Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования. Правила сбора биоматериала при бактериологических исследованиях
 Скачать 42.08 Kb.
|
|
Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования. Правила сбора биоматериала при бактериологических исследованиях. Пробы при инфекционно-воспалительных процессах мочеполовой системы Общие требования: - не направлять на исследование более одного образца мочи от одного пациента в течение 24 часов; - предпочтительно исследовать утреннюю порцию мочи, при несоблюдении этого правила сбор мочи производить не ранее 4 часов после последнего мочеиспускания; - запрещается производить сбор мочи из судна, мочеприемника: из суточного количества; - перед отбором пробы производиться тщательный туалет наружных половых органов с применением мыла (женщины – промыть область наружных половых органов в направлении от лобка к заднему проходу при разведенных половых губах; мужчинам – вымыть половой член, отведя крайнюю плоть). Нежелательно использовать дезинфектанты, т.к. они могут сдерживать рост микроорганизмов в пробе. Забор материала: - сбор мочи производится в стерильные пробирки UriSwab со специальной губкой; - после тщательного туалета наружных половых органов выпустить немного мочи, приостановить мочеиспускание и подставить губку-тампон из пробирки UriSwab и продолжить мочеиспускание до полного смачивания губки-тампона (у женщин во время мочеиспускания наружные половые губы держать раскрытыми, у мужчин – крайнюю плоть держать оттянутой); - опустить смоченную мочой губку-тампон в стерильную пробирки UriSwab и плотно закрыть. Моча, стерильно полученная при катетеризации мочевого пузыря, надлобковой пункции и с использованием цистоскопа: переносится на губкутампон, который перемещается в пробирку и плотно закрывается. 3 Методика забора и доставки отделяемого женских половых органов В течение 24 часов перед исследованием исключить спринцевания, применение внутривагинальных терапевтических средств. Забор материала осуществляется стерильными сухими инструментами, до мануального исследования. Нельзя брать материал во время менструации. Материал из влагалища Получают до проведения мануального исследования, зеркало и подъемник вводят во влагалище, с помощью стерильной салфетки убирают избыток выделений и слизи, материал собирают с заднего свода или с патологически измененных участков стерильным зондом-тампоном, который затем помещают в пробирку с жидкой средой. Материал из цервикального канала Обнажают шейку матки с помощью зеркал и убирают избыток выделений и слизи стерильной марлевой салфеткой или ватным шариком, смоченным стерильным физиологическим раствором или дистиллированной водой; высушивают салфеткой. Тонкий стерильный тампон (входящий в состав транспортной системы) аккуратно вводят в цервикальный канал на глубину 1,0-1,5 см, и вращают 10 сек., извлекают, не касаясь стенок влагалища, и сразу же погружают тампон в транспортную среду. На исследование микоплазмы/уреаплазмы материал лучше забирать с помощью специальных цитощеток (зондов), но допускается использование сухих стерильных тампонов. Собранный материал помещается в питательную среду для микоплазм/уреаплазм. Транспортировка материала при температуре +4+8 ºС. Методика взятия материала при раневых (хирургических) инфекций Взятие исследуемого материала. Взятие материала при подозрении на раневую инфекцию осуществляет врач, как правило, при проведении перевязки или операции. Технология взятия образца для микробиологического исследования во многом определяется клинической ситуацией и не может быть унифицирована. Исследуемым материалом могут служить: экссудат, аспират из раны, мазки (тканевая жидкость, пропитавшая зондтампон) биоптаты и др. Направление для исследования собственно гноя или струпа не целесообразно. Подготовительные мероприятия Взятие материала врач осуществляет при соблюдении правил асептики. Кожу вокруг раны или над очагом воспаления обрабатывают 70º этиловым спиртом и 1-2% настойкой йода (ее обязательно надо смыть 70º этиловым спиртом либо другим разрешенным антисептиком) во избежание ожогов. При необходимости удаляют с помощью стерильной салфетки некротические массы, детрит, гной. Использовать растворы антисептиков для снятия повязки или обработки раневой поверхности до взятия материала нельзя. Взятие материала с помощью стерильного тампона: - материал забирают после туалета раны, совершенного вышеописанным способом; - пробы отбирают прокатывая зонд-тампон по раневой поверхности от центра к периферии в течении 5-10 секунд; тампон должен равномерно пропитаться тканевой жидкостью; манипуляцию необходимо проводить максимально осторожно, не травмирую ткани; появление даже следов крови свидетельствует о неудаче, так как кровь обладает бактерицидными свойствами; - тампон с материалом помещают в пробирку с транспортной средой. Взятие аспирата: - материал забирают после обработки кожи вышеописанным способом; - после высыхания дезинфектанта врач с помощью одноразового шприца объемом 3-5 мл и иглы № 22 или № 23 берет аспират из