Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки
 Скачать 0.52 Mb.
|
|
Всего 232 штамма, из них 134 – с резистентностью, а 65 – с трансферрабельной резистентностью. Исследование 24 энтеропатогенных штамма E. coli, выделенных от больных людей и домашних животных в 70-е гг. в СССР показало, что 16 из них являются резистентными к 1 или более антибиотиков, чаще всего к стрептомицину, тетрациклину, канамицину. В клетках 9 штаммов были конъюгативные плазмиды. Возрастание частоты резистентности и встречаемости в резистентных штаммах R-плазмид происходит по мере использования антибиотиков и др. Значительный рост резистентности, обусловленный плазмидами, отмечается у стрептококков, причем частота зависит от антибиотика. Например, большинство выделенных в Японии S. pyogenes резистентны к 1 - 2 антибиотикам, более 50% штаммов резистентны одновременно к тетрациклину, эритромицину и хлорамфениколу. Резистентность к тетрациклину особенно часто встречается среди стрептококков этого вида, групп B, D. Для многих штаммов S. pneumonie показана множественная лекарственная резистентность. Возрастание частоты резистентности четко видно на стафилококках (S. aureus) – частых возбудителей внутригоспитальных инфекций. После открытия пенициллина, период эффективной пенициллинотерапии был очень коротким, т.к. уже к 1946 г. госпитальные штаммы были на 50% резистентны к нему. В начале 60-х гг. были введены в практику метециллин и оксациллин, бывшие достаточно эффективными до конца 60-х гг. Начиная с 50-х гг., начиная с США, стали выделять штаммы одновременно резистентные и к пенициллину, и к стрептомицину, хлорамфениколу и эритромицину. Неомицин-резистентные штаммы стафилококков появились в 1959-60 гг., а через 10 лет развилась резистентность к родственным антибиотикам: канамицину и парамицину. В 1976 г. были зарегистрированы внутригоспитальные вспышки, вызванные стафилококками, резистентными и к гентамицину и др. аминогликозидам. В этом же году появились сообщения о выделении стафилококков, резистентных и к гентамицину и метициллину, но и к пенициллину и стрептомицину, выделенных в Мельбурне, Лондоне, Дублине и США. Как выяснилось, плазмиды могут участвовать в формировании хромосомной резистентности в качестве векторов транспозируемых генетических элементов. Частота, с которой появляются резистентные бактерии в среде очень высока. Поскольку лекарственные вещества и кормовые антибиотики используются в ветеринарии и растениеводстве, то распространение селекционированных резистентных организмов от одного к другому хозяину, а так же от животных к человеку имеет важное эпизоотическое и эпидемиологическое значение. Механизмы лекарственной резистентности.
Ферментативная инактивация антибиотика происходит в среде за пределами клетки. Одиночные клетки поэтому беззащитны. Ферменты -лактамазы инактивируют -лактамные антибиотики путем гидролиза еще до того, как они успеют проникнуть через клеточную мембрану и достичь пенициллинсвязывающих белков в ЦПМ. Изменение сайтов-мишеней в качестве механизма резистентности показаны с случае многих антибиотиков. Однако прямое отношение доказано лишь в случае эритромицина и линкомицина. Механизмы резистентности к этим антибиотикам заключаются в специфическом N6-диметилировании 2-х адениновых остатков в рРНК, в результате чего, такие рибосомы в значительно меньшей степени связываются с антибиотиком (такое связывание привело бы к ингибированию белкового синтеза). Efflux-механизм характерен для резистентности к тетрациклинам. Он связан с удалением из клетки этого антибиотика. Не исключено, что пониженное действие тетрациклина связано как с пониженным его восприятием клеткой, так и с efflux-механизмом. Обходные механизмы лежат в основе плазмидной резистентности к сульфонамидам и триметоприму. Плазмиды обеспечивают клетки новым ферментом, заменяющий подавленный и нечувствительный к ингибирующему действию антибиотика. Кроме всего перечисленного плазмиды определяют также и резистентность к тяжелым металлам и др.
