Практикум по физиологии растений учебнометодическое пособие Казань
 Скачать 1.47 Mb.
|
|
КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Институт фундаментальной медицины и биологии ПРАКТИКУМ ПО ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ Учебно-методическое пособие Казань 2013 2 УДК 581.1 Печатается по решению Редакционно-издательского совета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет методической комиссии Института фундаментальной медицины и биологии Протокол № 2 от 28 мая 2013 г. заседания кафедры физиологии и биохимии растений Протокол № 2 от 13 мая 2013 г. Составители канд. биол. наук, доц. В.Н. Воробьев канд. биол. наук, доц. Ю.Ю. Невмержицкая канд. биол. наук, ст. преподаватель Л.З. Хуснетдинова канд. биол. наук, ст. преподаватель Т.П. Якушенкова Рецензент канд. биол. наук, доц. ЭВ. Бабынин Практикум по физиологии растений учебно-методическое пособие / В.Н. Воробьев, Ю.Ю. Невмержицкая, Л.З. Хуснетдинова, Т.П. Якушенкова. – Казань Казанский университет, 2013. – 80 с. В практикуме представлены теоретические основы и практические методики по основным разделам физиологии растений. Рассмотрены методы изучения физиологии растительной клетки, водного обмена, фотосинтеза, дыхания, минерального питания растений. Предназначено для студентов, бакалавров, магистрантов и аспирантов биологических, сельскохозяйственных и педагогических вузов. © Казанский университет, 2013 © Воробьев В.Н., Невмержицкая Ю.Ю., Хуснетдинова Л.З. , Якушенкова Т.П., 2013 ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ Клетка представляет собой структурную и функциональную единицу всего живого. Специфическими особенностями строения растительных клеток, отличающими их от клеток других эукариотических организмов, является наличие системы пластид, крупной центральной вакуоли, а также прочной полисахаридной клеточной стенки. Растительная клетка содержит три относительно автономных, но тесно взаимодействующих между собой генетических системы – ядерную, митохондриальную и пластидную. Являясь открытой системой, живая клетка обменивается с окружающей средой веществом, энергией и информацией. Ее структурную основу составляют биологические мембраны, поддерживающие постоянство среды в клетке и ее отдельных компартментах. Основу составляют липиды, придающие мембранному матриксу высокие изолирующие свойства. Другой обязательный компонент мембран – белки. Они выполняют в мембранах структурную, транспортную, ферментативную и рецепторную функции. Внутренние мембраны хлоропластов и митохондрий обеспечивают пространственную организацию молекул, осуществляющих трансформацию энергии в клетке и образование универсальных аккумуляторов энергии – молекул АТФ. Важнейший компонент клетки – ядро – хранит и передает наследственную информацию, заключенную в определенных нуклеотидных последовательностях молекулы ДНК, обеспечивая тотипотентность всех клеток организма. На этом свойстве основаны современные биотехнологические приемы с использованием культур клеток и тканей и с последующей регенерацией целых растений. Хлоропласты и митохондрии – энергетические станции клетки – являются полуавтономными органеллами. Они обладают своей, отличной от ядерной, наследственной информацией, реализующиеся в этих органеллах при синтезе специфических белков. Однако их функционирование теснейшим образом связано с деятельностью белков, кодируемых ядерной ДНК. Каждая клеточная органелла выполняет оригинальную и незаменимую функцию. Эндоплазматическая сеть переносит вещества и передает сигналы, аппарат Гольджи выполняет секреторную функцию, снабжая строительным материалом клеточную стенку в сферосомах происходит синтез липидов, а лизосомы изолируют гидролитические ферменты от цитозоля, предотвращая в нем неконтролируемый лизис веществ. Единственные органеллы, не имеющие мембран, – рибосомы. В них осуществляется сборка специфических белков из аминокислот согласно информации, поступающей от ДНК. Взрослая растительная клетка имеет большую вакуоль сводным раствором органических и минеральных веществ. Она участвует в биохимическом круговороте веществ в клетке. Вода растительными клетками поглощается по законам осмоса. Перемещение молекул воды из внешней среды в клетку, а также от клетки к клетке происходит по градиенту уровня свободной энергии молекул воды, который определяется их химическим потенциалом. Точкой отсчета уровня свободной энергии молекул воды берется ее уровень у молекул чистой воды в стандартных условиях. Химический потенциал воды вводных растворах и клетках меньше, чему чистой