Практикум по физиологии растений учебнометодическое пособие Казань
 Скачать 1.47 Mb.
|
|
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Что представляют собой фотосинтетические пигменты по химической природе 2. Чем отличается хлорофилла от хлорофилла b? 3. Какими химическими и физическими свойствами обладают хлорофиллы? 4. Какие спектры поглощения имеют фотосинтетические пигменты 5. Что такое флуоресценция Что она доказывает 6. Почему на свету изолированные хлоропласты способны осуществлять реакцию, в которой кислород выделяется, но СО не восстанавливается 7. Что такое чистая продуктивность фотосинтеза ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ Все жизненные процессы, протекающие в растительном организме, связаны с затратой энергии. Рост, питание, размножение, обмен веществ, процессы синтеза и распада органических веществ, прорастание, передвижение и поглощение веществ и т.д. связаны с затратой энергии. Это обусловлено тем, что живая клетка представляет собой открытую энергетическую систему и жизненные процессы в ней протекают только при условии притока энергии извне. Для поддержания жизненных процессов у растений имеется 2 источника энергии солнечная энергия, усваиваемая и запасаемая в процессе фотосинтетического фосфорилирования в АТФ. А также запасаемая в образуемых органических веществах в процессе фотосинтеза, в основном в углеводах, энергия которых используется растением в процессе их окисления, те. в процессе дыхания, при котором в митохондриях также она запасается в АТФ. Поэтому дыхание является процессом противоположным фотосинтезу и выражается следующим суммарным уравнением С 6 Н 12 О 6 + О СО + НО + 682 ккал (2824 кДж. Дыхание – сложный многоступенчатый процесс биохимического преобразования органического вещества с выделением энергии для процессов жизнедеятельности. В процессе дыхания образуется также целый ряд промежуточных веществ, идущих на синтез белков, жиров и других веществ. Таким образом, процессы обмена веществ и энергии, происходящих в клетке, неразрывно связаны с дыханием. Дыхание протекает, в основном, в митохондриях, при котором дыхательный субстрат окисляется не кислородом, а отнятием водорода (дегидрированием) с участием ферментов дегидраз и уже окислением водорода доводы с участием цитохромной системы, фермента цитохромоксидазы и кислорода воздуха по схеме где RH 2 – дыхательный субстрат Д – дегидразы. Часть образующихся в процессе дыхания восстановленных коферментов НАД могут использоваться на восстановление нитратов до аммиака, восстановительное аминирование кетокислот и т.д. Работа 28. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВУ ВЫДЕЛЕНИЯ СО Общие сведения. Наиболее общим показателем скорости окисления является интенсивность дыхания (ИД), о котором можно судить по поглощению кислорода, количественному выделению углекислого газа и окисленного органического вещества. Интенсивность дыхания и его энергетическая эффективность зависит от физиологического состояния растений, внешних условий. В свою очередь, интенсивность дыхания может, в известной мере, быть показателем уровня физиологической активности тканей исследуемого растения. Материалы и оборудование. Растительный материал различных частей растений или их физиологического состояния (проросшие и непроросшие семена, молодые и старые листья, листья и побеги, распускающиеся почки и побеги, цветки и листья и т.д.), 0,1 н. раствор барита, 0,1 н. раствор соляной или щавелевой кислоты, 1% раствор фенолфталеина. Весы, конические колбы на 250 мл с резиновыми пробками, и резиновые пробки с отверстием для титрования, нитки, марлевые мешочки или марлевые салфетки 15×15 см, бюретки для титрования, стеклянные воронки. Порядок выполнения работы. Метод заключается в учете количества СО, выделяемого органами растения придыхании и поглощении его баритом. Процесс поглощения диоксида углерода баритом можно записать в виде уравнения Ва(ОН) 2 + СО → ВаСО 3 + НО. Для этого в конические колбы на 250 мл с подогнанными резиновыми пробками по количеству изучаемых объектов быстро залить из колбы сифоном с зажимом по 10 млн. раствора Ва(ОН) 2 и внести по 2 капли фенолфталеина, сразу закрыть плотно резиновыми пробками. Отвесить по 5- 10 г исследуемого материала молодые и старые листья, распускающиеся почки и побеги, проросшие и не проросшие семена, цветки и листья и др, поместить их в маршевые мешочки или марлевые салфетки 15×15 см, завязав их ниткой, оставив длинный конец. Подвесить мешочки в колбы так, чтобы они не касались раствора барита, закрепив их за конец нитки, прижав к стенке колбы пробкой. Записать время для каждой колбы, когда они были закрыты пробкой. При использовании корковых пробок, необходимо заливать их парафином. Аналогично подготовить и контрольную колбу, в