Практикум по молекулярной генетике учебнометодическое пособие Казань 2016
 Скачать 1.01 Mb.
|
|
1.7 Выделение ДНК из растительных тканей При выделении ДНК из тканей растений важным фактором является эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических разрывов вцепи. Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и еѐ количественным выходом, ведь молекулы ДНК – самые крупные полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из клеток – это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания двухвалентных катионов. От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. После депротеинизации препарат всѐ ещѐ сильно загрязнѐн полисахаридами. Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (cetyl trimethyl мм bromid) и SDS (sodium dodecyl sulfate). Метод с использованием С (Rogers, Bendich, 1985) позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе стем растворимые комплексы со CTAB. При снижении концентрации соли ниже М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов нуклеиновая кислота, тогда как большая часть 12 полисахаридов остается в растворе. Осадок снова растворяют в высокосолевом растворе Ми высаживают ДНК спиртом. Другая методика также предусматривает использование детергентов, в частности SDS, который также осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов (при этом инактивируются нуклеазы. Ниже приведена модификация одного из таких методов, изначально разработанного Делапорта с соавт. (Dellaporta et al., 1985). Белки и полисахариды в растительных экстрактах при С образуют комплексы си выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Высокомолекулярная ДНК, очищенная впоследствии от белков фенолом, осаждѐнная спиртом и растворѐнная в соответствующих буферах, пригодна для рестрикции и ПЦР. 1. Приготовить навеску 200 мг листьев растений, замороженных заранее при –20 Св морозильнике, либо быстро заморозить навеску в жидком азоте. 2. Образцы растереть в предварительно охлаждѐнной фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Если нет жидкого азота, то при растирании к замороженным листьям необходимо добавить 0.1 г оксида алюминия или прокалѐнного белого речного песка в качестве абразива. В ступку при этом нужно добавить немного буфера для экстракции ДНК (300 мкл. Альтернативно, можно растирать в специальных гомогенизаторах – риболайзерах. 3. Добавить в ступку 700 мкл буфера для экстракции, снова перемешать. 4. Перенести растѐртую массу в 1.5 мл микропробирку так, чтобы объѐм составлял примерно 700 мкл (на пробирке есть метка 0.75 мл. 5. Перемешать и инкубировать гомогенат при 65 Св течение 10 минут. 6. Добавить 220 мкл ацетата калия и поместить пробирку на лѐд на 20 минут. 7. Центрифугировать пробу в течение 3 минут при скорости 10000 об/мин. Перенести супернатант (надосадочную жидкость) вчистую пробирку. 8. К супернатанту добавить равный объѐм изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 минут при 10000 об/мин для осаждения ДНК. 9. Осадок ДНК промыть 70% этанолом, растворить в 200 мкл буфера ТЕ. 10. Провести процедуру фенольной депротеинизации образца. Для этого внести в пробирку с раствором ДНК равный объѐм фенол–хлороформной смеси, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать. Отобрать водную фазу верхний слой) вчистую пробирку, не захватывая интерфазу. Повторить туже процедуру со смесью хлороформ–изоамиловый спирт. Отобрать водную фазу с ДНК вчистую пробирку. 11. Высадить ДНК в 2.5 объѐмами холодного 96% этанола, предварительно прилив к образцу 1/10 объѐма М ацетата K (рН 5.0) или Na (pH 5.2). 13 12. Пробу центрифугировать в течение 10 мин на максимальной скорости. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. 13. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 50 мкл буфера ТЕ. 1.8 Выделение ДНК из крови с помощью смолы Chelex Основная процедура выделения включает в себя очистку от металлосодержащих соединений и протеинов с последующим кипячением образца в присутствии Chelex 100, затем супернатант непосредственно добавляют в ПЦР смесь. 1. В центрифужную пробирку на 2 мл вносят 1 мл стерильной дистиллированной воды и добавляют 5 мкл крови или 3 мм материала с засохшей кровью. Тщательно перемешивают. 2. Инкубируют при тщательном перемешивании 20 мин при комнатной температуре (лучше всего использовать ротатор для центрифужных пробирок. 3. Центрифугируют при 10 000 g 3 мини удаляют супернатант, оставляя чтобы не взмутить осадок клеток или ткань) 20-30 мкл. 4. Добавляют 5% раствор Chelex-100 до конечного объема 200 мкл (Chelex в натриевой форме, 5% раствор в стерильной дистиллированной воде. Перед добавлением смолу перемешивают до гомогенного состояния пипеткой с широким отверстием. 5. Инкубируют при 56 С 30 мини встряхивают в течение 10 сек. 6. Кипятят образец 8 мин при 95 С, встряхивают в течение 10 секи центрифугируют при 10 000 g 3 мин. 7. Для ПЦР берут из полученного супернатанта 20 мкл. 14 Растворы 1. Среда LB 2. Буфер TE. 10мМ Т, pH 8.0; 1мМ ЭДТА. 3. Насыщенный буфером фенол. В большинстве случаев фенол высокой степени чистоты можно использовать без дополнительной перегонки. Расплавляют фенол при 65 Св присутствии равного объема 0.1 М трис-HCl, рН 7.8-8.0, содержащего 0.2% 2- меркаптоэтанола (2-МЭ) ядовит, летуч, работать под тягой. Когда фенол полностью расплавится, тщательно перемешивают смесь, отбирают насыщенный фенол (жидкий, нижняя фаза. В таком виде фенол может хранится при 4 С до 1 мес, замороженный при -20 Св течение нескольких месяцев. 