Биотехнология. План реферата Введение Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки Получение безвирусного посадочного материала Каллусогенез как основа создания клеточных

• Название: План реферата Введение Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки Получение безвирусного посадочного материала Каллусогенез как основа создания клеточных
• Анкор: Биотехнология.doc
• Дата: 15.12.2017
• Размер: 147.5 Kb.
• Имя файла: Биотехнология.doc
• Тип: Документы; #11510
• Категория: Биология. Ветеринария. Сельское хозяйство

План реферата

1. 
   Введение
   

2. Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки

3. Получение безвирусного посадочного материала

4. Каллусогенез как основа создания клеточных культур

5. Длительно выращиваемые культуры

6. Культивирование отдельных клеток

7. Биотехнологии на основе изолированных протопластов

8. Обзор литературы

Введение

Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы мани­пулировать клетками, нужно выделить их из растения и соз­дать такие условия, при которых они могли бы жить и размно­жаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получил название куль­туры изолированных тканей и приобрел особое значение в свя­зи с возможностью использования его в биотехнологии.

Биотехнология известна с давних времен, но как самостоя­тельная прикладная наука сформировалась в середине 70-х го­дов нашего столетия, когда человечество осознало необходи­мость первоочередного решения на принципиально новых осно­вах главнейших проблем современности — продовольственной, энергетической, ресурсной, загрязнения окружающей среды и др. Биотехнологические процессы базируются на использова­нии биосинтетического потенциала микроорганизмов, расти­тельных и животных клеток, тканей и органов, культивируемых на искусственных питательных средах. В настоящее время во многих странах мира развитию биотехнологии придается перво­степенное значение в силу ряда существенных преимуществ пе­ред другими видами технологий: биотехнологические процессы обладают низкой энергоемкостью, почти безотходны, экологиче­ски чистые. Вместе с тем, эти технологии предусматривают ис­пользование стандартного оборудования и препаратов, а также проведение исследований круглый год, независимо от климати­ческих условий, занимая при этом незначительные площади. Эти преимущества имеют непосредственное отношение к культуре клеток, тканей и органов растений.

Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехноло­гии следует рассматривать в трех направлениях. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуциро­вать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других от­раслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалои­ды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или жидкой (суспензион­ная культура) питательной среде. На основе клеточных техноло­гий получают такие медицинские препараты, как диосгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии змеиной, тони­зирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в меди­цине и парфюмерии. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно превышать продуктивность целых растений. Преимуществом такого способа получения веществ вторичного синтеза является также возмож­ность использовать для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год.

Второе направление — это использование культуры изоли­рованных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала от вирусов и других патогенов. Этот метод, назван­ный клональным микроразмножением растений, позволяет по­лучать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.

Третье направление — использование изолированных клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстрорасту­щие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факто­рам среды: засухе, засолению, низким и высоким температурам, фитопатогенам, тяжелым металлам и др. Вместе с тем, это на­правление предусматривает создание новых растений путем слияния изолированных протопластов и получения неполовых (со­матических) гибридов. Перенос в изолированные протопласты чу­жеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свой­ствами. Культивирование изолированных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах дает возможность получать гаплоиды, культивирование зародышей — прием, позволяющий получать растения из невсхожих (с плохо развитым эндоспермом) гибридных семян. А оплодотворение в пробирке позволяет пре­одолеть нескрещиваемость некоторых растений.

Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых растений. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их основе процессов.

Метод культуры тканей, клеток и изолированных протопластов возник более 50 лет назад. Первые успехи были достигнуты в 1907-1913 гг. Харрисоном и Каррелом по культивированию животных тканей, благодаря выращиванию их на питательных средах природного происхождения, таких как плазма крови и зародышевая жидкость. Попытки по аналогии вырастить изолированные ткани растения на растительных экстрактах были неудачны. Одной из причин всех предшествующих неудач являлось использование в экспериментах мало подходящих для проявления ростовой активности тканей и клеток высших растений. В 1922 г. американский исследователь Роббинс и независимо от него немецкий ученый Котте показали возможность культивирования на синтетической питательной среде меристемы кончиков корня томатов и кукурузы

В настоящее время известно более 150 видов растений, ткани которых удалось выращивать in vitro.

Разработаны составы ряда питательных сред, что позволило получать длительные пересадочные культуры из разных органов и тканей растений.

Среда Мурасиге и Скуга (MS) - наиболее универсальная и многоцелевая среда, пригодная для растительных клеток многих видов. Дает хорошие результаты при каллусообразовании большинства растений, хорошо поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинства двудольных видов.

Среда Гамборга и Эвелега (среда Б5) дает хорошие результаты при культивировании клеток и тканей бобовых растений.

Среда Уайта применяется для укоренения побегов и нормального роста стеблевой части после регенерации.