воды. Эта разница, называется водным потенциалом, отражает способность воды в данной системе совершать работу в сравнении с работой, которую при тех же условиях совершала бы чистая вода. Водный потенциал определяет способность молекул воды диффундировать, испаряться или поглощаться. Молекулы растворенных вводе веществ снижает уровень свободной энергии молекул воды. Это снижение измеряется осмотическим потенциалом. Осмотический потенциал – компонент водного потенциала раствора, который определяется присутствием растворенных веществ, снижающих химический потенциал воды. Поэтому осмотический потенциал всегда величина отрицательная. Работа 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ ПРОТОПЛАЗМЫ МЕТОДОМ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ Общие сведения Вязкость – одно из свойств цитоплазмы. Вязкость, или внутреннее трение, характеризуется силой, необходимой для перемещения одного слоя жидкости относительно другого. Вязкость протоплазмы можно определить 1) путем определения скорости движения в ней искусственно введенных при помощи микроманипулятора кусочков никеля или железа, на которые затем действуют магнитом 2) путем смещения под воздействием центробежной силы крахмальных зерен или других каких-либо включений клетки 3) изучая скорость передвижения хлоропластов под влиянием центробежной силы. Материалы и оборудование. Веточка элодеи канадской (Elodea canadensis Michx.). Препаровальные иглы, лезвия, пинцеты, предметные и покровные стекла, микроскоп, центрифуга и центрифужные пробирки. Порядок выполнения работы Для определения вязкости протоплазмы последним способом берут несколько листков элодеи, которые погружают в центрифужные пробирки, наполненные водопроводной водой. Пробирки помещают в центрифугу на 40 минут. После чего центрифугированные листочки элодеи рассматривают под микроскопом. Под микроскопом видно смещение хлоропластов в клетках в группы. Обнаруживают большее смещение в старых верхушечных клетках листа, в которых вязкость протоплазмы оказывается наименьшей. В молодых клетках, которые обычно располагаются у основания листа, подобное смещение происходит медленно, и оно не так ясно выражено вследствие того, что протоплазма в этих клетках обладает большей вязкостью. Работа 2. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ КАЛИЯ И КАЛЬЦИЯ НА ФОРМУ ПЛАЗМОЛИЗА Общие сведения При погружении клеток в гипертонический раствор происходит отток воды из клеток до тех пор, пока не сравняются концентрации клеточного сока и наружного раствора. После этого начинается плазмолиз, те. отставание цитоплазмы от клеточной оболочки. Сначала цитоплазма отстает от оболочки в уголках (уголковый плазмолиз, затем во многих местах с образованием вогнутых поверхностей (вогнутый) и, наконец, принимает округлую форму (выпуклый. А если у протопласта связь с клеточной стенкой в отдельных местах сохраняется, то при дальнейшем уменьшении объема входе плазмолиза протопласт приобретает неправильную форму. Такой плазмолиз носит название судорожного(рис. 1). Явление, обратное плазмолизу называется деплазмолизом. Наблюдается в том случае, если плазмолизированную клетку поместить вводу. Рис. 1. Формы плазмолиза 1 – уголковый 2 – вогнутый 3 – выпуклый 4 – судорожный Ионы минеральных солей способны влиять на свойства коллоидов цитоплазмы, изменяя ее вязкость, причем ионы одно- и двухвалентных металлов проявляют противоположное действие. При сравнении вязкости цитоплазмы в растворах солей калия и кальция можно отметить, что ионы калия, проникая в цитоплазму, повышают ее гидрофильность, уменьшают вязкость и способствуют ее быстрому отрыву от клеточной стенки. Поэтому в растворах солей калия плазмолиз быстро принимает форму выпуклого. Ионы кальция, наоборот, повышают вязкость цитоплазмы, увеличивают силы сцепления ее с клеточной стенкой, и плазмолиз принимает форму судорожного плазмолиза. В качестве плазмолитиков (веществ, растворы которых вызывают плазмолиз) используют неядовитые вещества, плохо проникающие через цитоплазму в вакуоль. Материалы и оборудование Луковица синего лука (Allium cepa L.), 1 М раствор нитрата калия, 0,7 М раствор нитрата кальция. Препаровальные иглы, лезвия, пинцеты, предметные и покровные стекла, скальпель, микроскоп. Порядок выполнения работы Сделать лезвием срез эпидермиса, клетки которого содержат антоциан. Поместить срез в каплю воды на предметное стекло, накрыть покровным стеклом и рассмотреть в микроскоп клетки с окрашенным клеточным соком. Затем заменить воду на раствор нитрата калия (1 М. Следят за сменой