глубины раны. Если имеется везикула, берется жидкость и клетки у основания дефекта; 5 - если попытка взять аспират вышеописанным способом не удается, подкожно вводят стерильный физиологический раствор и повторно пытаются взять аспират; - при наличии в ране дренажей, отделяемое из них засасывают шприцем в количестве 1-2 мл; - аспират из шприца, сняв иглу, переливают в пробирку с транспортной средой. Взятие биоптатов: При сборе пробы в процессе операции кусочки ткани (3-5 куб. см) помещают в стерильный контейнер, пробирку или стерильную стеклянную емкость, добавив 3-5 мл стерильного физиологического раствора для предотвращения материала от высыхания. Методика забора и доставки отделяемого нижних дыхательных путей Мокрота: Свободно отделяемая (отхаркиваемая) мокрота – предпочтителен утренний сбор. Перед сборы пробы пациент, если это возможно, должен почистить зубы и сполоснуть рот и горло теплой кипяченой водой, если пациент не в состоянии сделать это сам, то туалет его ротовой полости осуществляют медицинские работники. Предупреждают больного, чтобы он не собирал в контейнер слюну или носоглоточное отделяемое. Пробу мокроты, полученную в результате глубокого кашля, собирают в специальный стерильный одноразовый контейнер с завинчивающийся крышкой или в специальным образом подготовленную стерильную банку. Пробу мокроты передают в лабораторию. Бронхоальвеолярный лаваж: - забор проб производит врач; - через бронхоскоп, введенный в периферический бронх, ввести отдельными порциями 5-20 мл стерильного физ.раствора (не более 5 мл физиологического раствора за 1 раз, аспирировать такое же количество в стерильную пробирку со стеклянными бусами); - закрыть пробирку, встряхнуть, немедленно доставить пробу в лабораторию; - каждую порцию помещают в отдельную пробирку, пробы маркируют, в направлении указать общий объем введенного физ.раствора. Соскоб с бронхов: - через биопсийный канал вводят телескопический двойной катетер с обработанным полиэтиленгликолем (или другим соответствующим реактивом) дистальным концом для предотвращения контаминации пробы; - собирают материал в стерильный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой или в транспортировочную емкость со средой для анаэробов или в стерильную стеклянную пробирку с тиогликолевой средой, плотно закрывающуюся пробкой. Транстрахеальная биопсия: - образцы получают введением бронхоскопа трансназально или трансорально неинтубированному больному или через эндотрахеальную трубку – у интубированного; - если возможно получают кусочки тканей 1-3 кв. см. Если очаг большой или их несколько, собирают несколько проб; - помещают пробу в транспортировочную емкость со средой или пробирку с тиогликолевой средой, закрытую стерильной резиновой пробкой. Методика забора и доставки отделяемого верхних дыхательных путей При подозрении на дифтерию, коклюш, хламидиоз, микоплазмоз, легионеллез, гонорею до доставки пробы информируют работников лаборатории, чтобы они подготовились к анализу такого вида материала. Зев: - забор материала производить натощак или не менее чем через 3-4 часа после приема пищи и полоскания горла дез.раствором и кипяченой водой; - прижимая язык шпателем, в полость рта ввести сухой стерильный тампон и, осторожно, не касаясь языка, снимают налет последовательно с одной миндалины, дужки, язычка, дужки, другой миндалины, задней стенки глотки; - не касаться зубов, слизистой оболочки щек, язык! - опускают тампон в пробирку с транспортной средой. Носоглотка: - тампон согнуть под тупым углом; - прижать язык шпателем, а загнутый кверху конец тампона заводят за язычок неба и снимают отделяемое с задней стенки глотки и хоан; - опускают тампон в пробирку с транспортной средой. Полость носа: - предварительно убрать корки, очистить носовые проходы сухим ватным тампоном; - приподнимая кончик носа, одним тампоном поочередно вращательными движениями со слизистой носовых ходов и перегородки (на расстоянии 1-2 см от края ноздрей) произвести забор отделяемого; - при наличии очагов воспаления или изъявлений материал собирают из них; - опускают тампон в пробирку с транспортной средой. Методика забора и доставка отделяемого ушей Наружное ухо: - кожу обрабатывают 70 % спиртом с последующим промыванием физ. раствором; - отделяемое из очага отбирают стерильным ватным тампоном; - опускают тампон в пробирку с транспортной средой. Среднее, внутреннее ухо: - отбирают материал с помощью пункции или во время операции из операционной раны, можно доставить в лабораторию в шприце с предварительно удаленным воздухом, образцы тканей – в емкости со средой для анаэробов. - Тимпаноцентез барабанной перепонки – для микробиологической диагностики инфекций среднего уха только в случае, если больной не отвечает на проводимую терапию или при торпидном течении катарального среднего отита даже при отсутствии экссудата в выступающей крови. Для получения пробы очищают наружный слуховой проход с помощью тампона, смоченного 70% спиртом, далее обработать стерильным физ.