Среда Нич, Китайские среды рекомендуются для индукции андрогенеза в культуре пыльников и для индукции морфогенеза у злаков.

Среда Као и Михайлюка используется для культивирования единичных (или с малой плотностью высева) изолированных протопластов и клеток.

Изучено значение макро- и микроэлементов для поддержания ростовой активности каллусной ткани. Выявлена потребность тканевых культур в витаминах и стимуляторах роста.

Опытами Скуга и Миллера (1955) по изучению способности к делению и образованию каллуса клетками сердцевинной паренхимы стебля табака был открыт новый класс стимуляторов роста растений - цитокинины. Полученный в результате щелочного гидролиза ДНК животного происхождения кинетин (6-фурфуриламинопурин) оказался способным к комбинации с β-индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы, лишенной проводящих пучков и камбия. Клетки ткани сердцевинной паренхимы, помещенной на питательную среду с ИУК, но без добавления этого нового стимулятора, не делились.

В 1960 г. Кокингом был открыт метод получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектоли-тических и целлюлитических ферментов, выделенных из культуральной жидкости грибов. В 1971 г. были найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу. Изо­лированные протопласты, еще, не образовавшие клеточную стенку, были исполь­зованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слия­ния протопластов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) и введения в них вирус­ных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. Разработка методов электро­слияния изолированных протопластов Зиммерманом в 1984 г. и разнообразных методов селекции гибридных клеток значительно облегчила гибридизацию со­матических клеток растений.
Сохранение in vitro генофонда. Коллекции и банки

Технология сохранения в культуре in vitro генофонда, используемого в селекции, или в виде растущих коллекций (периодически субкультивируемых про­бирочных растений, оздоровленных методом культуры меристем) или в виде клеточных и меристемных коллекций, хранящихся после глубокого замораживания в криобанках, в жидком азоте (температура - 196°С). Цель коллекций и бан­ков - обеспечить селекционера в любое время генотипом, несущим искомые при­знаки, нужные для его работы.

Растущие коллекции видов и сортов, применяют для сохранения генофонда не только растений, размножающихся вегетативно, но и размножаемых семе­нами. Последнее важно для поддержания маркированных изогенных линий, ли­ний с ЦМС, гетерозисных гибридов, уникальных генотипов, свойства которых будут потеряны при половом размножении.

Периодическое субкультивирование трудоемко и удорожает технологию. Период без пересадок (субклонирования) можно удлинить до 6-24 месяцев, поместив коллекции в условия низких положительных температур (1-10°С) при ин­тенсивности освещения 4000-5000 лк. Выбор температуры определяется холодо­стойкостью вида растения. Так, для депонирования коллекций картофеля использовалась температура 10 °С, яблони – 1 °С. Рост растений можно также задержать добавлением к питательной среде осмотиков - маннита и сорбита, повышением концентрации сахарозы или внесением в питательную среду веществ, тормозящих рост. В качестве последних были использованы гидразид малеиновой кислоты, 2,2-метил-гидразид янтарной кислоты, абсцизовая кислота. В по­следнее время для замедления роста коллекций начали применять такие методы, как снижение атмосферного давления (до 0,04 мм рт. ст.) и гипоксия. Условия гипоксии создают, применяя смесь 90% азота и 10% кислорода. Иногда комби­нируют эти два фактора, снижая концентрацию кислорода и одновременно уменьшая атмосферное давление. В результате рост растений хризантем по чис­лу междоузлий снижался в 3 раза в сравнении с контролем за период выращива­ния 6 недель.

Дополнительное достоинство сохранения генотипов в виде коллекций in vitro - возможность разместить на 1м² площади в камере для культивирования более тысячи пробирок с растениями.

Криосохранение генофонда растительного материала в жидком азоте - бо­лее совершенный метод, в сравнении с описанным выше. Он гарантирует ста­бильное сохранение генетических характеристик объектов практически в течение любого срока. Его можно применять для сохранения генофонда более широ­кого диапазона объектов - от изолированных протопластов до зародышей и се­мян Хорошо организованная работа криобанка менее трудоемка, чем поддержа­ние и депонирование растущих коллекций. Метод позволяет сохранить без из­менений мутантные, гибридные, трансформированные, способные к морфогене­зу клетки разных видов растений, меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльцу, семена, в том числе не выносящие обезвожи­вания.

В настоящее время разработаны условия криосохранения более чем для 30 видов - с целью культивирования клеток, 10 видов - для каллусных культур, 8 видов - для изолированных протопластов, 13 видов - для сохранения меристем и кончиков стебля. Метод замораживания и хранения в жидком азоте меристем разработан для следующих растений: Arachis hypogea, Brassica napus, Cicer arietinum, Dianthus cariophyllus, Diqitalis lanata, Fragaria ananassa, Lycopersi-con esculentum, Mains domestica, Manihot esculenta, Pisum sativum, Solanum tuberosum, S.goniocalyx, S.chacoense.