форм плазмолиза. Затем ввести в покровное стекло каплю воды, оттягивая раствор кусочками фильтровальной бумаги, и вновь наблюдать за изменениями, происходящими в клетке. На другое предметное стекло нанести каплю нитрата кальция (0,7 М) поместить срез эпидермиса, накрыть покровным стеклом и наблюдать за изменениями, происходящими в клетке. Записать результаты и сделать схематические рисунки клеток вводе и после пребывания в растворе, обозначив основные составные части клеток и показав стрелками процессы плазмолиза и деплазмолиза. Работа 3. НАБЛЮДЕНИЕ КОЛПАЧКОВОГО ПЛАЗМОЛИЗА Рис. 2. Колпачковый плазмолиз 1 – ядро 2 – плазмалемма 3 – цитоплазма 4 – вакуоль Общие сведения Колпачковый плазмолиз возникает при действии гипертонических растворов солей. Такие соли вызывают набухание мезоплазмы, уменьшение степени ее дисперсности, изменение структуры. При длительном нахождении клеток в растворе нитрата калия (15 мини более) цитоплазма набухает в удлиненных клетках, и там, где протопласт не касается клеточных стенок, образуются так называемые колпачки цитоплазмы. Такой плазмолиз носит название колпачкового(рис. 2). В еще большей степени набухание происходит в растворах роданида калия, в которых колпачки цитоплазмы образуются сразу же после начала плазмолиза. Колпачковый плазмолиз может свидетельствовать о разной проницаемости плазмалеммы и тонопласта для ионов калия. Ионы калия, проникая через плазмалемму в цитоплазму, вызывают ее набухание. В вакуоль через тонопласт они не проходят. Объем плазмолизированной вакуоли не увеличивается и плазмолиз сохраняется. Материалы и оборудование Луковица синего лука (Allium cepa L.), 1 М раствор KCNS. Препаровальные иглы, лезвия, пинцеты, предметные и покровные стекла, микроскоп. Порядок выполнения работы. Срез эпидермиса с выпуклой поверхности пигментированной чешуи луковицы помещают на предметное стекло в каплю раствора роданида калия (1 Ми накрывают покровным стеклом. Сразу же наблюдают за образованием колпачкового плазмолиза сначала при малом, а затем при среднем увеличении. Сделать рисунок и сформулировать вывод о причине появления колпачкового плазмолиза. Работа 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ ЦИТОПЛАЗМЫ ПОВРЕМЕНИ ПЛАЗМОЛИЗА Общие сведения Промежуток времени от момента погружения клеток в гипертонический раствор до наступления выпуклого плазмолиза называют временем плазмолиза. Это время зависит от вязкости цитоплазмы чем меньше вязкость, тем легче цитоплазма отстает от клеточной стенки и тем быстрее вогнутый плазмолиз переходит в выпуклый. Вязкость цитоплазмы зависит от степени дисперсности и гидратации коллоидов, от содержания в клетке воды и ряда других факторов. Цитоплазма растущих клеток и клеток, закончивших рост, имеет разную вязкость. Для опыта используют молодые листочки элодеи, в которых можно различить 4 зоны в основании расположена слабо окрашенная зона деления клеток, выше находится зона растяжения, еще выше – зона дифференциации и, наконец, верхушка листа, которая состоит из клеток, закончивших рост и имеющих интенсивную зеленую окраску. Материалы и оборудование Веточка элодеи канадской (Elodea canadensis Michx.), луковица синего лука (Allium cepa L.) или листья традесканции (Tradescantia), 1 М растворили сахарозы. Лезвия, препаровальные иглы, пинцеты, предметные и покровные стекла, микроскоп. Порядок выполнения работы Взять 2-3 молодых листочка из верхушечной части побега элодеи (листья должны иметь зеленый кончики бледно-зеленое основание, погрузить в каплю 1 М раствора NaCl на предметное стекло и закрыть покровным стеклом. Для сравнения, в другую каплю раствора NaCl поместить срез эпидермиса синего лука или традесканции. Отметить время погружения исследуемых объектов в раствор. Рассматривая препараты в микроскоп через каждые 5 минут, определить время плазмолиза. Причем, у листа элодеи следует наблюдать за клетками различных зон. Записать результаты и сделать вывод о зависимости вязкости цитоплазмы от возраста листа. Работа 5. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ КАЛИЯ И КАЛЬЦИЯ НА ВЯЗКОСТЬ ЦИТОПЛАЗМЫ Общие сведения Ионы минеральных солей способны влиять на свойства коллоидов цитоплазмы, изменяя ее вязкость, причем ионы одно- и двухвалентных металлов проявляют противоположное действие. О вязкости цитоплазмы можно судить повремени плазмолиза при большей вязкости цитоплазма с трудом отстает от клеточной стенки, сохраняя длительное время вогнутые поверхности (вогнутый плазмолиз. Если же вязкость цитоплазмы мала, то вогнутый плазмолиз быстро переходит в выпуклый. Материалы и оборудование. Луковица синего лука (Allium cepa L.), растворы 1 Ми М Ca(NO 3 ) 2 . Лезвия, препаровальные иглы, предметные и покровные стекла, кусочки фильтровальной бумаги, микроскоп. Порядок выполнения работы Нанести на предметные стекла по капле растворов KNO 3 и Ca(NO 3 ) 2 . Поместить в растворы по кусочку эпидермиса лука и закрыть покровными стеклами. Записать время погружения срезов в растворы и приступить к наблюдению под микроскопом, отмечая время наступления фаз плазмолиза (при этом не следует принимать во внимание периферическую зону, т.к. там свойства цитоплазмы могут быть изменены вследствие раневого раздражения. Результаты опыта записывают в таблицу 1 по приведенной форме. Влияние ионов калия и кальция на форму и время наступления плазмолиза Плазмолитик Время погружения ткани в раствор Время наступления плазмолиза уголковый вогнутый выпуклый Зарисовать наиболее характерные клетки через 5-10 минут после погружения срезов в растворы. Сделать вывод о влиянии ионов калия и кальция на вязкость цитоплазмы. Работа 6. ПРИЖИЗНЕННОЕ ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК НЕЙТРАЛЬНЫМ КРАСНЫМ Общие сведения Цитоплазма обладает прижизненной структурой, с которой связаны ее свойства и функции. Важнейшее из этих свойств – избирательная проницаемость. Живая цитоплазма не удерживает в себе витальные красители, которые свободно проходят в вакуоль и окрашивают клеточный сок. После гибели или при повреждении клетки красители задерживаются в самой цитоплазме в результате изменения нативной прижизненной) структуры белков. Цитоплазма и ядро приобретают соответствующую окраску. Материалы и оборудование Неокрашенный лук (Allium cepa L.), раствор нейтрального красного (1:1000), 1 М KNO 3 , 10%-ный раствор аммиака. Химические стаканы на 100 мл, предметные и покровные стекла, пинцеты, стеклянные палочки, препаровальные иглы, лезвия, пипетки, микроскоп. Порядок выполнения работы Срез с чешуи непигментированной луковицы выдерживают в слабом растворе нейтрального красного в течение 20 мин. После окрашивания срез помещают на предметное стекло в каплю воды, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом при малом, а затем при среднем увеличении. У живых клеток вакуоли окрашиваются нейтральным красным в малиновый цвета цитоплазма и ядро не окрашиваются. У мертвых клеток оструктуренные цитоплазма и ядро окрашиваются этим красителем. Не снимая препарат со столика микроскопа, фильтровальной бумагой отсасывают воду из-под покровного стекла и вводят под него каплю 1 М раствора После этого наблюдается плазмолиз клеток, накопивших краску в вакуолях, подтверждающий, что эти клетки живые. Чтобы проследить за изменениями в клетке при ее повреждении и гибели, применяют сильный яд – аммиак. Из-под покровного стекла фильтровальной бумагой отсасывают KNO 3 и заменяют его каплей 10%-ного аммиака. Окраска среза становится желтой, так как в присутствии аммиака кислая реакция клеточного сока изменилась на щелочную (в щелочной среде нейтральный красный имеет желтый цвет. В погибших под действием аммиака клетках цитоплазма и ядро приобретают видимую в микроскоп структуру и окрашиваются в желто-бурый цвет. Зарисовать живые клетки лука, накопившие нейтральный красный в вакуолях эти же клетки, плазмолизированные в 1 М растворе клетки лука с оструктуренными и окрашенными цитоплазмой и ядром, убитые аммиаком. По результатам работы сделать выводы о признаках повреждения и гибели клетки. Работа 7. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ КАЛИЯ И КАЛЬЦИЯ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЦИТОПЛАЗМЫ Общие сведения Проницаемость цитоплазмы зависит от ионов минеральных солей. Ионы, повышающие проницаемость степень гидратации коллоидов, увеличивают проницаемость. Тогда как ионы, проявляющие коагулирующее действие, вызывают дегидратацию белков, уменьшение пор мембран и понижение скорости проникновения веществ в клетку. Материалы и оборудование. Луковица синего (неокрашенного) лука cepa L.), 1 ММ М раствор сахарозы или NaCl, раствор 0,02% нейтрального красного. Лезвия, препаровальные иглы, предметные и покровные стекла, кусочки фильтровальной бумаги, фарфоровые чашки, микроскоп. Порядок выполнения работы. В фарфоровые чашечки налить 9 объемов (18 капель) раствора нейтрального красного, добавив в одну 1 объем (2 капли) 1 М раствора KNO 3 , а в другую – 1 объем (2 капли) 0,7 М Ca(NO 3 ) 2 . Поместить в растворы минимум 3 среза эпидермиса лука. Через 5 минут вынуть 1 срез, промокнуть фильтровальной бумагой и поместить на предметное