Практикум по молекулярной генетике учебнометодическое пособие Казань 2016
 Скачать 1.01 Mb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет Институт фундаментальной медицины и биологии Кафедра генетики ПРАКТИКУМ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКЕ Учебно-методическое пособие Казань - 2016 2 УДК 577.21 ББК 28 Печатается по решению редакционно-издательсткого совета ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Учебно-методической комиссии Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, протокол №6 от 10 марта 2016, заседания кафедры генетики Института фундаментальной медицины и биологии Казанского Приволжского) федерального университета, протокол №2 от 2.02.2016, Рецензенты Кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, А.М.Марданова Каюмов АР. Практикум по молекулярной генетике. Учебно-методическое пособие / АР. Каюмов, О.А.Гимадутдинов – Казань Казань, КФУ, 2016. -36 с. В учебно-методическом пособии содержатся описания и протоколы стандартных методов выделения ДНК из различных клеток, электрофоретического разделения ДНК, полимеразной цепной реакции. Приводятся наиболее распространенные и общепринятые методики, не требующие дорогостоящих или редких реактивов и материалов, либо коммерческих наборов реагентов. Каждый метод содержит теоретическое описание и краткую характеристику, назначение метода, наиболее важные аспекты его практического использования, целевое назначение необходимых реактивов и оборудования, подробное последовательное описание стадий лабораторных операций. © Каюмов АР, Гимадутдинов О.А., 2016 © Казанский федеральный университет, 2016 3 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 4 ГЛАВА 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК 5 1.1 Выделение геномной ДНК из клеток бактерий методом фенол- хлороформной экстракции 6 1.2 Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Классический MiniPrep [Sambrook et al., 1989] 7 1.3 Доочистка плазмидной ДНК (miniPrep) из бактериальных клеток методом фенол-хлороформной экстракции 8 1.4 Быстрое выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток для электрофоретического анализа (Real fast MiniPrep) 8 1.5 Быстрое выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток для электрофоретического анализа методом фенол- хлороформной экстракции 9 1.6 Выделение ДНК из лейкоцитов крови 10 1.7 Выделение ДНК из растительных тканей 11 1.8 Выделение ДНК из крови с помощью смолы Chelex 13 Растворы 14 ГЛАВА 2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК 15 2.1 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле 20 2.2 Окраска ДНК 21 Растворы 23 ГЛАВА 3. КЛОНИРОВАНИЕ ДНК 24 3.1 Определение концентрации нуклеиновых кислот 25 3.2 Рестрикция 26 3.3 Дефосфорилирование ДНК 26 3.4 Лигирование ДНК 27 3.5 Полимеразная цепная реакция 28 ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ 32 4.1. Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli методом теплового шока (химическая трансформация) 33 4.2. Трансформация плазмидной ДНК клеток E.coli методом электропорации 33 4.3 Трансформация плазмидной ДНК клеток B.subtilis методом голодания (Anagnostopolous et al., 1961). 34 Растворы 35 ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 36 4 ВВЕДЕНИЕ Работы в области молекулярной генетики подразумевают манипуляцию фрагментами ДНК для исследования генетического аппарата организма, модификации его свойств путем введения измененной (рекомбинантной) ДНК, направленной или случайной модификации собственной ДНК организма и оценки влияния данных изменений на жизнедеятельность клетки. В основе подходов молекулярной генетики лежат современные физико- химические и биохимические методы, направленные на выделение геномной, плазмидной, митохондриальной или пластидной ДНК, манипуляций с ней с целью модификации, расшифровки последовательности, ее анализа. Для получения геномодифицированных организмов далее проводят манипуляции по введению ДНК в живые клетки-мишени с помощью различных подходов. В результате добиваются того, что ДНК встраивается в геномную ДНК благодаря рекомбинации, трансдукции или трансфекции. В учебно-методическое пособие включены описания и протоколы стандартных методов выделения ДНК из различных клеток, электрофоретического разделения ДНК, полимеразной цепной реакции. Приводятся наиболее распространенные и общепринятые методики, не требующие дорогостоящих или редких реактивов и материалов либо коммерческих наборов реагентов. Каждый метод содержит теоретическое описание и краткую характеристику метода, назначение этого метода , наиболее важные аспекты его практического использования, целевое назначение необходимых реактивов и оборудования, подробное последовательное описание стадий лабораторных операций. 