Практикум по молекулярной генетике учебнометодическое пособие Казань 2016
 Скачать 1.01 Mb.
|
|
2.1 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле 1. Готовят х TBE в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля. 2. Добавляют к 1 х TBE агарозу в количестве, необходимом для получения 0.8 – 2% раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. 1% гель является относительно универсальным. 3. Охлаждают смесь до +/- 50 С. За время охлаждения агарозы, подготавливают заливочный столики кювету для электрофореза. 21 Добавляют к раствору агарозы краситель (см. пи осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха. 5. Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставляют гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1-1.5 мм. 6. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин, затем осторожно удаляют гребенку и липкую ленту. Кювету с гелем помещают в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1хТБЭ. 7. Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с буфером для нанесения (5:1). Чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием-EtBr, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200 нг маркерной ДНК. Для построения стандартной кривой необходимо использовать маркерные фрагменты, длина которых примерно равна длине исследуемой ДНК. 8. Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК. для повышения точности определения размера маркерную ДНК наносят по обе стороны от исследуемой. 9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1 – В на 1 см геля. 10. Просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют. 2.2 Окраска ДНК При электрофорезе используется два типа красителей (лидирующие и флюоресцентные. В качестве лидирующих красителей используют бромфеноловый синий, оранжевый G, крезоловый красный, ксиленцианол. Эти красители движутся в том же направлении что и ДНК, нос разной скоростью (рисунок 3). Зная размер ДНК продукта, можно оценить его положение в геле по положению индикаторных красителей. Для детекции ДНК в геле используются различные флюоресцентные красители, которые способны связываться с двуцепочечной ДНК и светиться в ультрафилетовом свете. На сегодняшний день используются разные красители, которые различаются по чувствительности, стоимости и безопасности. Эти красители могут быть добавлены непосредственно в гель, и тогда гель сразу можно просматривать в трансиллюминаторе. Альтернативно, гель можно окрашивать после проведения электрофореза вводном растворе красителя. Так как все красители способны связываться с ДНК, они являются канцерогенами, и при работе сними используются перчатки. 22 Рисунок 3 – Лидирующие (индикаторные) красители для агарозного элеткрофореза в 1.2% геле в ТВЕ буфере (поданным Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ- излучением с длиной волны 290-330 нм. Это вещество способно встраиваться в двухцепочечные молекулы ДНК и флуоресцировать под ультрафиолетовыми лучами. При помощи цифрового фотоаппарата ДНК-фрагменты записываются и могут быть проанализированы. Бромистый этидий – сильный канцероген, способный проникать через кожу в организм, поэтому следует уделять особое внимание при работе с ним. Также не следует забывать, что бромистый этидий при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его ив форезный буфер. SYBR Green I является одним из наиболее чувствительных красителей, применяемых для детекции двуцепочечных молекул ДНК при электрофорезах в агарозных и полиакриламидных гелях. Чувствительность этого красителя приблизительно враз выше, по сравнению с наиболее распространенным до настоящего времени бромистым этидием (EtBr). При использовании трансиллюминатора с длиной волны 300 нм, с помощью SYBR Green I может быть детектировано 60 пг двуцепочечной ДНК. Кроме этого, SYBR Green I с успехом может применяться при окрашивании синтетических олигонуклеотидов в полиакриамидных гелях, при этом его чувствительность выше, чему враз. Краситель нуклеиновых кислот Midori Green относится к новому безопасному классу красителей, применяемых для визуализации двухцепочечных и одноцепочечных молекул ДНК, а также молекул РНК в агарозном геле. Эти красители нового поколения пришли на смену токсичному бромистому этидию (EtBr, потенциальный мутаген, который обычно используется в гель-электрофорезе для визуализации нуклеиновых кислот. 23 Modori Green Direct используется с голубым светом в гельдокументирующих системах, а также с обычными ультрафиолетовыми трансиллюминаторами. Пики длины волны возбуждения при этом получаются 290 нм и 490 нм, пик эмиссии – 530 нм. Краситель Midori Green Direct не является канцерогеном ив гораздо меньшей степени обладает мутагенными свойствами, чем бромистый этидий. Кроме того, Midori Green Direct не повреждает латексные перчатки и мембрану клеток и относительно безопасен для окружающей среды. Растворы 1. 10x TBE буфер (Tris-Borate-EDTA): 108 г Трис основного, 55 г борной кислоты, 9.3 г ЭДТА натриевой соли, довести до 1 литра деионизованной водой. рН 8.3 и не требует доведения. 2. 