А также ко многим другим веществам (медь, висмут, свинец, бор, хром, кобальт, никель, соединения цинка). Мутации внехромосомных факторов резистентности. Эписомные элементы (плазмиды), обладающие способностью поддерживать собственное автономное состояние и независимость скорости репликации от регуляторных механизмов клетки-хозяина, также независимо могут мутировать, либо не влияя на поведение бактериальной клетки, либо в какой-то мере изменяя ее физиологические функции. Обычно принято считать, что эписомные детерминанты контролируют невысокую резистентность; однако в действительности имеется немало наблюдений, противоречащих такому представлению. Наблюдался четко выраженный мутаторный эффект у штамма Salmonella typhi, выделенного от больного; штамм этот характеризовался наличием разных типов R-факторов: Sin, Тс, только Тс, или Тс, Sm. Культуры бактерий Salmonella typhi, Salmonella typhimurium и E. coli, инфицированные этими факторами, проявляли генетическую нестабильность и мутабельность детерминантов резистентности к высоким концентрациям антибиотиков. Высокая резистентность передавалась реципиентам при последующей конъюгации со скоростью, типичной для трансмиссивных элементов. Внехромосомная локализация детерминантов, контролирующих высокую резистентность, подтверждалась возможностью их элиминации. Генетический анализ мутаций у полирезистентных штаммов довольно сложен прежде всего потому, что в них могут сосуществовать независимые друг от друга комплексы детерминантов резистентности со своими автономными факторами передачи, и каждый такой комплекс может видоизменяться в результате разнообразных событий - мутаций, сегрегации или рекомбинаций. Фенотипическое выражение подобного рода изменений в состоянии генома бактериальной клетки часто взаимно маскируется и с трудом поддается дифференцированному тестированию. Часто имеет место мутационное изменение генов, контролирующих репликацию самого фактора резистентности в естественных условиях. Такие мутации могут увеличить копийность плазмиды, что часто усиливает резистентность к большим концентрациям лекарственных и других веществ. Иногда в мутациях затрагиваются регуляторные механизмы, контролирующие проявления конъюгативности бактерий. При этом может, например, сниматься репрессия донорской активности. Роль бактериального генома у сальмонелл нередко проявляется в ограничении функций внехромосомных элементов, в том числе и факторов трансмиссивной устойчивости к лекарственным веществам. Известно, например, что сальмонеллы обладают низкой реципиентной активностью. R-факторы воспринимаются ими, как правило, с незначительной частотой, что связывается с ограничением, контролируемым клеткой-хозяином. Под влиянием мутагенов можно получить мутанты R-факторов, способные преодолевать это ограничение. Такие мутанты были получены путем воздействия нитрозогуанидина на Salmonella typhimurium c R-фактором дикого типа; способность R-мутантов преодолевать ограничения представляется функцией, независимой от реципиентных свойств бактерии-хозяина. Мутации по устойчивости к хлорамфениколу наблюдали еще в 1969г. у штамма Klebsiella c устойчивостью к пяти антибиотикам. При конъюгации маркеры резистентности передавались реципиентам из различных систематических групп грамотрицательных бактерий - эшерихий, шигелл, протеев и др., а также путем трансдукции с фагом Рlс из E. coli. Проявление мутационного эффекта только в отношении резистентности к одному антибиотику свидетельствует об индивидуальной генетической реакции отдельных детерминантов резистентности на воздействие мутагенов. Это далеко не исчерпывающее описание возможных мутаций, котрых у плазмид может наблюдаться огромное множество. Элиминация R-факторов. Лекарственная устойчивость бактерий, детерминируемая трансмиссивными генетическими элементами, представляет серьезную угрозу ее неограниченного распространения, принимающего масштабы подлинной «пандемии» в микро мире, связанной с экологией человека и животных. Поэтому в настоящее время придается чрезвычайно важное значение исследованиям, направленным на изыскание путей предотвращения или по крайней мере существенного ограничения распространения лекарственной устойчивости у бактерий, составляющих микрофлору нестерильных полостей макроорганизма - человека, животных, птиц и даже возможных переносчиков бактериальных возбудителей инфекции. Многими исследователями было замечено, что признаки устойчивости к лекарственным веществам у грамположительных и грамотрицательных бактерий, контролируемые внехромосомными детерминантами, нередко утрачиваются спонтанно или закономерно исчезают после обработки определенными соединениями, обладающими избирательной ДНК-тропностью. Этот феномен, обозначаемый термином «элиминация», связанный с утратой генетических детерминантов, в том числе плазмид и факторов резистентности, используется как одно из доказательств их внехромосомной локализации. Изучение сущности и механизмов этого явления