5 ГЛАВА 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным основным) этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. При наличии выделенной ДНК, далее становятся возможными ее амплификация с помощью полимеразной цепной реакции – ПЦР), определение последовательности (секвенирование), рестрикционный анализ, клонирование, гибридизация. Все живые организмы делятся на про- и эукариот. В клетках бактерий, как правило, существует одна кольцевая хромосома размером от 0.4 до нескольких десятков миллионов пар оснований, упаковка которой достигается за счет суперскрученности. Дополнительно к ней в бактериях встречаются небольшие кольцевые молекулы ДНК – плазмиды. Количество их копий может варьировать от 1 (низкокопийные) до нескольких тысяч (мультикопийные) на клетку. У эукариот геном представлен несколькими линейными молекулами ДНК, которые упаковываются с помощью гистоновых белков. В общем случае, для выделения ДНК клетку необходимо разрушить тем или иным способом, а ДНК очистить от других клеточных компонентов. В случае эукариот, нужно отделить ДНК от белков, входящих в состав нуклеопротеидных комплексов хроматина. При этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз и максимально сохранить еѐ целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК при их изоляции из клетки неизбежно фрагментируются. Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы 1) лизис клеток или разрушение физическим, механическим способом 2) ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа 3) центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или хаотропный агент гуанидинизотиоцианат. Если нет необходимости в длинных целых фрагментах ДНК, клетки можно разрушить механическим способом путем перетирания со стеклом или речным песком в жидком азоте. Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые фирмы продают наборы реактивов для выделения ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых силикой SiO 2 . Некоторые коммерческие наборы предусматривают 6 сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенол- хлороформный метод экстракции ДНК считается стандартным. 1.1 Выделение геномной ДНК из клеток бактерий методом фенол- хлороформной экстракции 1. Культуру бактерий растить ночь на богатой среде (LB, питательный бульон БТН или МПБ) с качанием, 5 мл в пробирке. О выращивании бактерий можно посмотреть в руководствах по микробиологии. 2. Осадить клетки из 5 мл культуры в эппендорф: 1.5 мл культуры перенести в эппендорф, центрифугировать 1-2 мин при 13000 об/мин, надосадочную жидкость вылить, снова добавить 1.5 мл культуры и центрифугировать. Удалить дозатором всю надосадочную жидкость. 3. Ресуспендировать клетки в 500 мкл 10 мМ Трис HCl рН 8.0. Для грамположительных бактерий 3.1. Для разрушения клеточной стенки бактерий внести 25-50 мкл раствора лизоцима с концентрацией 20 мг/мл, инкубировать 20-60 мин при С, осторожно перемешивать переворачивая пробирку, суспензия должна стать более прозрачной и коричневее. В случае лактобацилл внести 100 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл, инкубировать 1-2 часа при С. 4. Вносить порциями по 10 мкл 10%-ный раствор SDS, осторожно перемешивать, переворачивая пробирку до достижения прозрачного раствора вязкой субстанции (SDS разрушает мембрану клетки и ДНК оказывается в растворе, делая его вязкими тягучим. Если раствор не стал вязким, то значит клетки не разрушились и дальше продолжать не имеет смысла. С ЭТОГО МОМЕНТА ВСЕ ДЕЛАТЬ В ПЕРЧАТКАХ И ПОД ТЯГОЙ 5. Внести 500 мкл смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1) и интенсивно потрясти, чтобы раствор стал как молоко. При этом происходит денатурация белков, переход жиров и липидов в органическую фазу. 6. Центрифугировать 10 мин на максимальной скорости 7. Перенести верхнюю фазу 450 мкл (НЕ ТРОГАЯ БЕЛЫЙ ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ СЛОЙ) в 1 мл изопропанола. При этом неизбежно уменьшается до 1/5 объѐма водной фазы. На практике лучше пожертвовать этим объѐмом сейчас, чем чистотой препарата впоследствии. Для получения высокоочищенной ДНК повторить п 2-3 раза. 7 8. Осторожно намотать ДНК (которая будет выглядеть как вата) на наконечник на 200 мкл, зубочистку или стеклянную палочку. Если ДНК выпало мало, осторожно перемешать содержимое эппендорфа и повторить наматывание ДНК. 9. Опустить наконечник/палочку с ДНК в раствор 96% этанола, затем подсушить. Пересушивать осадок нельзя, в полностью высушенном виде он становится практически нерастворим вводе. Обычно осадки сушат на открытом воздухе не более получаса, под потоком нагретого воздуха. Далее намотанную ДНК опустить в эппендорф с 200-400 мкл деионизованной воды или буфера ТЕ для растворения ДНК. 1.2 Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Классический MiniPrep [Sambrook et al., 1989]. 