раствором. С помощью шприца собирают жидкость из барабанной полости. Для транспортировки материала засевается во флаконы для выделения анаэробов. Если барабанная перепонка повреждена, материал собирают зондом-тампоном с помощью зеркала, помещают его в транспортную среду. Методика забора и доставки отделяемого глаз Забор проб производит врач. За 6 часов до исследования отменить все медикаменты. Отделяемое собирают стеклянной палочкой или стерильным зондом-тампоном по слизистой оболочке нижней переходной складки, при наличии язвы роговицы – с язвы, при уголковой конъюнктивите – с уголков век. Пробы из каждого глаза собирают отдельным инструментом. Бактериологическое исследование отделяемого: - ватным тампоном отобрать отделяемое одного глаза, затем другим ватным тампоном – другого глаза; - забор производить со слизистой внутренней поверхности нижнего века в направлении от наружного угла глаза к внутреннему, при этом тампон не должен касаться ресниц (придерживать веки рукой). - Пробы помещают в пробирку с транспортной средой. Кровь на бактериологические исследования Рекомендуемая кратность получения гемокультур: - при остром сепсисе, артрите, менингите, остеомиелите, острой нелеченой бактериальной пневмонии, пиелонефрите, прочих септических состояниях: исследуется 2 гемокультуры из двух сосудов (или двух участков одного сосуда) перед началом а/б терапии; - при инфекционном эндокардите, и вялотекущем сепсисе с предполагаемой маленькой концентрацией (10-30 КОЕ/мл) возбудителя в циркуляции (варианты забора проб): 1. При остром процессе собирают 2 пробы в течении 1-2 часов подъема температуры ,поочередно из обеих кубитальных вен; при подостром и вялотекущем процессе – 3 пробы с интервалом в 15 и более минут. 2. При получении отрицательного результата – повторно, в течении 24 часов исследуют 3 и более гемокультур. 3. От пациентов, получающих антимикробную терапию, исследуют по 2 гемокультуры в каждый их 3 дней с положительной клинической динамикой терапии. При отрицательных результатах посевов пробы крови посылают на исследование иммунологических факторов системы защиты организма (иммунограмма с определением иммуноглобулинов, фагоцитарной активности нейтрофилов, NBT-тестов). Если больной страдает врожденным пороком сердца, следует помнить, что это продром инфекционного эндокардита, и в алгоритм обследования такого пациента включают определение иммунологических факторов. - при лихорадке неясной этиологии первоначально собирают 2 пробы из разных кровеносных сосудов (двух участков сосуда), затем через 24-36 ч еще 2 пробы на фоне повышения температуры тела (не на пике температуры!). 10 Время забора крови: - желательно в первые дни заболевания до назначения системных антибиотиков, если назначена а/б терапия – в течение 48 часов забрать все пробы; - если исследование производиться после введения антибиотиков, то производить забор крови необходимо перед следующим введением препарата, учитывая период его полувыведения, или через 24 часа после отмены антибиотика; - при развитии лихорадки забор крови производить так быстро, как только это возможно, не дожидаясь достижения пика подъема температуры, при правильных лихорадках – за 1 час до пика лихорадки. Методы забора крови: - локтевые вены; - бедренная артерия (по специальным показаниям забор производит врач); - катетер (при подозрении на катетер-ассоциированную инфекцию) – забрать кровь из катетера и из локтевой вены на бак.посев (в разные флаконы), дистальные отрезок катетера (тот, который находился максимально глубоко в вене) длиной 5 см отрезают в асептических условиях и помещают в стерильный широкогорлый сосуд с крышкой (на бак.посев), все образцы без промедления доставляют в лабораторию. Методика забора крови: 1. Объем засеваемой крови: - дети – 0,5 - 3 мл, дети первого года жизни – 1 мл в специальные педиатрические флаконы; - взрослые – 10 мл. Если забор крови производят на 2-й недели болезни и позднее – не менее 15-20 мл крови (при сборе крови в коммерческие флаконы «Bakt/ALERT» количество крови 10 мл – до метки). Соотношение количества крови и питательной среды всегда должно составлять не менее 1:10, т.к при этом условии снижается бактерицидное действие сывороточных факторов. Кровь, полученную от детей, вносят в специальную «детскую» бутылочку. Нельзя вносить более 3,0 мл крови в «детский» и менее 10 мл крови во «взрослый» флакон (результат будет недостоверен). 2. Обработка кожи: - место венепункции обработать стерильным ватным шариком, смоченным 70 % этиловым спиртом, экспозиция – 30 секунд, до высыхания; - нанести раствор йода (1-2 % настойка или 10 % повидон-йод) в виде круга диаметром 1,5-2 см, наносить круговыми движениями, начиная от центра, экспозиция – 30 секунд; для пациентов с аллергией на йод – использовать 70 % спирт, но экспозиция – 60 секунд, можно использовать другой дезинфектант, разрешенный для использования в этих целях; - не допускается пальпировать сосуд после обработки. 3. Подготовка флаконов и методика забора: - взятые в лаборатории коммерческие флаконы хранить при комнатной температуре в темном месте; - удалить пластиковую защитную пластинку на крышке коммерческого флакона; - обработать пробку коммерческого флакона 70 % эт.