стекло в каплю раствора сахарозы или NaCl, накрыть покровным стеклом. Тоже самое сделать с объектами, пролежавшими в растворе нейтрального красного в течение 10-15 минут. Рассмотреть плазмолизированные клетки в микроскоп и сравнить скорость проникновения красителя в вакуоли. Сделать вывод о влиянии ионов калия и кальция на проницаемость цитоплазмы. Работа 8. ДИАГНОСТИКА ПОВРЕЖДЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПО УВЕЛИЧЕНИЮ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН Общие сведения Избирательная проницаемость – свойство живой цитоплазмы сохранять постоянство внутриклеточной среды (гомеостаз. При повреждении клетки цитоплазма теряет это свойство, и вещества, находящиеся в клетке, свободно выходят наружу. Степень повреждения коррелирует с количеством выделяющихся вводную среду веществ. Таким образом, интенсивность выхода веществ из клетки служит критерием ее повреждения. Выделившийся из поврежденных клеток пигмент антоциан легко учесть колориметрическим способом. Материалы и оборудование. Корнеплод красной столовой свеклы, хлороформный раствор уксусной кислоты, 50%-ный раствор спирта, 1 М раствор KNO 3 . Штативы с пятью пробирками, конические колбы, сверла, линейки, пипетки градуированные на 10 мл, предметные и покровные стекла, микроскоп, фотоэлектроколориметр (ФЭК). Порядок выполнения работы. Из очищенного корнеплода красной столовой свеклы сверлом диаметром 0,7-0,8 см вырезают кусочки толщиной 3-4 см. Их тщательно промывают под струей водопроводной воды и помещают по одному в пять пробирок, содержащих по 10 мл растворов (в соответствии со схемой опыта. Вариант с кипячением выполняют следующим образом. В колбу с кипящей водой бросают один из приготовленных кусочков. Через 2 мин кусочек вынимают, охлаждают и опускают в пробирку с 10 мл холодной водопроводной воды. Через 30 мин после начала опыта все пробирки интенсивно встряхивают, кусочки свеклы извлекают и сравнивают количество вышедшего из клеток пигмента в разных вариантах опыта при помощи ФЭК на синем светофильтре при длине волны 430-450 нм. При этом в контрольную кювету ФЭК наливают тот раствор, действие которого изучают. Интенсивность окраски устанавливают по коэффициенту экстинкции на шкале ФЭК. Для наблюдения за состоянием клеток используют явление плазмолиза, свойственное только неповрежденным клеткам. Из кусочков столовой свеклы контрольного варианта и варианта с наиболее интенсивным выходом антоциана готовят тонкие срезы, помещают их на предметное стекло в каплю раствора 1 М KNO 3 , накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. Зарисовывают клетки срезов двух вариантов, находящихся под действием плазмолитика. Результаты опыта записывают в таблицу 2 по приведенной форме. Выход антоциана из клеток корнеплода красной столовой свеклы под действием повреждающих агентов Интенсивность окраски раствора коэффициент экстинкции) Контроль водопроводная вода) Кипячение водопроводная вода) Водопроводная вода + 6 капель хлороформа 30%-ный раствор уксусной кислоты 50%-ный раствор спирта По степени выхода антоциана делают вывод о силе повреждения растительной ткани различными агентами. Работа 9. НАБЛЮДЕНИЕ ЗА ДЕЙСТВИЕМ СВЕТА НА СКОРОСТЬ ДВИЖЕНИЯ ЦИТОПЛАЗМЫ Общие сведения Во многих растительных клетках хорошо заметно передвижение различных цитоплазматических структур, вызванное спонтанным движением цитоплазмы. Оно обусловлено метаболизмом и обратимыми изменениями цитоплазматических белков. Вместе стоком цитоплазмы передвигаются метаболиты и передаются различные сигналы из клетки в клетку. Наличие или отсутствие движения цитоплазмы, изменение его скорости могут указывать на функциональное состояние растительной клетки. Материалы и оборудование. Веточка элодеи канадской (Elodea canadensis Michx.). Предметные и покровные стекла, препаровальные иглы, окуляры-микрометры, микрометрические линейки, секундомеры, настольные лампы, микроскоп. Порядок выполнения работы. На предметное стекло в каплю воды помещают лист водного растения элодеи, взятый вблизи верхушечной почки находящегося на рассеянном свету растения. Накрывают лист покровным стеклом и рассматривают под микроскопом сначала при малом, а затем при среднем увеличении. Окуляр должен быть снабжен окуляром-микрометром. Наблюдают движение хлоропластов в клетках, расположенных рядом со средней жилкой. Для учета скорости передвижения хлоропластов вращением окуляра совмещают шкалу окуляра-микрометра с направлением движения хлоропластов. Включив секундомер, замечают время, необходимое для прохождения каким-либо