Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки
 Скачать 0.52 Mb.
|
|
Поверхностное исключение и летальный зигозиз. Поверхностное исключение (sfx) лучше всего исследовано в случае F-плазмид. Экспериментальные данные свидетельствуют, что это свойство плазмид F детерминируется генами tra S и tra T. Мутации этих генов снижают sfx в 15-20 раз. Изучение роли белка tra T плазмид F показало, что этот белок либо снижает частоту формирования стойких клеточных агрегатов в процессе скрещивания клеток, либо связан с концом f-пили, предупреждая взаимодействие последней с поверхностью клетки реципиента. Белок tra S подавляет запуск конъюгационного метаболизма ДНК. Клетки доноры F+ становятся фенокопиями F- в поздней стационарной фазе развития при культивировании и имеют реципиентную способность. В фенокопиях продукт гена tra T также синтезируется, однако функционально не активен. Поверхностное исключение обнаружено также в случае I-подобных плазмид. Летальный зигозиз может проявляться если в скрещиваниях используются клетки реципиенты F-. Однако, если клетки, используемые в качестве реципиентов, содержат плазмиду F - они имунны к летальному зигозису. Несовместимость и группы несовместимости. К одной группе несовместимости (inc-группа) относят плазмиды, которые несовместимы между собой, но совместимы с любой плазмидой из другой группы. Существует более 30 inc-групп:
Когда плазмиды не трансмиссивны в E.Coli их классифицируют в бактериях тех видов, в которых они выявлены. Плазмиды псевдомонад, не способные к переносу в E.Coli, классифицированы в Pseudomonas aeruginosa и других псевдомонадах на 11 групп. Плазмиды стрептококков и стрептомицетов также классифицированы на несколько inc-групп. Для плазмид одной группы исключения сходна молекулярная масса, гомологичны многие последовательности нуклеотидов, сходны конъюгационные процессы, синтезируются серологически родственные пили. Как полагают многие исследователи, принадлежность плазмиды к той или иной группе несовместимости является отражением филогенеза последней. Иногда проявляется атипичная несовместимость, когда плазмиды оказываются несовместимыми с плазмидами других групп несовместимости. Иногда одну плазмиду относят к нескольким inc-группам. На данный момент предложено две модели механизма несовместимости:
Молекулярная и генетическая организация плазмид. Генетическая организация разных плазмид отличается большим разнообразием, так как среди плазмид, на основе их функциональной специфичности, различают факторы генного переноса, представляющие собой структуры, содержащие лишь гены репликации и переноса, благодаря которым обеспечивается непрерывность поддержания плазмид этого типа и распределение их между дочерними клетками, а так же их трансмиссивность и генетические детерминанты различных свойств. Конъюгационные коинтегративные плазмиды – коинтеграты, состоящие из фактора генного переноса(RTF) и генов, детерминирующих фенотипические свойства бактерий. Каждый из составных компонентов такой плазмиды содержит в своем геноме гены репликации. Неконъюгационные плазмиды - генные детерминанты различных свойств. В бактериальных клетках они лишены способности придавать клеткам свойства генных доноров (они не способны к самостоятельной передаче, но, благодаря наличию генов репликации, стабильно поддерживаются в клетке и передаются дочерним клеткам). Молекулярная организация. Плазмиды – молекулы ДНК, с размерами от 1  350 МД и более (1000 550000 нуклеотидов). Чаще всего размеры лежат в пределах от 3 6 МД и от 50 70 МД (последнее множество размеров принадлежит конъюгационным плазмидам). Молекуле плазмидной ДНК присущи различные конформации: может быть 2-хцепочечная кольцевая форма (в результате смыкания одной из цепей ДНК – «релаксированная» форма), в результате смыкания обеих цепей образуется ковалентно закрытая сверхспиральная кольцевая форма.  Конформации плазмидной ДНК (суперспирализованная, линейная и кольцевая релаксированная)        Для большинства бактерий и плазмид обычна суперспирализированная форма. У микроорганизмов ряда видов встречаются плазмиды в линейной форме, например, у стрептомицетов – плазмида SCP1. Значительная часть сверхспиральной ДНК отдельных плазмид находится в «релаксационном» комплексе с белком. Кольцевая форма молекулы ДНК плазмиды характерна лишь для бактерий, но не для грибов и растений, где она существует в линейной форме. Генетическая организация факторов переноса. К чистым факторам переноса относят, например, факторы F и F-подобные (pAP22-4, pAP38, pAP39, pAP41) и pTRA1, фактор T, идентифицированный в E.coli, Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Aerobac-ter, фактор , обнаруженный в S. typhimurium, и pAA1000 – в S. suipestifer (Пехов А.