|
|
Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки
Распределение между клетками
в процессе деления.
Система распределения существует независимо от генетических структур, контролирующих репликацию. Ее существование подтверждается идентификацией плазмидных мутаций в виде делеций района par, которые прекращают распределение плазмид между дочерними клетками, но не влияют на количество их копий в родительской клетке, т.е. не влияют на копийность.
Как показывают исследования, район par минирепликона плазмиды F имеет длину порядка 3000 нуклеотидов и содержит 2 кодирующие последовательности parA и parB, а так же parC, детерминирующий синтез плазмидной центромеры. Сходная
структура характерна для многих плазмид. Последовательности parA и parB кодируют белки, обладающие саморегуляцией на стадии транскрипции (так как их сверхпродукция привела бы к блокированию распределения). По одной из теорий предполагается, что после репликации плазмиды белки par связываются с сайтами распределения плазмид, в результате чего образуются комплексы узнавания. Последние формируют специфические димеры, которые связываются с одним из клеточных сайтов. Когда клетки делятся, то делятся и димеры, в результате чего, плазмидные копии поступают в новую генерацию клеток.
Генетическая регуляция.
Внешнее проявление поддержания плазмид в клетках заключается в том, что большинство или все клетки плазмидосодержащей популяции содержат плазмиды. В случае F, RI и RK2 установлено, что они кодируют летальность клеток, потерявших плазмиду, т.к. продукты соответствующих плазмидных убивают клетки, потерявшие их.
Некоторые плазмиды поддерживаются в клетках в количестве 1 – 3 копий на клетку. Они нуждаются для репликации в ДНК-полимеразеIII и их репликация проходит под строгим контролем клетки. Другие – в количестве 40–50 копий и используют ДНК-полимеразу I.
Их репликация проходит под релаксированным контролем. При делении клетки, дочерние получают не менее 1 копии плазмиды. Так как считалось, что они реплицируются на определенной стадии репликации ДНК бактерии, то, вероятно, существуют контрольные механизмы. Было предположено, что плазмиды сами регулируют свою репликацию и распределение, причем система репликации реализуется путем осуществления двух функций, одна и которых определяет среднее количество копий на клетку, а другая отзывается на изменение количества и восстанавливает его до нормы.
Еще в 60-е гг. была предложена гипотеза позитивного контроля. Предполагалось, что плазмида F несет 2 генных локуса, контролирующих процесс. Репликаторный локус (оператор репликации, репликатор) и структурный ген для синтеза диффузабельной субстанции – позитивного инициатора (эффектора) репликации. Контроль синтеза инициатора модулирует частоту инициации. Для объяснения стойкого наследования клетками плазмиды F в рамках этой модели было предположено так же, что она прикрепляется к тому сайту на клеточной мембране, к которому прикрепляется хромосома. В процессе каждого деления клетки происходит удвоение и мембранного сайта, и хромосомы и плазмидной ДНК. Оба образовавшихся комплекса расходятся в дочерние клетки.
В интегрированном в хромосому клетки хозяина состоянии, плазмида теряет самостоятельность репликации, которая теперь происходит вместе с хромосомой хозяина.
В 60-е гг. была выдвинута так же гипотеза негативного контроля. В соответствии с этой теорией было предположено существование негативно действую-щего стойкого ингибитора инициации репликации. Ингибитор кодируется геном, транскрибируемом немедленно после инициации репликации и каждое инициаторное событие сопровождается продукцией ингибитора в количестве, достаточном для подавления любой последующей инициации до момента, когда концентрация ингибитора уменьшится вдвое в связи с делением клетки.
В случае плазмиды colE1, установлено, что ингибитор – нестойкие нетранслируемые молекулы РНКI, которые негативно контролируют образование гибридов РНК-прозатравка – ДНК, т.к. связывается с молекулами прозатравки. В норме молекула РНК-прозатравки соединяется с ее ДНК-шаблоном в районе O-пункта, далее РНК-аза «плавит» прозатравку, давая начало РНК-затравке, на которую потом добавляется дезоксирибонуклотиды. Комплекс же РНКI-РНК-прозатрав-ка выключается из процесса.