одним хлоропластом пути в десять делений окуляра- микрометра. Определение выполняют не менее чем с десятью хлоропластами. Таким же образом устанавливают скорость движения хлоропластов в листьях элодеи, находящейся в течение 15 мин под светом электролампы (100 Вт. Лампа должна быть удалена от растения на расстояние 20-30 см, чтобы исключить перегрев. Для того чтобы выразить скорость движения хлоропластов в микрометрах в секунду, необходимо определить цену деления окуляра-микрометра. На предметный столик помещают микрометрическую линейку и совмещают ее с направлением шкалы окуляра-микрометра. Совмещают также нулевые точки обеих шкал. Находят соответствующие друг другу линии на шкалах и определяют, сколько делений микрометрической линейки (Аи окуляра- микрометра (В) находится между совмещенными точками. Поскольку цена деления микрометрической линейки (10 мкм) известна, определяют цену деления окуляра-микрометра (С. С = 10 мкм∙А/В Зная время, необходимое для прохождения каждым хлоропластом расстояния, равного десяти делениям окуляра-микрометра (С мкм, вычисляют скорость движения хлоропластов. Результаты опыта записывают в таблицу 3 по приведенной форме. Определение скорости движения хлоропластов Вариант опыта Время прохождения хлоропластами десяти делений окуляра-микрометра, с Среднее время, с Длина проходимого отрезка, мкм Скорость движения хлоропластов, мкм/с 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 На свету Под лампой Сделать выводы о влиянии света на скорость движения цитоплазмы. Как правило, свет ускоряет движение цитоплазмы в 2-4 раза. Работа 10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО СОКА МЕТОДОМ ПЛАЗМОЛИЗА Общие сведения. Клеточный сок – водный раствор различных органических и неорганических веществ. Потенциальное осмотическое давление зависит от числа частиц, находящихся в этом растворе, те. от концентрации и степени диссоциации растворенных молекул. Под осмотическим давлениемпонимается сила равная той, которую необходимо приложить, чтобы помешать проникновению частиц чистого растворителя вода) в раствор (раствор сахарозы, разграниченные между собой полупроницаемой мембраной. Для того чтобы получить представления о величине осмотического потенциала какого-либо раствора, необходимо определить в нем концентрацию растворенного вещества. Данный метод основан на подборе такой концентрации наружного раствора, которая вызывает самый начальный (уголковый) плазмолиз в клетках исследуемой ткани. В этом случае осмотическое давление раствора примерно равно осмотическому давлению клеточного сока. Такой наружный раствор называют изотоническим. Материалы и оборудование Луковица синего лука (Allium cepa L.), 1 М раствор сахарозы или KNO 3 . Лезвия, предметные и покровные стекла, бюксы, градуированные пипетки на 10 мл, кисточки, препаровальные иглы, часы, фильтровальная бумага, микроскоп. Порядок выполнения работы. В бюксах готовят по 10 мл растворов сахарозы (можно KNO 3 ) путем разбавления 1 М раствора дистиллированной водой согласно таблице 4. Бюксы закрывают крышками, чтобы предотвратить испарение, и ставят вряд по убывающей концентрации. Лезвием делают тонкие срезы с выпуклой поверхности пигментированной чешуи луковицы размером примерно 25 мм из среднего хорошо окрашенного участка. В каждый бюкс, начиная с высокой концентрации, с интервалом 3 мин опускают по два-три среза. Через 30 мин после погружения срезов в первый бюкс их исследуют под микроскопом. Затем через каждые 3 мин наблюдают срезы из последующих бюксов. Таким способом достигают равную продолжительность пребывания срезов в растворах плазмолитиков. Срезы рассматривают под микроскопом в капле раствора из того бюкса, откуда они были взяты. Определяют степень плазмолиза клеток в каждом растворе и находят изотоническую концентрацию как среднюю арифметическую между концентрацией, при которой плазмолиз только начинался, и концентрацией, которая уже не вызывает плазмолиза. Результаты опыта записывают в таблицу 4 по приведенной форме. Определение потенциального осмотического давления Концентрация раствора, моль /л На 10 мл раствора Продолжительность пребывания срезов в растворе Степень плазмолиза Изотоническая концентрация, моль/л О смот ич еское давление, кПа 1 М раствора сахарозы или KNO 3 , мл воды, мл время погружения время наблюдения 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 7 6 5 4 3 2 1 3 4 5 6 7 8 9 Потенциальное осмотическое давление рассчитывают по формуле Р=RТсi, где R – газовая постоянная, равная 8,3 Дж/моль∙К; Т – абсолютная температура по