которую тоже налить 10 мл барита и 2 капли фенолфталеина, закрыть плотно пробкой. Колбы с объектами, содержащими хлорофилл, необходимо на все время опыта поместить в темноту для исключения процесса фотосинтеза. Время от времени колбы следует осторожно покачивать, чтобы разрушать пленку ВаСО 3 , препятствующую полноте поглощения СО, не допуская попадания ни одной капли раствора на мешочек с материалом. Через 30 минут вынуть материал, быстро закрыть колбу пробкой и отметить время окончания опыта. Провести титрование оставшейся щелочи, приливая из бюретки каплями через отверстие в пробке 0,1 н. щавелевую или соляную кислоту до исчезновения розового окрашивания. Чтобы избежать уменьшения концентрации раствора барита из-за поглощения углекислоты из воздуха, следует провести титрование колб, используя для титрования пробку с отверстием. Контрольную колбу можно титровать через 20 минут после наливания раствора барита. Результаты опыта записывают в таблицу 17 по приведенной форме. 17. Интенсивность дыхания Объект Навеска, г Объем В а(ОН) 2 , мл Время опыта Расход 0,1 н. НС, мл Поправка к титру НС Интенсивность дыхания, мг гч начало конец продолжительность опытами н контроль опыт Интенсивность дыхания определяется количеством выделенного мг СО 2 на г растительной массы за час, по формуле мг/г/час, 60 2 , 2 ) ( ИД t p K b a где а – количество 0,1 н соляной или щавелевой кислоты, израсходованной на титрование барита в контрольной колбе b – результат титрования опытной колбы К – поправка к титру соляной или щавелевой кислоты 2,2 – количество мг СО, эквивалентное 1 млн соляной или щавелевой кислоты р – масса растительного материла, г t – продолжительность опыта в минутах 60 – для перевода времени на час. Сделать выводы об интенсивности дыхания различных органов растения в зависимости от их физиологического состояния. Работ 29. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОГО КОЭФФИЦИЕНТА ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН Общие сведения. Дыхательный коэффициент (ДК) – это объемное или молярное отношение СО, выделенного придыхании, к поглощенному за это время О (СО 2 /О 2 ). ДК служит характеристикой калорийности субстрата, те. его энергоемкости. Степень энергоемкости зависит от вида дыхательного субстрата и степени его окисленности. Придыхании могут использоваться жиры, белки, углеводы и органические кислоты. Чем больше окислен материал, тем меньше поглощается кислорода воздуха, а значит и меньше выделяется энергии. Поэтому, при нормальном доступе кислорода величина ДК зависит от субстрата дыхания. Если в процессе дыхания используется углеводы, то ДК равен единице. Это видно из уравнения С 6 Н 12 О 6 + ОНО+ СО, в котором отношение 6СО 2 /6О 2 равно 1. При окислении жирных кислот и белков ДК будет меньше единицы. Они менее насыщены кислородом, и на их окисление идет больше О. Например, окисление масляной кислоты СН 3 -СН 2 -СН 2 -СООН + ОНО+ СО, имеет отношение 4СО 2 /5О 2 равное 0,8, те. меньше единицы. При использовании более окисленных органических кислот, например щавелевоуксусной кислоты, ДК больше единицы С 4 Н 4 О 5 + ОНО + СО, соотношение 4СО 2 /2,5О 2 равно 1,6. Поэтому, как более калорийный субстрат для дыхания, в качестве запасного вещества жиры составляют более 80% видов растений. Жиры обладают и другими преимуществами низкий удельный весне гигроскопичность. Материалы и оборудование. Наклюнувшиеся семена (подсолнечника, клещевины, гороха, пшеницы, 20-ный% раствор КОН, окрашенная вода в химическом стаканчике. Прибор, состоящий из пробирки с хорошо притертой резиновой пробкой, в которую вставлена изогнутая под прямым углом тонкая стеклянная трубка горизонтальное колено трубки градуируют, прикрепляя к ней при помощи резиновых колечек полоску миллиметровой бумаги. Штатив для пробирок, фильтровальная бумага, фарфоровые чашки, пинцеты, пипетки, секундомер или песочные часы. Порядок выполнения работы. Помещают в пробирку (примерно до половины) наклюнувшиеся семена (подсолнечника, клещевины, гороха, пшеницы) закрывают ее пробкой, в которую вставлена изогнутая градуированная трубка. Рис. 11. Прибор для определения дыхательного коэффициента 1 – пробирка 2 – резиновая пробка 3 – трубка с измерительной шкалой 4 – капля окрашенной воды Прежде вводят в трубку каплю окрашенной жидкости, для этого погружают наружный конец трубки в окрашенный раствори зажимают пальцем противоположный конец и вставляют, держа трубку горизонтально, в пробирку (рис. 11). Вовремя опыта обязательно поддерживают постоянную температуру. Для этого ставят прибор в штатив или колбу и не нагревают руками. Отмечают положение внутреннего мениска капли и засекают время по секундомеру. После пятиминутной экспозиции измеряют расстояние, пройденное каплей, и делают второй отсчета еще через 5 минут – третий. Вычисляют среднее расстояние, пройденное каплей за 5 минут (А, которое соответствует разности между объемами поглощенного кислорода и выделенной углекислоты. Открывают пробку с семенами и вкладывают в нее пинцетом свернутую в кольцо полоску фильтровальной бумаги, смоченную 20%-ным раствором едкого натра. Закрывают пробирку пробкой с трубкой с каплей окрашенной жидкости. Отмечают положение мениска при пятиминутных интервалах и вычисляют среднюю величину (В. Обозначают объем поглощенного кислорода через В, т.