост.) «Основы полимеразной цепной реакции» Методическое пособие ДНК-технология, 2012г. 2.Козыбаев А, Набиева Ж.С.,Якинева М.А. «Полимеразная цепная реакция реального времени» Инновация в науке: №10(35) 2014г. 3.Оберемок В.В., Методические рекомендации к применению ПЦР-метода. |