Кельвину (о + комнатная с – изотоническая концентрация, М i – изотонический коэффициент Вант-Гоффа. Коэффициент Вант-Гоффа характеризует ионизацию растворов i=1+α(n-1), где α – степень диссоциации раствора данной концентрации n – число ионов, на которое диссоциирует соль. Так как неэлектролиты не диссоциируют, для сахарозы i=1. Степень диссоциации KNO 3 разной концентрации приведена ниже. Концентрация (М) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Степень диссоциации 0,71 0,74 0,76 0,79 0,83 Работа 11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОЧНОГО СОКА И ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Общие сведения. Рефрактометрический метод позволяет быстро и точно определить концентрацию клеточного сока и потенциальное осмотическое давление. Он очень удобен для работы в полевых условиях. Метод основан на учете показателя преломления света клеточным соком. Материалы и оборудование. Листья растений. Ручной пресс или ступка с пестиком, марля, ножницы, фильтровальная бумага, пипетки, рефрактометр. Порядок выполнения работы. При помощи ручного пресса получают сок из двух-трех листьев исследуемых растений, предварительно завернутых в кусочек марли. В качестве опытных вариантов желательно взять растения, относящиеся к трем разным группам – мезофитам, гигрофитам, ксерофитам. Если ручного пресса нет, растительную массу измельчают в ступке, переносят на двойной слой марли и отжимают сок. Определение можно вести на любом рефрактометре. Рис. 3. Лабораторный рефрактометр 1 – компенсатор 2 – окно для отраженного света 3 – система призм 4 – осветитель 5 – окно для проходящего света 6 – корпус термометра 7 – окуляр 8 – прорезь Приведем описание работы на рефрактометре (рис. 3). На нижнюю поверхность призмы рефрактометра наносят две капли исследуемого сока и прижимают верхней поверхностью призмы. Прибор направляют на свети вращением винта на тубусе добиваются четкого изображения в окуляре вертикальной шкалы с делениями, обозначающими содержание сахара в растворе (в %). Деление шкалы, через которое проходит горизонтальная граница между светлыми темным полями, соответствует концентрации сахара в клеточном соке испытуемого растения. Для каждого варианта делают не менее трех определений. При переходе от одного варианта к другому призму для очистки ее от предыдущего раствора протирают сначала влажной, а затем сухой фильтровальной бумагой. По специальной таблице находят величину потенциального осмотического давления (кПа), соответствующую найденной концентрации клеточного сока (См. Приложение. Результаты записывают в таблицу 5 по приведенной форме. Определение потенциального осмотического давления рефрактометрическим методом Вариант опыта Концентрация клеточного сока, % Потенциальное осмотическое давление, кПа По результатам опыта делают вывод о различиях потенциального осмотического давления у растений разных экологических групп и приспособительном значении этих различий. Работа 12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДНОГО ПОТЕНЦИАЛА ЛИСТЬЕВ МЕТОДОМ ШАРДАКОВА Общие сведения Энергетический уровень воды, как и любого другого вещества, отражаемый скоростью диффузии, называют химическим потенциалом, или, применительно к воде, водным потенциалом. Водный потенциал, являясь фактически мерой активности воды, определяет термодинамически возможное направление ее транспорта. Молекулы воды всегда перемещаются от более высокого водного потенциала к более низкому. Метод основан на подборе раствора, концентрация которого не изменяется при погружении в него растительной ткани. В этом случае величина водного потенциала раствора будет равна водному потенциалу клеток листа. Материалы и оборудование. Растения (горох, фасоль, подсолнечник, герань и др) политые и неполитые, 1 М раствор сахарозы (KNO 3 ), метиленовая синь. Штативы с двумя рядами пробирок, пипетки, градуированные на 10 мл, мерные пипетки на 0,5 мл, сверла диаметром 0,8-1,0 см, резиновые пластинки, пинцеты, проволочки, пробки для пробирок, стеклянные палочки. Порядок выполнения работы. Пробирки расставляют в штативе в два ряда пять в верхнем и пять в нижнем. В верхнем ряду готовят по 10 мл растворов сахарозы (можно KNO 3 ) путем разбавления 1 М раствора дистиллированной водой согласно форме 6. В пробирки нижнего ряда переносят по 0,5 мл раствора из соответствующих верхних пробирок и закрывают пробками. Для опыта целесообразны два варианта – растения, испытывающие недостаток воды и только что политые. Из листа сверлом вырезают 10 дисков, для чего лист поворачивают нижней