А. 1981), в Pseudomonas – фактор АP, а в Vibrio – фактор P и др. Наиболее полно их генетическая организация изучена на примере F-плазмиды, у которой не только изучены гены переноса – tra, репликации – rep, несовместимости – inc и др. но и картированы. Имеется 22 гена tra: M, J, A, L, E, K, B, V, C, W, U, N, F, H, G, S, T, D, I, Y, Q, Z. Гены tra A, L, E, K, B, V, C, W, F, Q, H, G – детерминируют синтез белков F-пилей, например, F-подобные pED208 – детерминируют синтез 17 пилей (в случае 0.5 – 1.5 пили в среднем на клетку), гены tra N и G детерминируют устойчивость конъюгационных пар клеток (донор – реципиент), tra M, Y, G, P, I, R, U – контролируют метаболизм конъюгации, tra S, T – поверхностное исключение, tra J - генетическая регуляция переноса плазмид. Генетическая организация конъюгативных коинтегративных плазмид. Эти плазмиды представляют из себя коинтеграты факторов переноса и детерминантов различных свойств, контролируемых плазмидой. С этой стороны наиболее полно изучена F- и I-подобные плазмиды лекарственной резистентности. R-плазмиды – коинтеграт 2 макромолекул (RTF + генетические детерминанты r). Основной тип фактора R является сложной структурой, в которой несколько генетических элементов объединено в одну кольцевую макромолекулу.     Альтернативные молекулярные формы фактора R3W. Единая структура раздельные компоненты репликона В некоторых случаях в коинтеграты входят несколько элементов, способных к независимой репликации (имеют rep-гены). Таким образом, коинтеграты в клетке хозяина могут быть стабильными (I вариант) и разделенными на отдельные репликоны (II случай). Имеющиеся данные свидетельствуют, что система переноса F-подобных R1, RG, R100 в принципе сходны с F плазмидой и имеют сходные наборы и последовательности генов tra, и детерминируют синтез сходных (толстые, гибкие) пилей. Система переноса I-подобных плазмид сходна с системой F-подобных, однако, для нее характерны особенности: синтез толстых и тонких пилей, морфологически и антигенно-отличных от F-индуцируемых и др. У других inc-групп также встречаются отличия. Цитоплазматические элементы, обладающие естественной способностью автономной репликации и самопередачи, могут «выхватывать» из хромосомы отдельные гены, контролирующие синтез какого-либо вещества, или фрагменты, включающие несколько генов. Трансмиссивные элементы, не нагруженные генами, контролирующими резистентность к лекарственным веществам (типа фактора А Андерсона), теоретически также могут быть интегрированы с хромосомой в локусах, расположенных рядом с хромосомными генами, контролирующими лекарственную устойчивость. При переходе из интегрированного состояния в автономное трансмиссивный элемент может включать в свою структуру прилегающий к нему участок хромосомы, несущий гены резистентности. Путем последовательной «достройки» трансмиссивного элемента может образоваться новая генетическая структура с несколькими генами резистентности плазмиды R. В отношении реальности такого пути формирования новых факторов резистентности высказываются критические соображения, хотя генетические доводы относительно возможности возникновения плазмид коинтегрированного типа не противоречат гипотезе «выхватывания генов». Одно из соображений, не укладывающихся безоговорочно в концепцию, заключается в том, что механизмы резистентности, контролируемой плазмидами R, часто существенно отличаются от механизмов формирования хромосомной резистентности. В первом случае факторы R включают гены, контролирующие синтез энзимов, инактивирующих антибиотики, тогда как соответствующая хромосомная резистентность возникает в результате модификаций рибосомальных структур. Правомерна и другая теоретическая модель, несколько отличающаяся от рассмотренной выше. Ее построение основано на том, что у многих видов бактерий в цитоплазме присутствует внехромосомная ДНК в виде независимо реплицирующихся автономных репликонов. Некоторые из них могут нести функции фактора передачи или иметь форму неинфекционного внехромосомного элемента, например, обладающего антагонистической активностью (как факторы колициногенности). В структуре таких репликонов возможно наличие генов, контролирующих резистентность к антибиотикам, или солям тяжелых металлов. Присутствие в клетке трансмиссивных плазмид создает условия для передачи неинфекционных плазмид путем их мобилизации. Аналогично этой ситуации присутствие независимого фактора передачи и независимого неинфекционного фактора лекарственной устойчивости в одной клетке может быть основой для .