представляет большой не только теоретический, но и практический интерес, хотя до настоящего времени не удалось еще достигнуть такого эффекта элиминации, чтобы его можно было использовать в клинических целях. Задача поиска эффективных средств элиминации эписомных детерминантов резистентности осложняется, еще и тем обстоятельством, что большинство известных элиминирующих соединений является либо мутагенами, либо, кроме того, и канцерогенами, что налагает дополнительную ответственность на испытателей при оценке эффективных средств и практических рекомендаций. В качестве элиминирующих агентов наиболее широко используются при теоретических исследованиях акридиновые красители (акрихин, акридиновый оранжевый). При элиминации происходит необратимая утрата генетических элементов, локализованных вне хромосомы. Механизмы, лежащие в основе элиминирующего действия акридиновых красителей, во многом остаются нерасшифрованными, однако методами генетического анализа четко показано, что при действии акридинов на бактерии, обладающие трансмиссивной резистентностью к антибиотикам, происходит полное подавление генетических и физиологических функций ее детерминантов. возможно, элиминация связана с блокированием репликации эписом либо нарушения участка ее инициирования, либо из-за нарушения прикрепления эписомных реплик к центрам бактериальных мембран, отвечающих за сегрегацию генетического материала в дочерних клетках. Novick (1963) показал, что спонтанные пенициллиночувствительные варианты стафилококка с полной утратой пенициллиназной активности не мутируют ни спонтанно, ни после обработки мутагенами в направлении восстановления устойчивости к пенициллину. Эти же формы не дают и рекомбинантов дикого типа при скрещивании друг с другом, а также с мутантами, сохранившими низкий уровень образования этого фермента. Факторы трансмиссивной резистентности к лекарственным веществам, как отмечено ранее, ведут себя подобно другим внехромосомным элементам, которые в автономном, состоянии могут быть подвержены эффективному действию элиминирующих агентов. Поэтому некоторые общие положения, выявленные на других системах, могут быть приняты и для резистентных бактерий. Отсутствие эффекта полной элиминации определенных внехромосомных детерминантов может быть следствием того, что в одной клетке имеется несколько различных R-факторов с различными наборами генов резистентности. Помимо акридиновых красителей, за последнее время выявлены другие соединения с высокой элиминирующей активностью. Одним из таких соединений оказался бромид этидиума. Показано, что это соединение в низких концентрациях (5 10 * Ю6 М, рН 7,2) вызывало у энтеробактерий практически полную элиминацию факторов R4, R22, в то время как другие, хорошо передающиеся при конъюгации факторы (R15 и R8) не элиминировались вообще. Причина, лежащая в основе этого различия, пока остается невыясненной. У стафилококков с пенициллиназной активностью также удалось с довольно высокой эффективностью (8—100%) освобождать клетки от плазмид, причем устойчивость к сулеме и образование пенициллиназы утрачивались одновременно, но без потери устойчивости к эритромицину. Примечательно, что на пенициллиназных плазмидах Staphylococcus aureus может находиться детерминант, определяющий устойчивость к этому препарату. Другим высокоактивным препаратом оказался додецилсульфат натрия, который не только приводил к элиминации R-факторов, но и вообще был более токсичен по отношению к R+ -клеткам, чем к клеткам без R-факторов. Это служит еще одним примером лекарственной конверсии клеток. Аналогичным действием обладал 4-нитрохинолин-1-оксид. С действием додецилсульфата натрия можно также сравнить действие пенициллина, который в суббактериостатических концентрациях вызывает устранение R-факторов из клеток Salmonella paratyphi (R) В качестве элиминирующих агентов может выступать большое число соединений, в том числе и такие, которые являются естественными метаболитами (гуанин, глюкоза и некоторые детергенты освобождают клетки Staphylococcus aureus от плазмид с пенициллиназной активностью). Большое число работ касается данных об элиминирующем действии повышенной температуры на культуры стафилококка с пенициллиназной активностью. Отмечается, что условия повышенной температуры вызывали не только появление негативных вариантов, но и селективно способствовали более быстрому росту последних. Нужно учесть, что некоторые элиминирующие химические агенты в определенных концентрациях могут не только вызывать утрату устойчивости, но в силу своего мутагенного потенциала могут индуцировать ее в некоторых случаях. Учитывая, что все акридины являются в определенных условиях мутагенами, нельзя исключить подобный эффект, особенно при анализе свойств одномаркерных факторов резистентности, где фенотипическое выражение «элиминация» в действительности может отражать мутационное изменение, характеризующееся повреждением генов, контролирующих чувствительность к определенному веществу. |