4. Смесь фенол–хлороформ-изоамиловый спирт. Водонасыщенный фенол, хлороформ и изоамиловый спирт смешивают в пропорции 25:24:1 по объему. 5. 10% SDS 6. 2M NaCl 7. 10 mM Трис HCl рН 8.0 8. Раствор I: 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl, pH 8.0, РНКаза А 9. Раствор II: Ми, смешать 1 мл М NaOH, 1 мл 10% SDS и 8 мл деионизованной воды 10. Раствор III: 3 М ацетат калия, М уксусная кислота (29 г ацетата калия, 11 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл воды 11. Раствор лизоцима в 10мМ Т, 20 мг/мл, хранить при -18 С. 12. TENS: 10 мМ Трис-HCL, pH 8.0, 1 мМ EDTA, 0.1 Н NaOH, 0.5% SDS; для приготовления 100 мл взять 1 мл 1 M Трис-HCL, pH 8.0, 200 мкл 0.5 M ЭДТА, pH 8.0, 5 мл 2 М NaOH, 5 мл 10% SDS, довести водой до 100 мл. 13. кратный буфер для внесения в лунку геля 1 мл 2х-кратный ТВЕ или ТАЕ буфер, 200 мкл 10% SDS, 600 мкл глицерина, 200 мкл воды, крупинка бромфенолового синего 14. Буфер SSC. 3M NaCl; 0.3M цитрат натрия, pH 7,0. Для приготовления концентрированного 20 SSC на 1 л нужно взять NaCl – 175.3 г цитрат натрия – 88.2 г. pH раствора доводить обычно не требуется 15. 0.2M ацетат натрия, pH 5.2. Готовится разведением М раствора 16. Буфер для экстракции. мм ЭДТА; мм ГЛАВА 2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса, пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд. Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, те. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам канала, отнесенной к его длине (В/с). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают различные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем, наличие сетки которого вносит важную дополнительную деталь в электрофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующую сетку геля, что увеличивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. Препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний размер пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот вообще не могут протиснуться через поры геля и их миграция прекратиться. В настоящее время используют полиакриламидный и агарозный гель. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели сочень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Входе электрофореза зоны макромолекул остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, ноне взаимодействуют сними. Краситель тоже передвигается в 16 электрическом полено уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чему молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца геля, электрофорез прекращают. Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси, кислоты выпадают в осадок в том месте, где закончилась их миграция входе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. Часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Кроме того, поскольку гель заливают в форму для полимеризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содержание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряжение электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования разных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их состава путем сравнения положения полос в параллельных треках. Разделение фрагментов ДНК происходит из-за наличия у них заряда. Фосфатные остатки у нуклеотидов придают всей ДНК негативный заряд. Это делает ее растворимой вводе и притягивают ее к положительному) электроду. Поэтому, если поместить ДНК в электрическое поле, то она будет двигаться от минуса к плюсу. Фрагменты ДНК, имеющие наименьшую длину, приближаются быстрее всего к + электроду, в то время как длинные фрагменты остаются максимально близко к минусу. Наиболее часто используют агарозный гель. Гели различаются по содержанию в них агарозы.Чем больше агарозы тем более мелкие фрагменты днк можно разделить. Увеличение концентрации агарозы в геле уменьшает скорость миграции днк и позволяет разделять малые фрагменты днк. Чем больше напряжение тем быстрее проходит форез - но слишком сильное напряжение нагреет буфера это недопустимо. Конформация ДНК тоже играет важную роль. Релаксированные кольцевые плазмиды (неразрезанные рестриктазами) двигаются с другой скоростью чем линейные или суперскрученные. Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, маркеры, содержащих линейные фрагменты ДНК известной длины. 17 Агароза – это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который получают из морских красных водорослей (Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia). Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0.3%. При температурах 84-96 С ау специальных типов – уже при 70 С) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – плавится. Растворы агарозы затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36-42 СУ легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30 С. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой - можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную агарозу предварительно охлаждают до 50-55 Си уже при этой температуре заливают в формы это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростатического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в следующем отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, находясь вводной фазе под действием электрического поля, мигрируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней – растворенные вводной фазе геля макромолекулы. Электрофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно заряженные макромолекулы, а эндосмос направлен в противоположную сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают специальной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0.5%. Типы агарозы, отличающиеся слабовыраженным эндосмосом, содержат менее 0.3% сульфата. Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и не специфическую сорбцию белков на агарозе, в результате чего полосы расплываются с образованием хвостов. Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции (-mr) – представляющего собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) исходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа. Некоторые типы агарозы по номенклатуре фирмы «Miles»: тип LE – малая степень эндосмоса -mr =0.1-0.15; 18 тип HE – сильно выраженный эндосмос -mr =0.23-0.26. Агароза с повышенными температурами плавления и гелеобразования тип HGT) имеет -mr <0,1, именно она чаще всего используется для обычного электрофореза. Специальная технологическая обработка введение оксиэтильных групп) позволяет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженными температурами плавления и затвердевания, например тип LGT, 1%-ный раствор такой агарозы остается жидким при физиологической температуре (37 С кроме того плавление геля можно осуществить при температуре более низкой, чем температура денатурации ДНК.Такую агарозу используют для дальнейшей экстракции ДНК из геля после его плавления. Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем буфере и нагревают до 90-95 С. Перед заливкой в форму раствор агарозы охлаждают до 50 С. Выбор концентрации агарозы, те. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель -фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют агарозные гели с концентрацией 0.4-2%. Ниже представлены примерные концентрации гелей агарозы в % для некоторых распространенных объектов фракционирования Таблица 1 – Выбор концентрации геля в зависимости от длины разделяемых фрагментов ДНК Агарозный гель Полиакриламидный гель (ПААГ) Концентрация агарозы, % Длина фрагментов ДНК, т.п.н. Концентрация акриламида, % Длина фрагментов ДНК, п.н. 0,3 5-60 3,5 1000-2000 0,6 1-20 5 80-500 0,9 0,5-7 8 60-400 1,2 0,4-6 12 40-300 1,5 0,2-3 15 25-150 2,0 0,1-2 20 6-100 Нуклеиновые кислоты обладают значительным по величине отрицательным зарядом, величина которого мало зависит от рН окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот. 19 Поэтому фракционирование идет за счет различия в размерах молекул. Выбор буфера в данной ситуации не играет существенной роли. Используют М Трис-боратный, 0.05 Трис-фосфатный (редко) и Трис-ацетатный буфер. Электрофорез нуклеиновых кислот сильно зависит от вторичной структуры. Двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. Однако для молекул с молекулярной массой больше 3.5 млн. дальтон ситуация обратная двунитевая молекула обладает достаточной гибкостью, чтобы проходить через сетку геля, в то время как однонитевая молекула той же длины сворачивается в хаотический клубок такого размера, что ее продвижение затрудняется. Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий могут иметь структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца - «сверхскрученое». Кольцо в целом сворачивается в жгут, что сильно увеличивает его компактность (суперскрученная ДНК. Если же хотя бы водной нити кольца имеется единичный разрыв, то жгут разворачивается, и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы становится меньше, размеры увеличиваются (релаксированная ДНК. Суперскрученная ДНК при электрофорезе всегда мигрирует быстрее релаксированой. Рестрицированная плазмида Нативная плазмида ДНК-маркер Рестрицированная плазмида Нативная плазмида Рисунок 1 – Пример электрофореза нативной (кольцевой) и рестрицированной плазмидной ДНК Во многих случаях электрофореза бывает желательно оценить молекулярные размеры фракционируемых нуклеиновых кислот. Для этого удобно иметь набор молекул того же типа, но известной длины. В настоящее время имеется большое количество коммерческих маркеров на основе фага лямбда или DNA ladders, дающие при электрофорезе ряд последовательных полос на треке, соответствующих фрагментам определенной массы (рисунок 2). Во многих коммерческих препаратах полосы соответствующие некоотрым 20 промежуточным длинам, например, 1 кб, 3 кб содержат большее количество ДНК и поэтому святятся интенсивнее, что облегляет идентификацию масс. Рисунок 2 – Пример маркеров длин ДНК В лунки геля наносится проба ДНК, уже содержащий индикаторный краситель. Форму с гелем, содержащим нанесенные образцы переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания (напряжение 1-15 В/см длины геля, и проводят электрофоретическое разделение ДНК в направлении от катода к аноду. Чемы ниже напряжение, тем выше разделяющая способность геля, полосы более четкие из-за меньшей диффузии, но электрофорез занимает больше времени. Контроль за электрофоретическим разделение осуществляется визуально по движению полосы красителя. По окончании электрофоретического разделения когда индикаторный краситель достиг края геля) вынимают гель из формы и просматривают в ультрафиолетовом свете с помощью УФ-трансиллюминатора желательно фотографируют. |