стороной вверх и подкладывают под него резиновую пластинку. Диски выбивают между крупными жилками. В каждую пробирку нижнего ряда опускают на 40 мин по два диска. Каждые 10 мин пробирки с дисками встряхивают. Затем стеклянной палочкой удаляют диски и подкрашивают опытные растворы в пробирках нижнего ряда метиленовой синью, взятой в небольшом количестве на кончике проволочки. Содержимое встряхивают, добиваясь равномерной окраски раствора. Пипеткой на 0,5 мл набирают подкрашенный раствор. Конец пипетки опускают в соответствующий исходный раствор в пробирке верхнего ряда так, чтобы уровень жидкости в пипетке немного превышал уровень раствора в пробирке. Медленно выпускают жидкость из пипетки в исходный раствор, отмечая направление движения струйки. Если концентрация и, следовательно, плотность окрашенного раствора увеличились по сравнению с исходными, то струйка пойдет вниз, если концентрация уменьшилась, струйка пойдет вверх. При равенстве концентраций струйка равномерно распределится внутри пробирки с исходным раствором. Это означает, что водные потенциалы данного раствора и растительной ткани равны. Величину водного потенциала по найденной опытным путем концентрации рассчитывают по формуле ψ w ткани = ψ w раствора = - RТсi, где R – газовая постоянная, равная 8,3 Дж/моль∙К; Т – абсолютная температура по Кельвину (о + комнатная с – изотоническая концентрация, М i – изотонический коэффициент [i=1+α(n-1)]. Результаты опыта записывают в таблицу 6 по приведенной форме. Определение водного потенциала методом Шардакова Концентрация раствора, моль/л На 10 мл раствора Направление движения струйки Концентрация, оставшаяся неизменной, моль/л Водный потенциал, кПа 1 М раствора сахарозы или KNO 3 , мл воды, мл 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 По результатам опыта делают вывод о возможности использования показателей водного потенциала для правильного выбора времени полива растений. Работа 13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДНОГО ПОТЕНЦИАЛА РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО МАКСИМОВУ И ПЕТИНОВУ Общие сведения. Метод основан на подборе раствора, концентрация которого не изменяется при погружении в него растительной ткани. В этом случае величина водного потенциала раствора равна водному потенциалу клеток листа. Материалы и оборудование. Листья фасоли, гороха, герани, 1 М раствор сахарозы. Сверла диаметром 0,6-0,8 см для выбивания дисков из листьев, резиновые пробки, стеклянные палочки, штативы с пробирками, пробки для пробирок, градуированные пипетки на 10 мл, фильтровальная бумага, рефрактометр. Порядок выполнения работы. В штативе расставляют 10 пробирок пять в верхнем и пять в нижнем ряду. Из 1 М раствора сахарозы в верхних пробирках приготовляют по 10 мл 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 М растворов сахарозы. В соответствующие пробирки нижнего ряда переносят из верхних по 2 мл жидкости ив каждую из них при помощи стеклянной палочки помещают по восемь или десять дисков, выбитых сверлом из листовой пластинки (минуя жилки. Пробирки закрывают пробками. Диски оставляют в растворах на 40-60 мин, периодически встряхивая пробирки. Затем вынимают диски, а пробирки вновь закрывают пробками. Для определения концентрации раствора сахарозы после нахождения в нем испытуемого материала можно пользоваться рефрактометрами РПЛ, Аи др. На призму рефрактометра стеклянной палочкой наносят по две капли сначала исходного, а потом соответствующего опытного раствора. Палочку и призму перед каждым новым определением протирают фильтровальной бумагой. Находят раствор, концентрация которого после пребывания в нем опытных объектов не изменилась. Если водный потенциал клеток больше водного потенциала одного раствора, но меньше другого, для расчета берут среднюю концентрацию между этими двумя растворами. Величину водного потенциала рассчитывают по формуле ψ w ткани = ψ w раствора = - RТсi, где R – газовая постоянная, равная 8,3 Дж/моль∙К; Т – абсолютная температура по Кельвину (о + комнатная с – изотоническая концентрация, М i – изотонический коэффициент [i=1+α(n-1)]. Результаты опыта записывают в таблицу 7 по приведенной форме. Определение водного потенциала рефрактометрическим методом Объект исследования Концентрация раствора сахарозы, М Показания рефрактометра, % Концентрация, оставшаяся неизмененной, моль/л Водный потенциал, кПа до опыта после опыта Работа 14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДНОГО ПОТЕНЦИАЛА РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ МЕТОДОМ ПОЛОСОК ПО |