В криобанке Института физиологии растений РАН наиболее старая из хранящихся клеток культура моркови находится в жидком азоте уже более 10 лет.

Наиболее проста техника Криосохранения пыльцы. Подсушенную пыльцу помещают в запечатанные пластмассовые ампулы, используемые при хранении, и прямо переносят в жидкий азот. Пыльца пяти испытанных сортов картофеля, размороженная после 1,2, и 3 лет хранения в жидком азоте, имела высокую жиз­неспособность, фертильность и была эффективно использована в скрещиваниях. Криобанк пыльцы делает возможным скрещивание сортов, различающихся по времени цветения, характеризующихся кратковременностью фазы сохранения пыльцой фертильности или вариабельностью ее свойств под влиянием неблаго­приятных условий.

Значительно более сложна технология Криосохранения культивируемых клеток, изолированных меристем, кончиков побегов, зародышей. Трудности свя­заны с необходимостью защитить замораживаемые клетки и ткани от соматиче­ского стресса и механического разрушения культур в результате образования и роста кристаллов льда, а также обеспечить жизнеспособность их при оттаивании и рекультивации.

Общие приемы технологии Криосохранения. Это применение криопротекторов и предобработка клеток перед замораживанием, соблюдение определенно­го режима замораживания в интервале от 0 до - 40 °С, специальные предосто­рожности при оттаивании и рекультивировании объектов.

Криопротекторы - это вещества, которые на этапе замораживания должны уменьшить повреждения клеток от осмотического и механического стресса. Их отбирают по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Это либо проникающие в клетки вещества - диметилсульфоксид (ДМСО) и глице­рин, либо непроникающие высокомолекулярные - поливинил пиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Концентрацию и время действия оптимизируют эмпи­рически в зависимости от объекта.

ДМСО - криопротектор, наиболее часто используемый в чистом виде или с добавлением других веществ, например, сахарозы, глицерина, применяют в концентрации 5-10%, глицерин в концентрации 10-20%. Помогает защитить клетки от стрессов замораживания также предобработка их осмотически актив­ными веществами - маннитом, пролином и некоторым другими аминокислотами, добавленными к питательной среде.

Большое значение для успеха Криосохранения имеет режим заморажива­ния на этапе от 0 до - 40 0С, который может быть медленными, со скоростью 0,5-1°С в минуту ли сверхбыстрым (непосредственное погружение в жидкий азот объекта размером до 0,5 мм). Замораживание в медленном режиме дает более успешные результаты. Программные замораживатели разработаны и произво­дятся в Институте криобиологии АН Украины. Оттаивание и восстановление часто является критическим этапом процесса.

Криобанки предоставляют возможность селекционерам широко использо­вать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов. Можно со­хранять без генетических изменений уникальные гибридные, мутантные и трансформированные линии. Криобанки могут сохранить пул генов исчезающих видов растений.
Получение безвирусного посадочного материала

Небольшой размер экспланта, применяемый для клонального микрораз­множения, поверхностная стерилизация его, асептический перенос на питатель­ную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводят к оздоровлению полученных растений от нематод, грибных и бактери­альных патогенов. Этого недостаточно доя оздоровления созданного клональным микроразмножением посадочного материала от вирусов, вироидов, микоплазм. Но именно вирусные болезни - причина потери от 10 до 50% урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативно. Выяснено, что соя и многие другие важные бобовые растения передают вирусы потомству и при семенном размножении, т.е. сорта постепенно отягощаются грузом вирус­ных инфекций.

Недавно была открыта возможность борьбы с вирусами томатов и огурцов в защищенном грунте с помощью вакцинации растений непатогенными вирус­ными штаммами, мутантами исходных патогенных.

Отечественные вакцинные штаммы S7 и V-69 защищают урожай многих сортов томатов, поражаемых ВТМ. Прибавка урожая для таких сортов составля­ет примерно 23%. Вакцинируемые поражаемые сорта томатов на 10-15% пре­вышают по урожаю устойчивые к ВТМ гибриды, полученные селекционным пу­тем. Особенно трудно перенести гены устойчивости к нескольким наиболее бо­лезнетворным вирусам. С помощью генной инженерии созданы растения табака и томатов, устойчивые к ВТМ и вирусу мозаики люцерны. Но о практическом использовании таких трансгенных растений говорить рано. Необходимо изуче­ние стабильности признака в онтогенезе и при передаче потомству. Пока же соз­дание безвирусного посадочного материала картофеля, винограда, плодовых, ягодных и других растений остается актуальной задачей клеточной биотехноло­гии. Наиболее эффективен способ культивирования меристем стебля или орга­нов стеблевого происхождения. Иногда этот метод культуры меристем допол­няют термотерапией.