к. весь выделяемый диоксид поглощается щелочью, а объем выделенной углекислоты определяют через А, как разницу между поглощенным О и выделенным СО. Зная величины Аи В, находят дыхательный коэффициент АО СОВ О СОВА Отсюда дыхательный коэффициент В А) (В О СО ДК 2 Результаты опыта записывают в таблицу 18 по приведенной форме. 18. Дыхательный коэффициент прорастающих семян Условия опыта Отсчеты, мм, за 5 минут В А) (В ДК 1 2 3 среднее Без щелочи (АС щелочью (В) Делают вывод о зависимости величины дыхательного коэффициента от характера окисляемых веществ. Производят теоретический расчет дыхательного коэффициента при окислении до СО и НО какого-либо жира, например, триолеина, имеющего формулу С 57 Н 104 О 6 ФЕРМЕНТЫ ДЫХАНИЯ Дыхание – это сложный окислительно-восстановительный процесс, который осуществляется при участии комплексной системы ферментов. Ферменты, катализирующие непосредственно окислительно- восстановительные превращения дыхательного субстрата, разделяются наряд групп. Дегидрогеназы (дегидразы), ферменты катализирующие дегидрирование субстрата, те. отнятие водорода и электрона от субстрата дыхания. Они активируют водород субстрата. Другие способствуют его переходу на соответствующий акцептор с более высоким редокс- потенциалом, например, кислород. Такие дегидрогеназы называют аэробными дегидразами или оксидазами, т.к. они выполняют оксидазные функции, переводя протон водорода и электрон на кислород. Анаэробные дегидрогеназы переносят водород и электрон на промежуточные переносчики водорода. По химической природе дегидрогеназы бывают пиридиновыми и флавиновыми. Это сложные ферменты, состоящие из апофермента (белковый носитель, определяющего их специфичность к определенному субстрату, и кофермента (небелковая часть, определяющим активность фермента. У пиридиновых коферментом служит НАД (никотинамидадениндинуклеотид) или НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). В составе флавиновых дегидраз присутствует рибофлафин (витамин В, который образует кофермент ФМН (флафинмононуклеотид) и ФАД (флавинадениндинуклеотид). Оксидазы катализируют перенос электронов на кислород. Катализируемый ими процесс представляет конечный этап окисления – передачу электрона и протона на кислород воздуха, с образованием НО или перекиси водорода – НО. Среди оксидаз большое место занимают ферменты, содержащие Fe (железопротеиды) и С (медьпротеиды). Железопротеиды: гемоглобин, каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза и цитохромы вцепи переноса электрона могут осуществлять различные реакции. К медьпротеидам относятся полифенолоксидазы или фенолоксидазы, а также аскорбиноксидаза. Полифенолоксидазы окисляют фенолы с образованием хинонов, в результате чего водород фенолов соединяется с кислородом, образуя НО. Познакомимся с работой некоторых дыхательных ферментов. Работа 30. ОБНАРУЖЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ В СЕМЕНАХ ГОРОХА (ФАСОЛИ) Общие сведения. Растительные дегидрогеназы можно обнаружить с помощью некоторых химических соединений, например, метиленовая синь, имеющих в окисленном состоянии цветные молекулы. В восстановленном состоянии (те. присоединив водород) молекулы этих веществ становятся бесцветными. Эти соединения используются для обнаружения дегидраз. Материалы и оборудование. Набухшие суточные семена фасоли гороха, темно-синий водный раствор метиленовой сини. Нагретая водяная баня до 25-30 о С, пробирки, спиртовки, спички, резиновые пробки для пробирок. Порядок выполнения работы. С семян набухшего гороха (фасоли) снимают кожуру. Часть семян убивают кипячением в течение 10 минут (на спиртовке в пробирке. Затем живые (опытные) и убитые (контрольные) семена помещают в две пронумерованные пробирки ив течение 5-10 минут окрашивают водным раствором метиленовой сини. Окрашенные семена промывают и заливают водой для создания анаэробных условий, так как дегидразы работают в анаэробных условиях. Пробирки закрывают пробками и ставят в термостат или на водяную баню при температуре 25-30 о С. Через некоторое время в опытной пробирке семена теряют синюю окраску. Последнее происходит потому, что дегидразы, участвующие вдыхании клеток, отняли и активизировали водород дыхательного материала (окисление дыхательного материала) и затем передали водород метиленовой сини, которая восстановилась и обесцветилась. В контрольной пробирке цвет семян остается синим, т.