Определенное влияние оказывает клетка хозяина. Многие плазмиды для репликации нуждаются в бактериальных ДНК-полимеразах. Репликация плазмиды pRSF2124 нуждается в бактериальных эндонуклеазах, контролируемых генами бактериальной хромосомы.
На количество копий плазмид оказывают влияние вид бактерий, хромосомные гены, культивирование бактерий. Например копийность плазмид pER2 в E.coli выше нежели чем в коринобактериях.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что и в контроле распределения участвуют гены хромосомы хозяина.
Конъюгационный перенос.
Процесс контролируется опероном tra. В общем виде он представляет из себя:
образование конъюгационных пар.
установление специфичных клеточных контактов.
Перенос начинается с сайта oriT. Перенесенная ДНК может стойко поддерживаться в трансконъюгантах в автономном состоянии либо включаться в хромосомный репликон хозяина посредством рекомбинации.
Долгое время считалось, что конъюгация – исключительно свойство Enterobacteriaceae, однако в последние годы показана ее возможность и у других микроорганизмов. У Enterobacteriaceae и Pseudomonada-ceae конъюгационный перенос обеспечивается тем, что плазмиды контролируют синтез секс-пилей для контактов. У грамположительных бактерий не обнаружены, у некоторых из них контакты между клетками обеспечиваются транспозонами (Streptococcus), фагами (staphylococcus) или экстрахромосомными ферромонами (Enterococcus).
При формировании клеточных контактов наряду с парами образуются агрегаты, в которых насчитывают до 13 скрещивающихся клеток. Эффективность спаривания не зависит от размеров агрегатов. Большинство скрещиваемых клеток способно формировать агрегаты в течение 30 минут, что, как предполагают, - результат роста и деления клеток, установивших контакты.
Способность спариваться клеток-доноров с клетками-реципиентами определяется наличием F-пилей у доноров. Тонкий механизм участия пилей в формировании клеточных контактов не выяснен до конца. Одно из объяснений его заключается в том, что последние – структуры, объединяющие конъюгирующие клетки и представляющие из себя трубки, через которые перемещается плазмида в реципиентную клетку. Другое предположение состоит в том, что, после столкновения двух соответствующих микроорганизмов и установления между ними начального контакта, пили действуют как в качестве крючков, взаимодействуя концом с поверхностью клетки реципиента. После дотрагивания пиля втягивается назад в донорскую клетку, чем обеспечивает контакт между клетками по типу «стенка к стенке». Затем формируется конъюгационная трубка.
Что бы быть компетентной в конъюгации, клетки-реципиенты должны обладать рядом свойств:
Клеточная стенка должна иметь специфические рецепторы.
Клеточная стенка должна пропускать одноцепочечную плазмидную ДНК.
Внешние факторы оказывают большое влияние на конъюгацию бактериальных клеток (состав питатель-ной среды, температура, время культивирования, изменение pH среды: снижение pH от 7.2 до 6.2 ведет к удвоению частоты спариваний).
Плазмидный перенос состоит из ряда стадий:
Инициация ДНК плазмиды.
Разделение цепей переносимой ДНК в клетке доноре. Для этого необходима насечка «надсечка» и раскручивание макромолекулы, что обеспечивается эндонуклеазами клетки – никазами.
Перенос цепи. Он осуществляется в направлении от 5’ к 3’-концу, т.е. 3’-конец – ведущий. Перенос длится 15 – 20 минут.
Конъюгативный синтез в клетке доноре
Репликонация ДНК плазмиды в клетке-реципиете. Репликонация – конвертирование одноцепочечной ДНК плазмиды в двухцепочечную.