Сейчас успешно выращивают растения из апикальной меристемы, состоящей из конуса нарастания и одного или двух листовых зачатков. Зона, сво­бодная от вирусных частиц, - различна для разных вирусов. Это зависит от вида и сорта растения. Так, при вычленении под бинокулярным микроскопом апикальной меристемы картофеля величиной 0,2 мм (конус нарастания апекса с од ним листовым зачатком) среди полученных растений только 10% были свободны от Х-вируса, но 70% - от Y-вируса картофеля. Можно использовать предельно малый размер экспланта (0,075-0,1 мм) или сочетать термотерапию и культуру меристем. Предварительная термотерапия исходных растений позволяет получать оздоровление от вирусов при использовании меристемных эксплантов размером 0,3-0,8 мм. Однако применение термотерапии в ряде случаев приводит к отставанию в росте и деформации органов меристемных растений. Этот прием может также увеличить латентные вирусные инфекции. Для оздоровления меристемных растений была использована химиотерапия. Получены хорошие результаты при внесении в питательную среду, до которой культивируют меристемы, аналога гуанозина - 1 β-Д-рибофуранозил--1,2,4-триазол-карбоксимида. Этот препарат, получивший коммерческое название «вирозол» (синтетический рибавирин), добавленный к питательней среде в концентрации 40-200 мМ, увеличил процент безвирусных меристемных растений до 80-100 % при 0-41% в контроле.

Использование иммуноферментной техники, особенно в ее микровариан­те, применение моноклональных антител, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК и ДНК вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объекта, позволяющий просто и 6ыстро детектировать присутствие патогенов в I капельке экстракта из растения, - все- эти, методы удовлетворят требованию к специфичности и чувствительности.. При этом может возрасти стоимость тестирования и цена оздоровленного растения.

Оздоровленные применением меристемной культуры растения размножают далее обычным методом клонального микроразмножения. Исключением является техника микропрививок, которую применяют для оздоровления цитрусовых растений, персика, иногда яблони. Для цитрусовых необходимость этой тех пики связана со слабым эффектом при использовании меристем маленького 1 размера. Более успешных результатов достигают при прививке меристемы лимонов и апельсинов размером 0,14-0,18 мм на пробирочные подвои, полученные 1 из семян. Можно получить 30-50% успешных прививок, 95% привитых растений сохраняется при высадке в почву. Развивающиеся побеги цитрусовых лишены ювенильных признаков, цветение и плодоношение их ускоряется. Из семи вирусов, распространенных у цитрусовых, для пяти оздоровление наблюдали на 1 уровне 100% привитых растений, для двух - на уровнях 80-98%.
Каллусогенез как основа создания клеточных культур

Важные для сельского хозяйства технологии in vitro разработаны с использованием объектов разной сложности организации, начиная с изолированных протопластов, и кончая изолированными завязями или зародышами. Однако культивируемые клетки играют при этом центральную роль, выступая либо не посредственным объектом генетических манипуляций, либо обязательным этапом создаваемых на основе других объектов технологий.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Реже культивируют клетки опухолей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток как при поверхностном, так и при глубинном вы­ращивании, мало отличаются внешне от культур каллусных клеток, даже на уровне морфологии клеток. Значительным физиологическим различием между ними служит гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им де­литься и расти на питательных средах без добавок стимуляторов роста. Опухо­левые клетки лишены также способности давать начало нормальным организованным структурам - корням или побегам в процессе органогенеза и эмбриоидам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых случаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), которые дальше не могут развиваться нормально. Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести способность к росту на среде без стимуляторов роста. Природа такой независимости к одному или обоим стимуляторам (ауксину и цитокинину), обычно применяемым при получении и выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих независимость клетки от экзогенных стимуляторов).

При генетической независимости каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак зависимости в ряду пре­вращений клетка—> растение—> клетка, что и является доказательством негенетической природы такой приобретенной независимости от присутствия в среде стимуляторов роста.

Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возни­кающей в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функцио­нирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, на­капливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей раз­ных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную пита­тельную среду в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержания пересадочной культуры требуют абсолютной асептики. Для этого с помощью различных стерилизующих растворов, содержащих чаще всего активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты.

После инкубации в стерилизующем растворе материал промывают в трех порциях стерилизованной воды, по 10 минут в каждой. Прописи стерилизации разных объектов даны в таблице 1. Стерилизуют в автоклаве или фильтровани­ем через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 0,15 мм рт. ст. в течение 60 мин или сухим паром в шкафах при температуре 160°С сте­рилизуют посуду, инструменты, материалы, необходимые для работы. Манипу­ляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облучаемых перед работой ультрафиолетом или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем.