50x TAE , (Tris-Acetate-EDTA): 242 г Трис основного, 57.1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0.5M EDTA, довести до 1 литра деионизованной водой. Довести рН до 8.5. TAE буфер при нагревании (в отличие от ТЕ) "неустойчив" и чтобы все было ок, следует агарозу растворять вводе, а потом в этот раствор добавлять ТАЕ (х. 3. Агароза: для 1% геля - смешать 100 мл воды и 1 грамм агарозы в стеклянной посуде. Доведите раствор до кипения в микроволновой печи при высокой мощности. Вытащите сосуд из печи и размешайте до ресуспендирования осевшей агарозы. Охладите до температуры, комфортной для дальнейшей работы. В мерном цилиндре доведите объем дистиллированной водой до 100 мл. В форму для геля установите гребенку под будущие лунки. Влейте охлажденную агарозу в форму. 4. х буфер для внесения в лунку геля 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксиленцианол, 40% сахароза или 40% глицерин в х ТВЕ. 5. Бромистый этидий EtBr: для внесения в гель 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде. Для окрашивания гелей 0.1 мг/мл в дистиллированной воде. 24 ГЛАВА 3. КЛОНИРОВАНИЕ ДНК КЛОНИРОВАНИЕ в биологии подразумевает метод получения нескольких идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. Таким способом на протяжении миллионов лет размножаются в природе многие виды растений и животных. Сейчас термин клонирование обычно используется в более узком смысле и означает копирование клеток, генов, антител и даже многоклеточных организмов в лабораторных условиях. Появившиеся в результате бесполого размножения экземпляры по определению генетически одинаковы, однако и у них можно наблюдать наследственную изменчивость, обусловленную случайными мутациями или создаваемую искусственно лабораторными методами. В молекулярной генетике термин клонировать ген означает получить большое количество его копий in vivo. Клонирование фрагмента ДНК включает несколько последовательных этапов 1) Получение фрагмента ДНК (с помощью полимеразной цепной реакции, или рестрикции) 2) Встраивание клонируемого (чужеродного) фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (рестрикция и лигирование); 25 3) Проникновение этой конструкции в бактериальную клетку-хозяина генетическая трансформация 4) Идентификация клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, и их отбор (как правило, осуществляется на селективной среде) Получение необходимого количества клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (собственно клонирование. При необходимости индуцируют экспрессию клонированного гена в клетках-хозяевах и получают кодируемый им белок. 3.1 Определение концентрации нуклеиновых кислот Для многих методик манипуляции с ДНК (ПЦР, рестрикция, лигирование) необходимо знать ее концентрацию. Довольно часто количественную и качественную оценку препарату выделенной ДНК можно оценить при гель- электрофорезе, следующим, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной концентрации (с маркерами молекулярной массы, концентрация которых указывается в описании. Определить концентрацию ДНК, а также степень ее чистоты, можно с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240–290 нм с максимумом при 260 нм. Хромофорами служат азотистые основания нуклеиновых кислот, особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ свет примерно враз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – триптофан, тирозин и фенилаланин имеющих максимум поглощения при 280 нм. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей полученных при измерении 260 нм и 280 нм должно быть более 1,8. Оптическая плотность раствора нуклеиновых кислот при длине волны 260 нм, равная 1, соответствует 50 мкг/мл двухцепочечных ДНК и РНК, 40 мкг/мл одноцепочечных ДНК и РНК и 20 мкг/мл олигонуклеотидов. По известной оптической плотности раствора можно рассчитать концентрацию, мкг/мкл, по соответствующим формулам для двух цепей полинуклеотидов Ах разбавление х 0.05; для одиночных цепей ДНК Ах разбавление х 0.037; для одиночных цепей РНК Ах разбавление х 0.04; для олигонуклеотидов: Ах разбавление х 0.02, где А - разница оптических плотностей раствора нуклеиновых кислот и растворителя, которым практически всегда является стерильная деионизованная вода. 26 3.2 Рестрикция Эндонуклеазы рестрикции - это ферменты, которые распознают определенные участки на чужеродной ДНК и разрезают фосфодиэстеразную связь между нуклеотидами. Впервые подобный фермент был получен из E. coli разрезал ДНК в случайных сайтах. Сейчас используются рестриктазы типа II - они обладают только рестрикционной активностью, разрезают ДНК в строго определенных сайтах, не требуют АТФ для проявления активности. Сейчас коммерческие ферменты выпускаются с приложенным оптимальным буфером. Все фирмы – производители имеют свою систему буферов, поэтому необходимо смотреть подходящий буфер на сайте производителя, его концентрацию и условия рестрикции. За единицу активности рестриктазы принимают количество фермента, способное зач в оптимальных для него условиях полностью гидролизовать 1 мкг ДНК фага λ. Для проведения успешной рестрикции необходимо соблюдать ряд условий. 