Репликонация осуществляется в виде 2-х процессов: синтеза комплиментарной цепи и кольцевания плазмиды. Изучение плазмид F и сol показало необходимость для конъюгационного синтеза в клетках реципиентах ДНК-полимеразы III (для синтеза цепи). ДНК-полимеразе для работы необходима затравка, которую обеспечивает либо РНК-полимераза, либо РНК-примаза.
ДНК плазмид прикрепляется ко внутренней мембране в реципиентных клетках, где она приобретает кольцевую форму после синтеза второй цепи.
Мобилизация – процесс, основу которого составляют метаболические реакции, обеспечивающие подготовку плазмиды к переносу. Мобилизация присуща как конъюгативным, так и неконъюгативным плазмидам. Конъюгативные плазмиды могут мобилизовать на перенос неконъюгативные плазмиды. Это применяется при скрещивание даже очень отдаленным видам. Еще в старых работах было показано, что мобилизация на перенос неконъюгативных плазмид резистентности конъюгативными плазмидами обычно дает трансконъюганты, в которых обе плазмиды сосуществуют физически неизменными, не ассоциированными. Однако в процессе мобилизации могут формироваться и стойкие коинтеграты. Например, исследования мобилизации конъгативных плазмид pRQ1 на перенос неконъюгативных плазмид pRQ2 в клетках S. typhimurium, показало, что она сопровождается формированием коинтеграта плазмид pRQ6. Коинтегративный характер последних был подтвержден тем, что эта плазмида имеет резистентности обеих исходных, ее перенос термозависим, как pRQ1, и она несовместима с обеими исходными.
Существуют плазмиды, которые проявляют конъюгативные свойства лишь в присутствии реципиентных клеток, синтезирующих секс-ферромоны – низкомолекулярные полипептиды. Такие плазмиды установлены в клетках некоторых штаммов E. Faecalis. Они детерминируют лекарственную резистентность, гемолизины, бактериоцины и др. Ответ донорских клеток на ферромоны - через 20-30 минут. Он заключается в синтезе белковой фибриллярной иммунологически активной субстанции – адгезина – на поверхности клеток, что обеспечивает формирование агрегатов бактерий. Разным плазмидам соответствуют разные ферромоны.
Механизмами, ограничивающими перенос, являются поверхностное исключение, которое снижает вероятность переноса 100-300 раз и детерминируется плазмидными генами traS traT и неэффективность пилей. Кроме того, существуют ограничения, действующие после проникновения плазмид в клетки, так в результате изменения экспрессии плазмидных генов, клетки иногда не получают донорских свойств, плазмиды могут разрушаться рестриктазами, кодируемыми внутриклеточ-ным генетическим материалом (предполагают, что конъюгативные хромосомы с широким диапазоном переноса обладают генами с антирестрикционными функциями. Важными механизмом является летальный зигозис.
Свойства бактерий, контролируемые плазмидами.
Плазмиды лекарственной резистентности.
Общая характеристика и механизмы действия.
По данным японских исследователей, первый случай выделения бактерий, устойчивых к нескольким лекарственным веществам с различными механизмами действия, был отмечен в 1955 г. в клинике при обследовании женщины, больной дизентерией. От нее была выделена шигелла, устойчивая к действию сульфамидов, стрептомицина, хлорамфеникола и тетрациклина. Вскоре после этого в 1956 г. было выделено большое количество дизентерийных штаммов, обладавших резистентностью к тем же четырем лекарственным веществам, причем во многих случаях лечение проводилось лишь одним из них. Вслед за японскими работами появились сообщения о множественной резистентности, выявленной у других представителей семейства энтеробактерий и стафилококков. Японские ученые доказали возможность передачи всего комплекса устойчивости от его носителей к чувствительным бактериям. Для обозначения комплекса генетических детерминантов множественной лекарственной устойчивости японские исследователи предложили символ R.