Таблица 1

Стерилизация исходного растительного материала

Объекты	Время стерилизации, в минутах
	Диацид 0,1 %	Сулема 0,1 %	Гипохлориты Na, Ca, 5-9 %	Перекись водо­рода 10-12 %
Семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
Семена набух­шие	6-10	6-8	10-15	6-8
Ткани мясистого корня, клубни	20-30	15-25	15-20	-
Ткани стебля	20-40	20-25	20-25	-
Листья	1-3	0,5-3	3-6	3-5
Апексы	1-10	0,5-7	3-15	2-7

Особенности дедифференцировки клеток экспланта и каллусогенеза зави­сят от эпигенетических характеристик составляющих его тканей. Клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других специализи­рованных тканей, эксплантированных в питательную среду, содержащие мине­ральные соли, источники углерода, витамины и стимуляторы роста, должны дедифференцироваться, т.е. потерять структуры, характерные для их специфиче­ских функций в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки.

Часто эксплант используемый для получения каллуса, является фрагмен­том органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. На­пример, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия и сосудистой системы, сердце­винной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от раз­личий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать пре­имущественную пролиферацию клеток либо камбия и его молодых дериватов, либо коры, либо сердцевинной паренхимы.

Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, т.к. некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток переда­ются в ряду клеточных поколений как стойкие, эпигенетически наследуемые признаки. В клетках экспланта в самом начале культивирования могут наблю­даться изменения в метаболизме, связанные с травматическими синтезами, с де­дифференцировкой и подготовкой к процессу деления. Между этими процесса­ми может существовать причинно-следственная связь, механизм которой точно не известен.

Можно предположить, что травма приводит к высвобождению из клеток биологически активных веществ - индукторов или элиситоров клеточных делений, отличающихся по своей природе от стимуляторов роста растений (аук­синов, цитокининов, гиббереллинов). В роли элиситоров могут выступать про­дукты разрушения полисахаридов клеточной стенки. Их действием можно объ­яснить и быструю дедифференцировку специализированной клетки, приводящую к метаболизации веществ запаса, перестройке пластидного аппарата, уве­личению структур, связанных с синтезом белков.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ядерной ДНК, исчезают тканеспецифичные белки анти­гены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке.

Образование каллуса не во всех случаях связано с поверхностью эксплан­та. Каллус может образоваться в результате пролиферации внутренних тканей без связи с поверхностью среза. Развивающийся каллус разрывает слой ткани и обычно выходит на поверхность. Ярким примером образования каллуса, не свя­занного с травмой, служит каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолиро­ванного пыльника. Каллусогенез при эксплантировании фрагмента ткани в усло­виях in vitro свойственен не только покрытосеменным, но и голосеменным рас­тениям, папоротникам, мхам, печеночникам.

Первичный каллус, образовавшийся на эксплантах, через 4-6 недель (в за­висимости от темпов роста) переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Масса трансплантанта (переносимого кусочка) при культиви­ровании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг ткани на 20-40 мл питательной среды.

Техника культивирования тканей растений позволяет в настоящее время получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых тка­невых клеток интактного растения. Различно дифференцированные клетки (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу де дифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфиче­ские функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. В процес­се субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуаль­ными генетическими и физиологическими особенностями.
Длительно выращиваемые культуры

Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом либо на полутвердой агаризованной среде (концентрация агар-агара 0,6-1,0 %) или среде с применением других желирующих полимеров, либо на мостиках из фильтровальной бумаги или на дисках из пенополиуретана, полупогруженных в жидкую питательную среду.

Основные компоненты питательных сред для культуры тканей и клеток растений - минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки. Это мо­гут быть эндоспермы: кокосовых орехов в концентрации 7-20%, конского каш­тана - 5-15, а также березовый сок - 10-20, экстракты из органов вегетирующего растения - 0,1-1, томатный сок - 5-10. Солодовый экстракт - 5-10, дрожжевой экстракт - 0,1-0,2, гидролизат казеина - 0,02-0.1%, смесь аминокислот, дрожже­вой экстракт, экстракты из разных органов растений. Начиная работать с новым объектом, авторы модифицируют состав стандартных сред, особенно часто из­меняя концентрацию и набор органических компонентов. Оптимизацию состава среды целесообразно проводить с применением методов математического пла­нирования эксперимента.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным Способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы каллусной ткани может быть белым, желтоватым, зеленым, красноватым, бурым, пигментированным полностью или зонально присутствием хлорофилла и антоцианов.