спиртом, экспозиция (не снимая тампона со спиртом) – 1 минута; - произвести забор необходимого количества крови, медленно ввести во флакон сразу после удаления тампона; - осторожными вращательными движениями перемешать содержимое флакона для предотвращения свертываемости крови; - обработать место венепункции 70 % спиртом для удаления остатков йода; - заполнить направление, дополнительно указав место (вена, артерия, катетер) и время забора образца крови ,заполнить прочие графы; - немедленно доставить в лабораторию; в вечернее и ночное время поместить в термостат в экстренной лаборатории. Нельзя помещать пробу крови в холодильник! При работе с флаконами с двойной средой: - стерильным шприцем собрать у взрослых 10 мл крови, у детей – 5 мл; - над пламенем спиртовки открыть флакон, ввести кровь во флакон из шприца, предварительно сняв иглу; - обжечь горлышко и пробку флакона в пламени спиртовки, закрыть флакон пробкой; - осторожно, чтобы не замочить пробку, перемешать его содержимое круговыми движениями. Кровь на РАЛ, РСК с антигеном Провачека, боррелиоз, на РПГА с сальмонеллезным и брюшнотифозным антигенами, иерсинеозными, дизентерийным антигеном, Vi-агглютинацию Из локтевой вены утром натощак с соблюдением правил асептики забрать 5 мл крови в стерильную центрифужную пробирку, заполнить направление. Отцентрифугировать кровь. Отделившуюся сыворотку поместить в другую стерильную пробирку, закрыть пробкой (для исследования крови на РПГА пробка должна быть ватно-марлевая). Методика отбора проб на диз.группу Необходимое оснащение: Хлопковые или вискозные зонды-тампоны на деревянной или пластиковой оси в составе транспортной системы со средой. Важно отметить, что попадание транспортных сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный тампон должен погрузиться в транспортную среду только после взятия материала. Взятие исследуемого материала: - взятие материала из прямой кишки с помощью зондов-тампонов осуществляется средним медицинским персоналом; - больного просят лечь на бок с притянутыми к животу бедрами и ладонями развести ягодицы; - Зонд-тампон вводят в задний проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси, собирают материал с крипт ануса; - осторожно извлекают зонд-тампон и погружают его в транспортную среду; транспортировка тампона без среды не допускается. 2. Правила оформления направления на бактериального исследование. Правила оформления направления на лабораторные исследования. Заявки на анализы должны быть согласованы со всеми врачами – специалистами, участвующими в лечении больного, чтобы при венепункции взять материал для всех необходимых исследований и не повторять процедуру. Медицинская сестра должна собрать все заявки данного пациента и дать суммарную заявку на анализы. Если пациент будет переведен в другое отделение, то она также должна предупредить лабораторию об этом, чтобы результаты исследований были направлены в нужное отделение и не утеряны. В направлении на лабораторные исследования (заявке) должны быть отображены следующие данные: - Ф.И.О. пациента - отделение, номер истории, номер палаты; - возраст, пол; - диагноз; - Ф.И.О. лечащего врача; - перечень необходимых исследований; - дата и время назначения; - дата и время взятия крови (сбора биологического материала) - подпись специалиста, проводившего взятие крови или другого биологического материала. Критерии для отказа в принятии лабораторией биоматериала на исследования: расхождение между данными заявки и этикетки (инициалы, дата, время и т.д.); отсутствие этикетки на вакуэтте, пробирке или любой другой емкости; невозможность прочесть на заявке и/или этикетке паспортные данные пациента, отсутствие названия отделения, номер истории болезни, фамилии лечащего врача, подписи процедурной сестры, четкого перечня необходимых исследований; гемолиз (за исключением исследований, на которые наличие гемолиза не влияет); взятый материал находится в несоответствующей емкости (т.е. материал взят не с тем антикоагулянтом, консервантом, без антикоагулянта и др.); наличие сгустков в вакуэттах с антикоагулянтом; наличие в материале посторонних примесей (кал с примесью мочи, слюна вместо мокроты и т.д.) Не принятые для исследования пробы отбрасывают с указанием причины. Лаборатория информирует лечебное отделение, взявшее материал, об отказе его исследовать и причинах отказа. Анализ критериев оценки качества проб и отказа в принятии материала на исследования позволяет идентифицировать основные причины ошибок и определить мероприятия по их устранению. Методы выделения чистых культур микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях. Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов: а) методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов; б) методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов. Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на одной из чашек вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма. Метод Пастера (метод разведений).Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 1 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число - количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала). Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды Метод Коха (метод заливок).Исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды с разведенным материалом переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т.д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала. Рассев петлей (посев штрихами).Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках. Метод фильтрации.Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин). Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов Создание оптимальных условий для размножения Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С). Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО2(кампилобактер, геликобактер). Метод обогащения. Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов. Метод Шукевича.Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Так, для выделения культуры Proteus vulgaris, Clostridium tetani материал засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенной плотной средой, не касаясь поверхности среды. Названные микроорганизмы способны давать ползучий рост (роение) на поверхности среды. Сопутствующие микробы растут в нижней части питательной среды, а протей и столбнячный микроб в виде пленки распространяются вверх и занимают всю скошенную часть агара. Метод прогревания.Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10—15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают. Бактериостатический метод (метод ингибирования).Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях. Необходимо учитывать, что селективные факторы часто включены в состав среды в бактериостатических концентрациях, поэтому сопутствующие микрооорганизмы остаются жизнеспособными и при переносе колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры. Метод заражения лабораторных животных. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным. Биопроба – метод, который позволяет не только выделить возбудитель из патологического материала, но также изучить вирулентность чистой культуры. Организм животного представляет собой биологический «фильтр», который в силу выраженности своих защитных свойств уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий. Биопроба проводится при выделении чистой культуры пневмококка, микобактерий туберкулеза, франциселл и т.п. Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность. Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод. Цель бактериологического методазаключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам. Бактериологический метод исследования включает: 1. посев исследуемого материала в питательные среды 2. выделение чистой культуры 3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду). Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований: I этап (работа с нативным материалом) Цель: получение изолированных колоний 1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре 2. Подготовка материала к исследованию 3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний 4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов II этап Цель: получение чистой культуры 1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний). 2. Микроскопическое изучение изолированных колоний 3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов). 4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях. III этап Цель: идентификация выделенной чистой культуры 1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается: морфология и тинкториальные свойства культуральные свойства (характер роста на питательных средах) биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов) серологические свойства (антигенные) вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии) патогенность для животных фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам) чувствительность к антибиотикам другие индивидуальные свойства IV этап (Заключение) По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре Первый этап исследований.Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды. При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности. Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора. Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная). Таблица 11. Схема изучения колоний
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа. Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии). Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию). При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина вмолекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.). Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных иконечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты. Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна. Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой. +При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки. Заключение Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур. |