R-плазмиды детерминируют резистентность бактерий к лекарственным веществам – главным образом антибио-тикам и сульфаниламидам. В широком плане к плазмидам резистентности относят плазмиды, кодирующие резистентность бактерий к бактериофагам, бактерио-цинам, сыворотке, ионизирующему излучению, тяжелым металлам и др. Наиболее полно изучены R-плазмиды грамотрицательных бактерий. Большинство из них конъюгативные, а R-плазмиды грамположительных – неконъюгативные.
Большинство генов устойчивости транспозонного происхождения. Их отличительная особенность в том, что они включаются в определенных местах. Такие последовательности именуются интегронами, а их носителями являются обычно транспозоны.
ДНК R-плазмид представлена в виде ковалентно закрытых кольцевых молекул, предположительно в суперспирализированной форме.
Молекулярная масса, копийность
и другие свойства некоторых R-плазмид.
Плазмида
|
Молек. масса
|
Организм
|
Копийность
|
R1
|
65
|
E. coli
|
1
|
R6
|
65
|
E. coli
|
1
|
R6K
|
26
|
P. mirabilis
|
13 - 38
|
R100
|
75
|
P. mirabilis
|
13 - 38
|
RR4
|
40
|
P. mirabilis
|
1 – 3
|
SuSm
|
5 - 6
|
E. coli
|
5,8 - 8
|
PSC101
|
5,6
|
E. coli
|
6
|
RSF1030
|
8,3
|
E. coli
|
6
|
RSF2124
|
7,4
|
E. coli
|
10
|
Резистентность бактерий, содержащих R-плазмиды, обычно зависит, от вида бактерий и типа антибиотиков. Например, клетки E. coli в большинстве устойчивы к стрептомицину при его концентрации в среде 10 - 25 мкг/мл, тогда как шигеллы – при концентрации 10000 мкг/мл, сальмонеллы резистентны к тетрациклину при концентрации 10 мкг/мл, тогда как шигеллы – при концентрации 100 – 250 мкг/мл.
Для плазмидных детерминантов резистентности часто характерно повышенная экспрессивность. Повышение копийности плазмид в результате мутаций генов репликации сопровождается значительным повышением уровня резистентности и подчиняется закономерности «доза-эффект». Повышении экспрессии плазмидных детерминантов лекарственной устойчивости может происходить также и посредством других механизмов: амплификация, приобретение множественных копий транспозонов, повышение интенсивности транскрипции генов.
При смешанном культивировании бактерий различной видовой принадлежности возможен межродовой перенос некоторых плазмид. Например, S. typhimurium V. cholerae, S. marcescens Y. pestis, P. aeruginosa E. coli.
В результате систематического мониторинга лекарственной резистентности кишечных бактерий разных видов, предпринятого в 60-х гг. в Японии, были получены результаты, свидетельствующие, что клетки
58% штаммов, устойчивых к тетрациклину, канамицину, стрептомицину, сульфаниламидам, содержат плазмиды. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что и конъюгативные и неконъюгативные R-плазмиды, детерминирующие резистентность к антибиоти-кам и сульфаниламидам, присутствуют в бактериях многих видов, в разных зонах мира.
Лекарственная резистентность энтеропатогенных штаммов E. coli, выделенных в Англии в 1980-81 гг.
Лекарственные вещества
|
Концентрация мд/л
|
К-во резистентных штаммов (%)
|
Пенициллин
|
8
|
37,1
|
Хлорамфеникол
|
8
|
12,5
|
Фурозолидол
|
20
|
0,4
|
Гентамицин
|
4
|
0
|
Налидиксовая к-та
|
20
|
0
|
Неомицин
|
8
|
9,1
|
Стрептомицин
|
16
|
45,7
|
Сульфонамиды
|
100
|
45,7
|
Тетрациклин
|
0,5
|
6
| |
|
|
Скачать 0.52 Mb.