формирования генетического элемента со свойствами фактора R, обладающего одновременно инфекционностью и способностью, контролировать лекарственную устойчивость. В некоторых случаях возможна последующая интеграция отдельных репликонов с другими, в результате чего могут сформироваться сложные репликоны со структурами плазмидных коинтегратов. При отсутствии коинтеграции возможно формирование генетических комплексов, которые могут быть отнесены к типу плазмидных «агрегатов». Передаваясь от клетки к клетке, плазмиды распространяются «эпидемически» (по выражению Fredericq) в популяции чувствительных бактерий по типу вирусных агентов. Благодаря этому свойству конъюгативные плазмиды именуются инфекционными. Многие плазмиды, обладающие свойством самопередачи (за исключением F), в большинстве клеток донорской популяции репрессированы. Их активность регулируется системой оператор – репрессор, в которой соответствующая группа генов включается периодически в зависимости от накопления в клетке специфических субстратов, контролирующих их функции. Генетическая организация неконъюгационных плазмид. Эти плазмиды не содержат RTF, только различные генетические детерминанты (например r) и rep-систему. К ним относятся такие плазмиды как, ColE1, pSE101, SuSm и тд. Наиболее изучены ColE1, CloDF13. Для них характерна кластерность генов на генной карте. Например, район, отвечающий за репликацию, включает O-пункт и детерминанты, контролирующие репликацию. К этому району примыкает отвечающий за колициногенность. Поддержание в клетках. Выдающееся свойство плазмид – поддержание в бактериальных клетках в определенном числе копий. Здесь важны процесс репликации и точного распределения между дочерними клетками. У F-плазмиды имеется процесс, контролируемы плазмидой в виде пары генов ccd, определяющий отсеивание клеток, утерявших плазмиду. Заключается в деструкции клеток, в которых произошла ее элиминация. Когда клетка теряет плазмиду, происходит активация продуктов генов ccd, что влечет к запуску механизма самоубийства в клетке и далее в ее потомках. Репликация. Базовый репликон. Репликационный цикл ДНК плазмид, как и хромо-сомной, состоит из инициации, элонгации и терминации. При удвоении ДНК плазмид образуется ковалентно закрытые, но не сверхскрученные, молекулы, которые затем конвертируются в молекулы сверхспирализованной ДНК. Процесс элонгации непрерывен. Для завершения цикла удвоения необходимо, что бы первичная элонгационная вилка достигла терминуса, а вторая начала движение от O-пункта в противоположном направлении вплоть до терминуса. Все, что в настоящее время известно о репликации плазмид, выяснено, в основном, в ходе изучения так называемых мини-плазмид или мини-репликонов, конструируемых с помощью рестриктаз и лигазы из нормальных плазмид или введением в геномы плазмид транспозонов, вызывающих перестройки в плазмидной ДНК. Для репликации плазмиды минимально необходима лишь часть плазмиды – базовый репликон. Наиболее полно он изучен на примере миниплазмиды F. Он в ней состоит из ряда элементов:
Что, касается гена rep, то предполагают, что он контролирует инициацию репликации. Посредством про-дукции белка rep E, связывающегося с ori. С другой стороны, предполагается существование и другой схема, контроля копийности. Найдено 5 прямых повторов, родственных повторам в локусе ori, формирующих локус cop. Считают, что cop конкурирует с локусом ori за связывание белка repE, который обладает авторепрессорной активностью. Предполагается, что он имеет две формы, одна из которых имеет значение в инициации репликации, вторая – в репрессии гена rep (авторепрессорная активность). Репликация плазмиды F и всех, происходящих от нее, мини-репликонов требует участия белка, кодируемого хромосомным геном dnaA и являющегося инициатором репликации бактериальной хромосомы. Для плазмиды F характерно наличие двух O-пунктов репликации – oriS и oriV. С oriS репликация проходит в двух противоположных направлениях, тогда как с oriV – только в одном. У большинства остальных плазмид репликация проходит по сходным схемам, с определенными отличиями, так существенные отличия наблюдаются при репликации P-подобных плазмид. |