лекции по микре. Первая. Общая микробиология. Глава место микроорганизмов среди других живых существ классификация и
 Скачать 1.22 Mb.
|
|
ГЛАВА 5. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках. Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов. Питательные среды Питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необходимые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные микроорганизмы растут на простых питательных средах, другие для своего размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, витаминов. В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для большинства бактерий благоприятной является питательная среда, содержащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоприятная для большей части патогенных бактерий - слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, грибы - при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрачными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов. По составу и происхождению питательные среды бывают естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие овощи. Искусственные питательные среды готовят по определенной прописи из продуктов с добавлением органических и неорганических соединений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях. По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С. Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в концентрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%. По целевому назначению питательные среды могут быть разделены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические. Обычные (простые) питательные среды применяют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА). Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка. Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка. Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других по их ферментативной активности (см. соответствующий раздел). Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия. Температура должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С. Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроорганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэ-робность среды. Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохимические и другие свойства микробов, необходимо получить чистую культуру. Обычно культурой микробов называют скопление их на питательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) роста или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чистая культура - это культура микробов одного вида, полученная из одной колонии. В лабораториях для различных исследований применяют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в определенное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения активности пенициллина. Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме: 1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии. Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии. 2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром. 3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным. Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных питательных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные колонии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кружевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми краями, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов». Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами. К физическим методам можно отнести: 1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом. 2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха. 3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара. Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов. Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов: 1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга); 2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера). Культивирование других микроорганизмов Культивирование микоплазм Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью - с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток. Культивирование риккетсий и хламидий Риккетсии и хламидий - облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных. Культивирование грибов Для культивирования грибов применяют плотные и жидкие питательные среды: чаще всего среду Сабуро, а также среды, содержащие пивное сусло. Грибы растут медленнее, чем бактерии, они образуют видимый рост в течение нескольких суток. Температура культивирования ниже, чем у бактерий - 22-30°С. Культивирование спирохет и простейших Среди спирохет наиболее легко выращивать лептоспиры, питательной средой для которых может служить вода с примесью сыворотки крови кролика. Боррелии и трепонемы культивируют в анаэробных условиях на более сложных питательных средах, содержащих сыворотку, кусочки тканей животных. Среди простейших культивируются на питательных средах дизентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, балантидии.Токсоплазмы культивируют в куриных эмбрионах и культурах тканей. Методы культивирования малярийных плазмодиев разрабатываются. Методы изучения ферментативной активности (биохимических свойств) В микробиологической практике изучение ферментативной активности используют для идентификации микроорганизмов, поскольку каждый микробный вид обладает определенным набором ферментов. Для определения протеолитической активности микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясо-пептонный бульон, и между горлышком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, пропитанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная ацетатом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусовая бумажка синеет. Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде - индикатор рН. Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашенными соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина - в черно-синий. Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, таких как сальмонеллы и палочки дизентерии, будут бесцветными. Среды Гисса (среды "пестрого ряда") готовятся на основе пептон-ной воды или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо один углевод или многоатомный спирт и индикатор. При росте на среде Гисса микроба, сбраживающего данный субстрат с образованием кислоты и газа, среда изменит цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырек газа в стеклянном поплавке. При сбраживании субстрата только до кислоты происходит лишь изменение цвета среды. Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого. Одна пробирка этой среды заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой. После стерилизации в расплавленном виде среду в пробирке скашивают так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании лактозы или сахарозы изменяется цвет всей среды, при сбраживании одной глюкозы изменяется цвет только столбика. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. При выделении микробами аммиака цвет среды не меняется. Образование сероводорода проявляется почернением в столоике агара Для экспресс-метода определения ферментативной активности бактерий применяются микротестсистемы и система индикаторная бумажная (СИБ) Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек Ячейки содержат высушенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густоты В контрольные ячейки наливают физ раствор Результат учитывают после 3 - 4-хчасовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора Системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерий представляет собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор В пробирки с физиологическим или буферным раствором вносят исследуемую культуру, затем помещают диски В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят Результат учитывают по изменению цвета индикатора Для определения сероводорода диск помещают на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный - на следующий день Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке Результат учитывается через минуту. ГЛАВА 6. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ Общая характеристика вирусов, морфология и структура вирионов Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии является русский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский, открывший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ) Вирусы настолько отличаются от микроорганизмов, что выделены в особое царство - царство Vira Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых существ 1) наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза белков, 2) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточного строения; 3) внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне. Внеклеточная форма вируса - вириои и вирус, находящийся внутри клетки хозяина - это две разные формы вируса. Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 нанометров. Нанометр - это 10-9 метра (рис. 6). Наиболее мелкие вирусы - вирусы полиомиелита - имеют вирион размером 17-25 им, средние - вирус гриппа - 80-120 нм, крупные - вирус оспы - 300-400 им. В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кислота - ДНК или РНК (однонитевая или двунитевая). Плюс-однонитевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, например у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, например, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК. Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белковые молекулы - капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa - коробка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уложены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда капсомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэдра). Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, составляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита. У вирионов сложноорга-низованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка - суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углеводы, липиды, компоненты клетки хозяина. Строение вириона лежит в основе классификации вирусов. По типу нуклеиновой кислоты их делят на: рибовирусы и дезоксири-бовирусы, далее по структуре вирионов, по месту размножения и по другим признакам проводится деление на семейства и роды. Вследствие малых размеров вирусы не видны в световом микроскопе. Только наиболее крупный из них - вирус оспы - можно наблюдать в виде мелких точечных образований - элементарных телец Пашена. Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы оспы, бешенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их можно обнаружить в световом или в люминесцентном микроскопе. Обнаружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Бабеша-Негри в нервных клетках обнаруживаются при бешенстве. Морфологию вирионов изучают в электронном микроскопе. Вирусы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную. Репродукция вирусов Вирусы не способны размножаться на питательных средах - это строгие внутриклеточные паразиты. Более того, в отличие от риккетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не размножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и белковые молекулы синтезируются в клетке хозяина раздельно, в разных частях клетки - в ядре и в цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному геному, его НК. Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз (рис.7): - Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувствительной к данному вирусу. - Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина путем виропексиса. - Третья фаза - «раздевание» вирионов, освобождение нуклеиновой кислоты вируса от суперкапсида и капсида. У ряда вирусов проникновение нуклеиновой кислоты в клетку происходит путем слияния оболочки вириона и клетки-хозяина. В этом случае вторая и третья фазы объединяются в одну. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совершается следующим образом. ДНК-содержащие (ДНК —> иРНК —>белок) 1. Репродукция происходит в ядрх: аденовирусы, герпес,папо-вавирусы. Используют ДНК-зависимую РНК - полимеразу клетки. 2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу. РНК-содержащие. 1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикор- на-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет. РНК —>белок 2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитиевые): грипп, корь, паротит, орто-, парамиксовирусы. (-)РНК —> иРНК —> белок (иРНК комплементарная (-)РНК) Этот процесс идет при участии специального вирусного фермента - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза ( в клетке такого фермента быть не может). 3. Ретровирусы (-)РНК -> ДНК —> иРНК —>белок (и РНК гомологична РНК) В этом случае процесс образования ДНК на базе (-)РНК возможен при участии фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) - Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирус-специфический белок. - Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды. - Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой. Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов. Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и "раздевания" вирусная нуклеиновая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется вместе с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Провирус несет дополнительную генетическую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства. Вирусы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, называются интегративными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги. Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфекционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, скрепи и другие. Методы культивирования вирусов Вирусы - строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток. Лабораторные животные: белые мыши (для вирусов гриппа, Коксаки), кролики (вирус бешенства). Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков заболевания и изменений органов животного. Куриные эмбрионы 5-19-дневной инкубации пригодны для культивирования большинства вирусов: Преимущества метода: стерильность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность получения вирусов в больших количествах, простота техники работы. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по характеру колоний вируса на хорион-аллантоисной оболочке. В аллантоисной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты. Культура клеток - это клетки из органа животного или человека, которые живут и размножаются вне организма в питательном растворе (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре клеток - один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Различают несколько типов культур. 1) первично-трипсинизированные, которые получают, обрабатывая трипсином исходную ткань, например, почки обезьян, или эмбриональную ткань человека. Культура клеток используется однократно. 2) перевиваемые культуры клеток способны размножаться при многократных посевах на свежие питательные среды. Они могут поддерживаться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет. Во многих лабораториях применяются перевиваемые культуры, полученные из раковой ткани человека: HeLa, ИЕр-2 и др. 3) полуперевиваемые культуры клеток - это, например, диплоидные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размножаться в течение 40-50 пассажей (пересевов), сохраняя исходный диплоидный набор хромосом. Обнаружение вирусов в культуре клеток. Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вызывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД проявляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании многоядерных клеток. ЦПД можно обнаружить по цветной пробе. Для этого используют клетки, помещенные в питательную среду с индикатором, например, метиловым красным. При размножении незараженных клеток образуются кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет на желтый. Если клетки заражены вирусом, происходит нарушение нормального метаболизма клеток, и цвет среды не меняется. Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить и по образованию внутриклеточных включений. Для подсчета количества вирионов используют метод бляшек. Клеточный монослой, покрытый тонким слоем агара, в плоском флаконе, заражают вирусом и по количеству бляшек или "стерильных пятен" подсчитывают количество вирионов. Считается, что одна бляшка образуется при размножении одного вириона. Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить также по реакции гемадсорбции. Это вариант реакции гемагглютинации. Эритроциты, внесенные в культуру клеток, адсорбируются на поверхности клеток, зараженных вирусом. Реакцию применяют, например, для обнаружения вируса гриппа. |