1. Культуру растить в течение ночи на богатой среде (LB, питательный бульон БТН или МПБ) с качанием, 3 мл в пробирке. 2. Осадить клетки из 3 мл культуры в эппендорф: 1.5 мл культуры перенести в эппендорф, центрифугировать 1-2 мин при 13000 об/мин, надосадочную жидкость вылить, снова добавить 1.5 мл культуры и центрифугировать. Удалить дозатором всю надосадочную жидкость. 3. Клетки ресуспендировать в 200 мкл раствора I. Для грамположительных бактерий 3.1. Для разрушения клеточной стенки бактерий внести 25-50 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл, инкубировать 20-60 мин при С, осторожно перемешивая, суспензия должна стать более прозрачной и коричневой. В случае лактобацилл внести 100 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл, инкубировать 1-2 часа при С. 4. Клетки перенести в ледяную баню и внести 400 мкл свежеприготовленного раствора II Ми. Раствор должен храниться в плотно закрытой таре, для исключения нейтрализации щелочи углекислым газом из воздуха. Осторожно перемешать переворачивая пробирку дополучения прозрачного вязкого раствора. На данной стадии происходит лизис клеток, и геномная ДНК оказывается в растворе в расплетенном виде, что и обуславливает вязкость раствора. На данном этапе важно не повредить ее интенсивным встряхиванием. 5. Добавить 300 мкл охлажденного раствора 3 М ацетата калия (29 г ацетата калия, 11 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл воды, осторожно перемешать переворачиванием и инкубировать при температуре -20 Св течение 20-30 мин. На данной стадии происходит смена рН раствора в кислую область и геномная ДНК выпадает в осадок в виде белых хлопьев. Плазмидная ДНК ввиду своего малого размера в осадок не выпадает. 8 6. Смесь центрифугировать на холоду при 12 тыс. об/мин в течение 15 мин для удаления преципитированной геномной ДНК. Иногда полезно разбить стадию на 2: центрифугировать 5 мин, затем пробы заново осторожно перемешать для полного смешения растворов, затем центрифугировать 10 мин. 7. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) перенести в чистый эппендорф (лучше дозатором. Проследить чтобы не было белых хлопьев – остатков геномной ДНК. Добавить 600 мкл изопропанола, перемешать и центрифугировать в течение 10 мин при 12 тыс. об/мин. 8. Супернатант вылить. Осадок промыть 96% этанолом (500 мкл внести в эппендорф и затем вылить, высушить при 65 Св твердотельном термостате и ресуспендировать в 20 мкл деионизованной воды или буфера ТЕ. 1.3 Доочистка плазмидной ДНК (miniPrep) из бактериальных клеток методом фенол-хлороформной экстракции. ВСЕ ДЕЛАТЬ В ПЕРЧАТКАХ И ПОД ТЯГОЙ 1. Плазмидную ДНК развести в 500 мкл деионизованной воды, внести 500 мкл смеси фенола и хлороформа (1:1) и интенсивно потрясти, чтобы раствор стал как молоко. 2. Центрифугировать 10 мин на максимальной скорости. 3. Перенести верхнюю фазу 450 мкл (НЕ ТРОГАЯ БЕЛЫЙ ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ СЛОЙ) в 1 мл изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 мин на максимальной скорости. 4. Осадок промыть 96% этанолом (500 мкл внести в эппендорф и затем вылить, высушить при 65 Св твердотельном термостате и ресуспендировать в 20 мкл деионизованной воды или буфера ТЕ. 1.4 Быстрое выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток для электрофоретического анализа (Real fast MiniPrep). Метод подходит для быстрой оценки наличия плазмиды, ее размера по сравнению с исходным вектором. Качество очистки ДНК достаточно для электрофоретического анализа, ноне более того. Удобно использовать для скрининга колоний. Иногда в геле видны рибосомальные РНК, поэтому необходимы отрицательный и положительный контроли. 1. Культуру растить ночь на богатой среде (LB, питательный бульон БТН или МПБ) с качанием, 3 мл в пробирке. 9 2. Осадить клетки в эппендорф: 1.5 мл культуры перенести в эппендорф, центрифугировать 1-2 мин при 13000 об/мин. Удалить надосадочную жидкость, оставив 50-100 мкл. 3. Клетки ресуспендировать дозатором или на вортексе в 300 мкл раствора TENS. 4. Инкубировать во льду 10 мин. 5. Добавить 150 мкл охлажденного раствора 3 М ацетата калия (29 г ацетата калия, 11 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл воды, размешать в вортексе. 6. Смесь центрифугировать на холоду при 12 тыс. об/мин в течение 10 мин для удаления преципитированной геномной ДНК. 7. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) перенести в чистый эппендорф (лучше дозатором. Проследить чтобы не было белых хлопьев – остатков геномной ДНК. Добавить 900 мкл 96% этанола, охлажденного до - 20 С, перемешать и центрифугировать в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин. 8. Супернатант вылить. Осадок промыть 96% этанолом (500 мкл внести в эппендорф и затем вылить, высушить при 65 Св твердотельном термостате и ресуспендировать в 20 мкл деионизованной воды или буфера ТЕ. 1.5 Быстрое выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток для электрофоретического анализа методом фенол-хлороформной экстракции. Метод подходит для быстрой оценки наличия плазмиды, ее размера по сравнению с исходным вектором. Качество ДНК достаточно для электрофоретического анализа, ноне более того. Удобно использовать для скрининга колоний. Недостаток – необходимость работать с фенолом необходим вытяжной шкафа также в геле видны рибосомальные РНК, поэтому необходимы отрицательный и положительный контроли. 1. Культуру растить ночь на богатой среде (LB, питательный бульон БТН или МПБ) с качанием, 1-3 мл в пробирке. 2. Осадить клетки в эппендорф: 0.5 мл культуры перенести в эппендорф, центрифугировать 1-2 мин при 13000 об/мин. Удалить надосадочную жидкость, оставив 50-100 мкл. 3. Внести 10 мкл кратного буфера для внесения, содержащего додецил сульфат натрия (SDS). Клетки ресуспендировать дозатором или на вортексе в остатках супернатанта. С ЭТОГО МОМЕНТА ВСЕ ДЕЛАТЬ В ПЕРЧАТКАХ И ПОД ТЯГОЙ 4. Внести 50 мкл смеси фенола и хлороформа (1:1) и интенсивно потрясти, чтобы раствор стал как молоко. 10 5. Центрифугировать 5 мин на максимальной скорости. 6. 10 мкл верхней фазы (НЕ ТРОГАЯ БЕЛЫЙ ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ СЛОЙ) использовать для электрофореза. 1.6 Выделение ДНК из лейкоцитов крови Выделение общей ДНК из животной клетки не представляет особой сложности, поскольку плазмалемма, ядерная и митохондриальная мембраны растворяются в присутствии анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS), а сложной клеточной стенки у животных в сравнении, к примеру с растениями, нет. Высвободить ДНК из ДНК-белкового комплекса можно с помощью протеиназ или хаотропных солей. Для этой же цели можно провести как ив случае с бактериями фенольную экстракцию ДНК. Другие вещества при последующем осаждении ДНК спиртом останутся в растворе, и избавиться от них несложно. ДНК можно выделить из любых тканей, клетки которых содержат ядра, но количественный выход из разных тканей может быть различным. Довольно часто для выделения ДНК используют кровь. Лейкоциты крови, в отличие от зрелых эритроцитов, содержат ядра. Общей ДНК, выделенной из 100 мкл цельной крови достаточно для проведения нескольких рестрикций, ПЦР и секвенирования. Митохондриальная ДНК и РНК также присутствуют в получаемом препарате. В приведѐнной ниже методике для освобождения ДНК от белков используется фенол. Под словом фенол биологи-молекулярщики часто подразумевают смесь водонасыщенного раствора фенола с хлороформом 1:1, а некристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование. 1. К 100 мкл цельной крови добавить 2 объема дистиллированной воды до конечного объѐма 0.3 мл. Тщательно перемешать и оставить на 15 минут. 2. Пробу центрифугировать в течение 10 минут, 5000 об/мин. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) слить. 3. Осадок клеток отмыть двойным объѐмом буфера SSC, добавив в пробирку 200 мкл кратного SSC. Перемешивание аккуратное. 4. Центрифугировать, как в п. Супернатант слить. 5. К осадку добавить 54 мкл М ацетата натрия и 6 мкл 10%-ного раствора SDS. Осадок клеток тщательно ресуспензировать, те. перевести в суспензию вновь с помощью микропипетки или вортекса. Инкубировать при Св течение 0.5–1 ч для прохождения лизиса (разрушения) клеток. 6. Добавить 2 объѐма буфера ТЕ и провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого внести в пробирку равный объѐм фенол–хлороформной смеси, хорошо встряхнуть и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний 11 слой) вчистую пробирку, не захватывая интерфазу – белый осадок на линии раздела фаз. 7. Повторить туже процедуру, что в п. 6, но со смесью хлороформ- изоамиловый спирт для удаления остатков фенола. 8. К очищенному от белков лизату добавить 1/10 объѐма раствора III, перемешать и высадить ДНК добавив два с половиной объѐма холодного 96% этанола и поместив образец на 1–2 часа в морозильную камеру при С. Можно оставить ДНК под спиртом на ночь. 9. Пробу центрифугировать в течение 10 мин при максимальной скорости микроцентрифуги. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом. 10. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 20 мкл буфера ТЕ. |