В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные тка­ни бывают: 1) рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающимися на от­дельные клетки; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематиче­скими очагами; 3) плотными, с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном, трахеидоподобных элементов).

Обычно, в длительной пересадочной культуре на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина - 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рых­лыми.

В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и, наконец, деградируют.

На рисунке 1 представлен ростовой цикл популяции культивируемых клеток при поверхностном и глубинном периодическом выращивании. Субкультивирование рекомендуется проводить, используя трансплант или инокулюм из фаз замедления роста или ранней стационарной предыдущего цикла выращива­ния.

Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Ростовая кривая (модельная) имеет S-образную форму. На ней различают (рис. 1) латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулюма не наблюдается ни по одному из критериев (1); экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с ускорением (2); линейную, в которой скорость роста постоянна (3); фазу замедленного роста (4), стационарную фазу (5) и фазу деградации клеток (6). Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Это зависит как от генетиче­ской характеристики популяции (вида растения), так и от количества инокулюма и условий выращивания.

Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных продуктов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает макси­мума в стационарной фазе. Исключение составляет фаза биосинтеза некоторых алкалоидов, которая совпадает по времени с фазой максимальной митотической активности или экспоненциальным ростом Чаще механизм и условия, блоки­рующие клеточную пролиферацию и активный рост, являются одновременно механизмами активации ферментов вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синтезу вторичных продуктов и увеличить их выход.

Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто приме­няют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий мутантов, из них получают суспензии клеток, растущих в жидкой питательной среде. Как правило, для регенерации растений предпочитают также каллусные ткани.

Культуры клеток растений, вы­ращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензион­ными культурами.

Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агре­гаты (более 50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. Применяют различные аппараты и способы поддержания их в таком со­стоянии. Начальный момент получения суспензионной клеточной культуры является событием рандомическим. Это означает, что только клетки, кото­рые по ряду причин способны к перестройке метаболизма, и делятся с вы­соким коэффициентом в данных кон-Рис. 7. Модельная кривая роста в конкретных условиях суспензионного цикле периодического выращивания культивирования, образуют «хорошие линии». Оптимальные характеристики таких линий: высокая степень дезагре­гации (5-10 клеток в группе), морфоло­гическая выравненность клеток (не­большие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплаз­ма), отсутствие трахеидоподобных элементов.

Обычным способом получения клеточной суспензии является перенос каллусной ткани в жидкую питательную среду в колбу, которая затем помещает­ся на качалку, или в специальные сосудики, перемешивание суспензии в кото­рых производится с помощью роллеров разного типа. Инициация суспензионной культуры требует 2-3 г свежей массы каллусной ткани на 60-100 мл жидкой пи­тательной среды. Скорость перемешивания для получения первичной суспензии на круговой качалке - 100-120 об/мин. Суспензионную культуру можно полу­чить и прямо из фрагмента органа растения диски запасающей паренхимы мя­систых корней моркови, петрушки, клубней картофеля и др., однако такой путь более трудный и длительный. Клетки экспланта должны образовать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жид­кую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в сус­пензии.

Рыхлые обводненные культуры каллусных тканей более пригодны для пе­ревода в суспензию, чем структурированные, плотные каллусы. Выращивание каллусов на среде с 2,4-Д, исключение из среды ионов Са++ ,обработка пектина­зой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре, увеличивает шансы на успех. Первичную суспензию перед субкультивировани­ем фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных, плотных кусков каллусной ткани (или остатков эксплан­та) и очень крупных агрегатов.

Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и появление других стойких эпигенетических изменений, передающихся в. ряду клеточных поколений, адаптивный отбор, идущий в популяциях, приводят к возникновению из первичной каллусной тка­ни генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Получение сус­пензии, обогащенной отдельными клетками и их небольшими группами, облег­чает выделение линий, маркированных но определенным признакам, а также от­бор мутантов и вариантов на селективных средах.
Культивирование отдельных клеток

Источниками отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспен­зии, растущие в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений (напри­мер, мезофилла листа), изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки.

Культивирование отдельных клеток по­зволяет получать клоны и исследовать генетиче­скую и физиологическую стабильность или из­менчивость при выращивании клонового мате­риала. Для создания технологий важно изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у отдельных клеток, изолированных от влияния других клеток популяции и тканей.

Изолированные из тканей растения или протопласты культивируемых клеток после обра­зования клеточной стенки являются идеальными отдельными клетками.

Отдельные клетки могут быть изолирова­ны из суспензий с использованием микромани­пулятора, проточного цитофлюориметра с сортером или путем последовательных разбавле­ний. Для использования последнего метода сус­пензия готовится разными способами:

1). 1-2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток.

2). Суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся размером пор (нейлоновые сетки или металлические фильтры). Для после­довательных разбавлений используют платы для . микротитрований. Это позволяет микроскопиче­ски контролировать клеточный состав при по­следовательных разбавлениях. Индукция делений отдельных клеток из суспен­зии, изолированных протопластов, отдельных или высеянных при очень низкой плотности клеток, полученных методом последовательных разбавлений, воз­можна при использовании очень богатой питательной среды, например среды

Рис. 2. Использование «няньки» - культуры суспензионных клеток при выращивании изолированных протопластов и одиночных клеток кукурузы: 1 - фольга; 2 - колба Эрленмейера; 3 - колонии клеток; 4 - фильтровальная бумага; 5 - алюминиевая сетка; 6 - пенополиуретан; 7 - суспензия клеток
Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, дол­жен быть минимальным (микрокапли в чашке Купрака объемом 20 мкл). Даже и при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается низ­ким. Более эффективны методы использования ткани-«няньки» или «кормящего слоя».

Для создания «кормящего слоя» используют суспензию клеток того же вида растения, что и одиночная клетка, или близкого вида (рис. 2). Клеточная суспензия берется в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. Каллусная культура, служащая тканью-«нянькой», также должна быть в состоянии актив­ного роста. При достижении колонией, возникающей из отдельной клетки, вели­чины 0,5-1 мм клон может быть перенесен для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно или на фильтр, помещен­ный на поверхность агара. Использование «кормящего слоя», ткани-«няньки» и минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с феноменом, носящим название «действие фактора кондиционирования». Не­смотря на многочисленные попытки определить химическую природу веществ (или вещества), индуцирующих деление отдельной клетки, и раскрыть механизм действия фактора кондиционирования, ясности здесь пока нет. Уверенно можно сказать, что это фактор химической, а не физической природы, термостабилен, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами.

Биотехнологии на основе изолированных протопластов

Гибридизация соматических клеток растений путем слияния изолирован­ных протопластов - еще один из способов создания генетического разнообразия для селекции. Преимущество этого метода - возможность переноса искомых ге­нов на далекие таксономические расстояния. Это особенно важно тогда, когда половое скрещивание невозможно, а методы in vitro, помогающие преодолеть прогамную или постгамную несовместимость, не помогают.

Получение соматических гибридов стало возможным после разработки приемов слияния изолированных протопластов и культивирования их на пита­тельных средах, дополненных осмотическими стабилизаторами.

В процессе культивирования изолированные протопласты и продукты их слияния образуют новую клеточную стенку, осуществляют ряд последователь­ных делений и превращаются в колонии каллусных клеток. Перенос на среду для регенерации индуцирует образование зачатков стеблей или эмбриоидов и закан­чивается регенерацией растений. Этап получения изолированных протопластов, благодаря существованию большого набора ферментных препаратов пектолитического и целлюлолитического действия, а также препаратов, активно разру­шающих гемицеллюлозу, не представляет особой сложности.

При изолировании протопластов применяют следующие растворы фер­ментных препаратов:

1). Из мезофилла листа табака: целлюлаза - 2,5%, пектиназа - 0,25%, ман­нит - 0,4 М.

2). Из мезофилла листьев и суспензионных культур картофеля: ксиланаза -2%, маннит - 0,3-0,4%.

3). Из каллусных тканей пшеницы: целлюлаза 1- 2%, пектинааза - 0,3%, СаС12 - 0,25 М (осмотик).

4). Из гипокотилей рапса: целлюлаза - 0,5%, мацерозим - 0.05%, маннит -0,4 М.

Для подготовки листьев пробирочных растений к инкубации в растворе ферментов удаляют нижний эпидермис или разрезают их па полоски шириной 0,5-1 мм (желательно в растворе плазмолитика). Затем листья помещают на поверхность раствора ферментов и плазмолитика и инкубируют в растворе ферментов (время, температуру и рН буфера или среды подбирают эмпирически).

При использовании меристемных тканей при выделении протопластов, в небольшом числе происходит спонтанное слияние протопластов.

Для индуцированного слияния изолированных протопластов с целью гиб­ридизации соматических клеток используют следующие методы:

1). Добавление в среду инкубации изолированных протопластов ве­ществ, стимулирующих слияние. Например, добавляют нитраты (NaNO3), по­лиэтиленгликоль (ПЭГ), среду с высоким рН и высокой концентрацией ионов кальция.

2). Методика Као (1976).

- Пастеровской пипеткой суспензии протопластов (0,1 мл) переносят на покровное стекло, помещенное в чашку Петри (60 х 15 мм).

- Через 5 мин (после того, как протопласты осядут на дно капли), осторожно добавляют маленькими каплями 0,45 мл раствора полиэтиленгликоля в концентрации 40%.

- Инкубируют при комнатной температуре в течение 15-30 мин.