1) Использовать корректный буфер (прилагаемый к ферменту) 2) Количество ДНК От 1 до 10 мкг, поскольку большие количества ДНК увеличивают вязкость раствора, что приводит к ингибированию реакции 3) Количество фермента 1 единица на 1 мкг ДНК. Избыток фермента может приводить к неспецифическому распознаванию ДНК 4) Объем смеси от 10 до 50 мкл 5) Время рестрикции – 1-4 часа. В некоторых случаях допускается проводить рестрикцию в течение ночи малым количеством фермента. 1. В микропробирку внести 1 мкг плазмидной ДНК 2. Внести 3 мкл рестрикционного буфера 3. Внести рестриктазу в объеме, соответствующем 1 единице активности, 4. Довести объем смеси до 30 мкл деионизованной водой, и поставить в термостат на 2 часа. Результат рестрикции проверить методом электрофореза. 3.3 Дефосфорилирование ДНК При использовании только одной рестриктазы большинство молекул вектора будет залипать самана себя ив результате образуется большое количество исходного вектора, не несущего вставку. Чтобы избежать этого, проводят дефосфорилирование для удаления фосфатных групп с концов фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза эндонуклеазами рестрикции. Поскольку дефосфорилированные концы не сшиваются ДНК- лигазой, то такая обработка позволяет предотвратить самолигирование фрагментов ДНК, например, плазмидных векторов, предназначенных для 27 последующего клонирования. Наиболее часто используется щелочная фосфатаза из кишечника теленка (CIP). 1. На 50 мкл реакционной смеси добавить 5 мкл десятикратного буфера, 0.5-5 мкг ДНК, деионизованная вода – до 50 мкл, 1-2 мкл (5-10 ед) щелочной фосфатазы (порядка 1-2 ед. на 1 мкг ДНК. 2. Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 37°C. 3. Очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или путем экстракции фенолом-хлороформом с последующим высаживанием 96%-ным этанолом для удаления фосфатазы. Реакцию можно проводить прямо после реакции рестрикции, внося фосфатазу непосредственно в рестрикционную смесь. В некоторых случаях бывает удобно использовать термолабильную щелочную фосфатазу из A. undina P2. В этом случае необходимо инкубировать при 25°C!!! (Инкубация при 37°C приводит к частичной инактивации фермента. 3.4 Лигирование ДНК Лигаза (лат. ligāre — сшивать, соединять) — фермент, катализирующий соединение двух молекул ДНК с образованием новой фосфорноэфирной связи (лигирование). Буфер для лигирования как правило поставляется в комплекте с ферментом и содержит АТФ. Поэтому данный буфер не следует размораживать много раз во избежание распада АТФ. При первой разморозке буфера рекомендуется слегка нагреть его (до 35-37 Си несколько раз встряхнуть до полного растворения осадка. Затем расфасовать его небольшими объемами (20- 50 мкл) в отдельные пробирки, заморозить и использовать эти аликвоты не более 2-3 раз. Реакцию лигирования следует проводить в минимальном объеме (10-20 мкл) с целью увеличения концентрации концов ДНК, и, соответственно эффективности сшивки. Рекомендуемая концентрация концов ДНК – от 0.1 до 1 мкМ. Следует учесть, что эффективность сшивки выступающих липких концов выше, чем тупых концов. Соответственно, более протяженные липкие концы сшиваются лучше коротких. Стандартную реакцию лигирования можно проводить при 16 Св течение 0.5-2 час. Нов большинстве случаев наилучшие результаты достигаются при инкубировании реакционной смеси в течение ночи при 4-6 С. Соотношение сшиваемых фрагментов ДНК подбирается экспериментальным путем. Например, при необходимости сшивки векторной 28 плазмиды и фрагмента(ов) геномной ДНК можно использовать соотношения от 1:5 до 1:0.5, соответственно. 1. На 10 мкл реакционной смеси смешать Реакционный буфер (десятикратный) – 1 мкл Фрагмент ДНК 1 (0.1 мг/мл) – 1 мкл Фрагмент ДНК 2 (0.1 мг/мл) – 1-5 мкл мкл (100 ед) Т ДНК лигазы. Вода (Milli-Q) – до конечного объема 10 мкл 2. Инкубировать в течение 16 час при 4-6 С. 3. Полученная лигазная смесь используется для трансформации бактерий. 3.5 Полимеразная цепная реакция ПЦР – полимеразная цепная реакция, входе которой амплифицируются определенные участки ДНК. ПЦР была изобретена американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 году. Широкие возможности, сравнительная дешевизна и простота ПЦР позволили использовать этот метод генетического анализа в разных областях научных исследований. Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов. Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Праймеры подбираются по определенным правилам 1. Размер праймера должен быть 16-25 нуклеотидов. При маленьком размере происходит неспецифическое распознавание ДНК. 2. Разница в температуре плавления праймеров - не более 6 градусов. Упрощенный расчет оптимальной температуры отжига праймера ведут по формулам Tm = [(A+T)×2°C]+[(G+C)×4°C] если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований и Tm = 22+1.46×([2×(G+C)]+ (A+T)) если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований. Также можно воспользоваться сервисом от New England Biolabs http://tmcalculator.neb.com/ и Минского университета http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. 3. Количество остатков цитозина и гуанина должно быть 50-60 %. Для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC- основания. 29 4. Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными) и отсутствие комплементарности между концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров). Полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание З'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности. В настоящее время существует множество различных полимераз. В г. Т. Брок и Х.Фриз открыли Thermus aquaticus – грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию, а в 1976 г. из нее была впервые выделена Taq- полимераза. Данный фермент до сих пор активно используется в лабораториях, так как он относительно дешевый, неприхотлив к контаминации ДНК, обладает высокой процессивностью. Однако его нельзя использовать для клонирования, так как при синтезе данный фермент имеет низкую точность – в среднем наблюдается 1-2 мутации на 1000 нуклеотидов. В настоящее время на рынке предложены высокоточные полимеразы, такие как Phu полимераза, Phusion полимераза, Q-5 полимераза. Эти ферменты обладают 5’-3’ экзонуклеазной активностью, за счет которой способны исправлять собственные ошибки путем удления неправильно встроенных нуклеотидов. При их использовании точность синтеза составляет около 1 мутации на 10000 пар оснований. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) – строительный материал, используемый полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. ДНК-матрица – подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется. Циклический температурный режим В процессе реакции амплификации ДНК с ней происходит ряд событий, которые обеспечиваются определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов 1. Денатурация – это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур (95 С. 30 2. Отжиг – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК- мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Температуру отжига подсчитывают для каждого праймера отдельно, а затем устанавливают наиболее низкую из пары праймеров. 3. Элонгация (синтез. После отжига праймеров ДНК-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с конца праймера. Температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы фермента, которая с максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от конца праймера, связанного матрицей, и движется в направлении от 3' к 5' концу (как правило 72 С. Эти три этапа многократно повторяются – 25 и более разв зависимости от количества ДНК матрицы. Иногда в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиги элонгацию. Эффект плато Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает – достигается эффект плато. В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта плато влияют Утилизация субстратов (дНТФ и праймеров). Стабильность реагентов (дНТФ и фермента. Количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы. Неспецифические продукты и праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу. Концентрация специфического продукта за счет неполной денатурации при высокой концентрации ампликонов. 1) Приготовить ПЦР смесь - х буфер для полимеразы (поставляется вместе с ферментом) – 2.5 мкл - ДНК полимераза – 1 ед.активности - Смесь дНТФ (10 мМ раствор каждого) – 0.5 мкл - Праймер 1 (5 мкМ раствор) – 2 мкл - Праймер 2 (5 мкМ раствор) – 2 мкл - ДНК-матрица – 0.01 мкг - НО – до 25 мкл 2) Смесь смешать, сбросить на центрифуге, и поставить в амплификатор. 3) Примерная программа амплификации выглядит следующим образом 1-95 С – 4 мин (первичное плавление ДНК) 2-95 С – 30 сек (плавление ДНК) 31 3-50* С – 30 сек (отжиг праймеров, температура отжига рассчитывается по последовательности праймера 4-72 С – 60 сек (синтез ДНК, ** - время элонгации рассчитывается исходя из длины синтезируемого фрагмента, 1000 по. в минуту) Повторять пункты 2-4 30 раз 5-72 С – 5 мин (достройка незаконченных цепей ДНК) 32 ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов S– и формы. форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии эта форма патогенна для мышей. форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые клетки и живые клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма. В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот. Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены – факторы компетентности. Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация. В лаборатории трансформацию используют для введения в клетки бактерий рекомбинантной плазмидной ДНК, в данном случае плазмида реплицируется независимо от хромосомной ДНК и обеспечивает экспрессию целевых генов. Также можно вводить генетические конструкции, которые при рекомбинации с хромосомой способны встраиваться в нее и реплицироваться синхронно с ней (интегративные плазмиды), в таком случае на клетку приходится только одна копия гена. Также путем трансформации проводят нокаутирование генов – когда целевой ген заменяют на селективный маркерныей ген, например, ген устойчивости к антибиотику. Огромное количество биологических исследований начинается с того, что в клетку вносится чужеродный генетический материал. Это действие называется генетической трансформацией. Сего помощью можно получить генетически модифицированные организмы, включить и выключить отдельные гены, определить влияние какого-нибудь белка на какой-нибудь сложный процесс итак далее. |