|
4.1 Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli методом теплового шока (химическая трансформация)
1. Колонию с чашки перенести в 2 мл В и инкубировать в течение ночи при 37 Сна качалке со скоростью 200 об/мин.
2. 100 мкл ночной культуры перенести в 10 мл среды LB, выращивать до ОП при 37 0
C на качалке со скоростью 200 об/мин (2-3 часа.
3. Клетки из 1.5 мл культуры собрать центрифугированием в стерильных эппендорфах в течение 1 мин при 13 тыс. об/мин.
4. Клетки ресуспендировать в 200 мкл стерильного раствора М СаСl
2
, поместить в лёд нач при температуре 4 С.
5. К 200 мкл компетентных клеток добавить ДНК и оставить в льду на 20 мин.
6. Клетки поместить в водяную баню или твердотельный термостат на
42 Сна мин.
7. Клетки перенести в лёд на 10 мин.
8. Добавить 800 мкл тёплого LB и инкубировать 1 ч при 37 С с качанием. Сделать высевы по 300-500 мкл на LВ-агар с соответствующим антибиотиком.
4.2 Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli методом
электропорации
1. Колонию с чашки перенести в 2 мл В и инкубировать в течение ночи при 37 Сна качалке со скоростью 200 об/мин.
2. 10 мл инокулята перенести в 100 мл LB и инкубировать с качанием при
37 С до ОП = 0.5-0.6 ( 2,5 часа. ВСЕ ДАЛЬНЕЙШИЕ МАНИПУЛЯЦИИ ПРОВОДЯТСЯ НА ЛЬДУ И ЦЕНТРИФУГАХ С ОХЛАЖДЕНИЕМ
3. Клетки собрать центрифугированием в течение 8 мин при 4400 rpm, супернатант слить.
4. Клетки отмыть 2 раза холодной (4 С) дистиллированной водой.
5. Клетки отмыть 2 раза холодным (4 С) 10% раствором глицерина в дистиллированной воде.
6. Клетки ресуспендировать в 5 мл ледяного, стерильного 10%-ного глицерина. Осторожно перемешать смесь.
7. Разаликвотить клетки порциями пол в эппендорфы, убрать в морозильник на -80 С.
8. Электропорационную кювету хорошо промыть (5 мин держать в дистиллированной воде, залить 96%, спирт вылить и поставить сушиться в
34 ламинар под ультрафиолетовые лучи. Перед работой кювету поставить в лед на 10 мин. 9. Клетки медленно разморозить на льду, добавить ДНК (не более 5 мкл) и осторожно перемешать, перенести вхолодную кювету. 10. Условия электропоратора: i) Ec 1 для кювет 1 мм (напряжение 1,8 kV; длительность импульса 5,0 мс) ii) Ec 2 для кювет 2 мм (напряжение 2,5 kV; длительность импульса 5,0 мс) Протереть кювету и поставить ее в прибора. Установить параметры и нажать кнопку «Pulse». После звукового сигнала, снять кюветку. 12. После электропорации сразу в кювету добавить 400 л среды LB (37 С. Очень осторожно перемешать, перелить в эппендорф и инкубировать при 37 С 40 мин. 12 Пол культуры разлить на чашку с L-агаром и антибиотиком ампициллин - 100 мкг/мл, канамицин – 10 мкг/мл). 4.3 Трансформация плазмидной ДНК клеток B.subtilis методом голодания (Anagnostopolous et al., 1961). 1. Колонию с чашки перенести в 2 мл В и инкубировать в течение ночи при 37 Сна качалке со скоростью 200 об/мин. 2. 0.5 мл ночной культуры перенести в 4.5 мл среды Спицайзена I и выращивать 4,5 час при 37 0 C с качанием 200 об./мин. 3. 750 мкл культуры внести в 5 мл среды Спицайзена II, добавить 80 мкл MgSO 4 и выращивать 1,5 час при 37 С. 4. К 500 мкл компетентных клеток добавить ДНК (5 мкл, 1 мкг, инкубировать 1 ч при 37 0 C, затем на качалке со скоростью 200 об/мин при 37 Св течение 1.5 час. 5. посеять на LВ-агар с соответствующим антибиотиком.
35 Растворы Среда SpI
4.5 мл
25 мл
Среда SpII
5 мл
25 мл глюкоза
40% мкл мл глюкоза 40% мкл мл казаминовая к-та мкл мл
Казаминовая к-та мкл мл
L- триптофан мкл мл триптофан мкл мл солевая основа мкл мл солевая основа мкл мл дрожжевой эк-кт мкл мл
MgSO
4
x7H
2
O мкл мл
H
2
O мкл мл H
2
O мл мл на 10 мл H
2
O казаминовая кислота
0.2 г дрожжевой экстракт
0.5 г триптофан
0.05 г
MgSO
4
x7H
2
O
2 г Солевая основана мл H
2
O
K
2
HPO
4
x3H
2
O
9.2 г
KH
2
PO
4 3 г
(NH
4
)
2
SO
4 1 г О (цитрат Na)
1.2 г
36 ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Anagnostopolous, C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis [Text] / Anagnostopolous, C, Spizizen J // Journal of Bacteriology. -1961. –V.81. Р. 741-746. 2. Sambrook J., Russel D. Molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (v.1), Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; 3. Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство Учеб. пособие для студ. биол. фак. и фак. нано- и биомед. технол., обуч-ся по напр. Биология (020400)», «Биология-пед (050100)», Биотехнические системы и технологии (200100)», Медицинская физика (011200)» и по спец. Биоинженерия и биоинформатика (020501)». – Саратов Издательство Саратовский источник, 2013. – 84 сил. Генная инженерия растений Лаб. рук-во / Перс англ. Под ред. Дж. Дрейпера и др. М Мир, 1991; 5. Глик Б, Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и примененение. М Мир, 2002; 6. Клонирование. Принципы и методы клонирования. Режим доступа http://medicalplanet.su/genetica/137.html 7. Корниенко ИВ, Водолажский Д.И., Вейко В.П., Щербаков В.В., Иванов ПЛ. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел — Ростиздат, 2001. — 256 c. 8. Основы электрофореза. Режим доступа http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/w-o_pass/MMoB/18a.pdf 9. Перепечина ИО, Пименов МГ, Стегнова Т. В. Исследование объектов судебно-биологической экспертизы полимеразной цепной реакцией Методические рекомендации. - М ЭКЦ МВД России. - 24 с, 10. Учебно-методическое пособие к проведению лабораторных работ и контроля самостоятельной работы студентов по молекулярной биологии Академии биологии и биотехнологии ЮФУ. / ОШ. Карапетьян, ЕМ. Вечканов, И.А. Сорокина, Ростов- на-Дону: Изд-во ЮФУ, 2015. с | 
Скачать 1.01 Mb.