к. при кипячении семян дегидразы разрушились. Описать результаты опыта и объяснить полученные результаты о работе дегидразы семян исследуемой культуры. Работа 31. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ Общие сведения. Пероксидаза играет важную роль в окислительно- восстановительных процессах, протекающих в растительном организме придыхании и брожении, те. она является дыхательным ферментом. Она способна окислять органические соединения лишь с помощью каких либо органических перекисей. В растениях перекись водорода образуется под действием оксидаз (полифенолоксидаза, монофенолоксидаза). Пероксидаза вместе с перекисью водорода образует комплексные соединения, в результате чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода. Она может окислять полифенолы и некоторые органические амины. Например, под действием пероксидазы и перекиси водорода гидрохинон переходит в интенсивно буро окрашенный хинон. ГИДРОХИНОН + НО пероксидаза ХИНОН + НО Материалы и оборудование. Клубни картофеля, 1%-ный раствор гидрохинона, 3%-ный раствор перекиси водорода, вода. Скальпели, пипетки, пластиковые тарелки. Порядок выполнения работы. Из клубня картофеля поперек нарезают 4 пластинки толщиной 3-4 мм и раскладывают на пластиковой тарелке. На срез первой пластинки картофеля (носитель пероксидазы) наносят только воду, на ю только гидрохинон, на ю только НО, на ю перекись водорода и гидрохинон. При окислении гидрохинона в хинон происходит интенсивное побурение среза. Слабое побурение среза наблюдается и без нанесения гидрохинона и перекиси водорода, оно не связано с действием пероксидазы, которая проявляет активность только в присутствии перекиси водорода, это происходит в связи с действием полифенолоксидазы, окисляющей полифенолы с участием молекулярного кислорода. Результаты опыта записывают в таблицу 19 по приведенной форме. 19. Наличие пероксидазы в запасающих тканях картофеля Вариант Картофельный срез носитель пероксидазы) Гидрохинон Н 2 О 2 Окраска среза 1 + – – 2 + + – 3 + – + 4 + + + Объяснить особенности работы фермента пероксидазы, исходя из результатов опыта. Работа 32. ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В ЛИСТЬЯХ ЭЛОДЕИ РАЗНОГО ВОЗРАСТА Общие сведения. В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, как активная форма кислорода (АФК), оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии ферментов каталазы, разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению O O 2H O 2H 2 каталаза Существует ряд методов определения активности каталазы в растении. Наиболее наглядными доступным демонстрационными в тоже время, дающим возможность определить изменение активности фермента, служит опыт наблюдения за активностью каталазы в листьях элодеи под микроскопом. Материалы и оборудование. Веточка элодеи канадской (Elodea canadensis Michx.), 3%-ный раствор перекиси водорода. Предметные и покровные стекла, пинцеты, микроскоп. Порядок выполнения работы. На предметное стекло наносят каплю 3%- ной перекиси водорода. В каплю помещают разрезанные пополам поперек старый и молодой лист срезами друг против друга на небольшом удалении, чтобы они вмещались в поле зрения микроскопа при малом увеличении, накрыть покровным стеклом и сразу рассматривают препараты под микроскопом. Перекись водорода проникает в клетки листа элодеи и расщепляется в ней каталазой, что видно по бурному выделению из среза пузырьков кислорода. Сделать вывод об активности каталазы в молодых и старых листьях элодеи. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. В чем принципиальное отличие между окислением при горении и окислением дыхательного субстрата при клеточном дыхании 2. Какой класс ферментов участвует в процессах дегидрирования дыхательного субстрата 3. Какова роль цитохромной системы и кислорода воздуха придыхании. Что такое интенсивность дыхания и дыхательный коэффициент 5. Ферменты дыхания, их роль и значение. МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ Растения как живые организмы успешно растут и развиваются, если имеют все необходимые условия для жизни свет, воду, воздух, пищу. Питательные вещества нужны всем организмам, так как они – источник энергии. Без притока энергии не могут осуществляться жизненно важные процессы в клетках, тканях ив организме в целом. Поэтому питание – необходимое условие для существования растений. Растительный организм с помощью корней и листьев добывает пищу в почвенной и наземной среде рис. 12). С помощью корней растение извлекает из почвы необходимые ему минеральные вещества – так осуществляется минеральное (почвенное) питание. Рис. 12. Схема минерального |