- Осторожно добавляют в течение 10 мин 0,5 мл питательной среды, в ко-] торой будут культивироваться протопласты.

- Промывают протопласты 5 раз добавлением свежей питательной среды с интервалом 5 минут между добавлениями. Перед добавлением свежей порции на покровном стекле оставляют тонкий слой старой среды, чтобы не подсушить] протопласты.

3). Слияние с помощью электрического тока.

Метод электрослияния изолированных протопластов основан на применении неоднородного электрического поля, создаваемого переменным током с напряжением 100 В и частотой 50 Гц в камере, куда помещают изолированные протопласты и вводят платиновые электроды. В этих условиях наблюдается диэлектрофорез, и протопласты выстраиваются в цепочку между электродами. Для слияния используют сильный импульс постоянного тока 1,2 кВ/см в течение 50 МКС.

Техника получения изолированных протопластов разработана для многих растений. Культивирование и получение на их основе проще удается для представителей семейства пасленовых, капустных, зонтичных, рутовых и некоторых других, труднее для злаков и бобовых. И здесь уже есть успехи: из протопластов риса, изолированных из каллусной ткани, возникшей из микроспоры, удалось получить колонии. В четырех из них наблюдали развитие корней и стеблевых зачатков, из которых один образовал проросток.

Получены зародыши и проростки в клеточной суспензии, возникшей из протопластов африканского проса. Исследователям фирмы Мицубиши в Японии удалось получить растение - соматический гибрид путем слияния протопластов риса и проса.

Гибридизация соматических клеток методом слияния протопластов, безсомнения, обогатила клеточную биологию. Появилась возможность изучать по ведение гибридных ядерных геномов при разной степени таксономической удаленности партнеров. Межродовая соматическая гибридизация между картофе лем (Solanum tuberosum) и томатом (Lycopersicon esculentum) позволила получить гибридные растения двух типов, которые авторы назвали «топато» и «помато» в зависимости от родовой характеристики хлоропластов гибрида. В пер­вом случае хлоропласта были томатные, во втором - картофельные. Эти расте­ния не обладали хозяйственно полезными свойствами, но позволили наблюдать проявление признаков партнеров и сочетание их на морфологическом и биохи­мическом (синтез алкалоидов) уровнях.

Анализ перспектив отдаленной соматической гибридизации, результатом которой является получение растений с гибридным ядерным геномом для прак­тической селекции далеко не так оптимистичен. Удалось получить только меж­видовые, а не отдаленные гибриды.

При межвидовой соматической гибридизации могут возникнуть как сте­рильные, так и фертильные растения. В последнем случае есть возможность по­лучить потомство от самоопыления или обратного скрещивания с культурными сортами. Последнее важно, так как часто у гибридов (например, между сортами картофеля и дикими видами) преобладают признаки диких видов.

Принципиальное отличие соматических гибридов, полученных методом слияния протопластов, от гибридов, полученных половым путем, состоит в том, что в большинстве случаев при половом скрещивании цитоплазматические гены передаются только материнским путем, при соматической гибридизации - от обоих родителей.

Сегрегация ядер соматических гибридов, слияние изолированного прото­пласта с цитопластом, лишенным ядра, слияние протопласта-реципиента с энуклеированным протопластом или протопластом, ядро которого инактивировано облучением и не способно к делению, приводит к получению так называемых цибридов. Цибридизация - способ введения важных цитоплазматических генов, несущих такие признаки, как ЦМС, устойчивость к некоторым гербицидам и па­тогенам, в изолированный протопласт растения с интересующим селекционера генотипом.

В литературе есть сведения о переносе этим способом гена устойчивости к гербециду триазину, кодирующего синтез белка мембраны хлоропластов с моле­кулярной массой 32 000 Д, от устойчивого растения паслена черного картофелю. Может представлять интерес использование цибридизации для переноса гена ус­тойчивости к тентотоксину (Alternaria solanii) от табака картофелю, а также других цитоплазматических генов, определяющих устойчивость. При переносах цитоплазматических генов, кроме метода слияния изолированных протопласта-реципиента с цитопластом или протопластом с инактивированным ядром, можно использовать и другие методы введения их: микроинъекцию и перенос с помощью липосом.

Методы и условия манипуляций с клеткой, которые можно назвать собст­венно клеточной инженерией растений, еще только разрабатываются биотехно­логами, последствия их в большинстве случаев не изучены.

Медленный рост (время удвоения числа клеток 1-3 дня), длительный пе­риод выращивания (2-3 недели) в строго асептических условиях, чувствитель­ность к механическим повреждениям, во многих случаях низкое содержание ис­комого продукта являются недостатками метода культивирования каллусных культур, ограничивающими его применение в промышленности.
Обзор литературы