biokhimia_Vosstanovlen (Восстановлен). Предмет и задачи биологической химии. Обмен веществ и энергии, сложная структурная организация, гомеостаз и самовоспроизведение как важнейшие признаки живой материи
 Скачать 2.96 Mb.
|
|
Аналоги фолиевой кислоты. В обмене нуклеотидов производные Н4-фолата как доноры одноуглеродных групп участвуют в формировании пуринового гетероциклического кольца и в ключевой реакции синтеза дТМФ из дУМФ, катализируемой тимидилатсинтазой. В последнем случае N5,N10-метилен-Н4-фолат служит донором метальной группы и в ходе реакции превращается в Н2-фолат. Для активного синтеза тимидиловых нуклеотидов Н2-фолат должен повторно использоваться, проходя стадию восстановления в Н4-фолат . Метотрексат и аминоптерин - структурные аналоги фолиевой кислоты - ингибируют дигидрофолатредуктазу и таким образом нарушают синтез пуриновых нуклеотидов и превращение дУМФ в дТМФ, снижая внутриклеточную концентрацию субстратов синтеза ДНК и РНК. Препараты широко используют в химиотерапии опухолей. Б. Антивирусные и антибактериальные препараты Азидотимидин (AZT, или зидовидин) представляет собой мощный противовирусный препарат, применяющийся в лечении инфекций, которые сопровождают приобретённые формы иммунодефицита. Будучи структурным аналогом тимид-на, препарат имеет в З'-положении дезоксирибозы азидогруппу . AZT может фосфорилироваться и с помощью ДНК-полимераз включаться в растущую молекулу ДНК. Однако присутствие в 3'-положении дезоксирибозы азидогруппы делает синтезирующиеся молекулы ДНК не способными к последующему удлинению. В результате образование новых молекул ДНК прекращается. Важно, что фосфорилированные производные AZT утилизируются более эффективно вирусной ДНК-полимеразой или так называемой обратной транскриптазой, чем ДНК-полимеразами эукариотов, поэтому препарат наиболее эффективно влияет на размножение вирусов и, в частности, ретровируса, вызывающего ВИЧ-инфекцию. 5-йоддезоксиуридин используют в терапии кератитов и поражений роговицы глаза вирусом герпеса. Азатиоприн в организме превращается в 6-меркаптопурин, который оказывает мощное иммуносупрессорное действие. Препарат широко используют в трансплантологии для предотвращения развития иммунологических реакций, вызывающих отторжение трансплантата. 27. Азотистые основания, входящие в структуру нуклеиновых кислот – пуриновые и пиримидиновые. Нуклеотиды, содержащие рибозу и дезоксирибозу. Структура. Номенклатура.   28. Первичная структура нуклеиновых кислот. ДНК и РНК–черты сходства и различия состава, локализации в клетке, функции. Первичная структура ДНК -порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи. Каждая фосфатная группа в полинукпеотидной цепи, за исключением фосфорного остатка на 5'-конце молекулы, участвует в образовании двух эфирных связей с участием 3'- и 5'-углеродных атомов двух соседних дезоксирибоз, поэтому связь между мономерами обозначают 3', 5'-фосфодиэфирной. Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5'-конце находится фосфатная группа, а на 3'-конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5'- и 3'-концами. Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращённо записывают с помощью однобуквенного кода, например -A-G-C-T-T-A-C-A- от 5'- к 3'-концу. В каждом мономере нуклеиновой кислоты присутствует остаток фосфорной кислоты. При рН 7 фосфатная группа полностью ионизирована, поэтому in vivoнуклеиновые кислоты существуют в виде полианионов (имеют множественный отрицательный заряд). Остатки пентоз тоже проявляют гидрофильные свойства. Азотистые основания почти нерастворимы в воде, но некоторые атомы пуринового и пиримидинового циклов способны образовывать водородные связи. Первичная структура РНК - порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5'-углеродного атома, на другом конце - ОН-группа 3'-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5'- и 3'-концами цепи РНК. Гидроксильная группа у 2'-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Так, в слабощелочной среде молекулы РНК гидролизуются даже при нормальной температуре, тогда как структура цепи ДНК не изменяется.
29. Вторичная структура ДНК (модель Уотсона и Крика). Связи, стабилизирующие вторичную структуру ДНК. Комплементарность. Правило Чаргаффа. Полярность. Антипараллельность. Вторичная структура ДНК. В 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спираль правозакрученная, полинуклеотидньхе цепи в ней антипараллельны, т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3'→5', то вторая - в направлении 5'→3'. Поэтому на каждом из концов Все основания цепей ДНК расположены внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов - снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счёт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи). При таком сочетании каждая пара содержит по три кольца, поэтому общий размер этих пар оснований одинаков по всей длине молекулы. Водородные связи при других сочетаниях оснований в паре возможны, но они значительно слабее. Последовательность нуклеотидов одной цепи полностью комплементарна последовательности нуклеотидов второй цепи. Поэтому, согласно правилу Чаргаффа (Эрвин Чаргафф в 1951 г. установил закономерности в соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК), число пуриновых оснований (А + G) равно числу пиримидиновых оснований (Т + С). Комплементарые основания уложены в стопку в сердцевине спирали. Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникают гидрофобные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль. Такая структура исключает контакт азотистых остатков с водой, но стопка оснований не может быть абсолютно вертикальной. Пары оснований слегка смещены относительно друг друга. В образованной структуре различают две бороздки - большую, шириной 2,2 нм, и малую, шириной 1,2 нм. Азотистые основания в области большой и малой бороздок взаимодействуют со специфическими белками, участвующими в организации структуры хроматина. 30. Гибридизация нуклеиновых кислот. Денатурация и ренативация ДНК. Гибридизация (ДНК-ДНК, ДНК-РНК). Методы лабораторной диагностики, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот. На явлении денатурации и ренативации основан метод, называемый "молекулярная гибридизация".Процесс гибридизации может осуществляться между двумя любыми цепями нуклеиновых кислот (ДНК-ДНК, ДНК-РНК) при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов. Такие гибридные структуры можно выделить центрифугированием в градиенте плотности сахарозы или наблюдать в электронном микроскопе . Если раствор, содержащий образцы ДНК 1 и 2, выделенные из организмов разных видов, денатурировать, а затем провести ренатива-цию, то образуются двухспиральные структуры. Но наряду с исходными ДНК 1 и ДНК 2 образуются гибридные двойные спирали, содержащие цепь ДНК образца 1 и цепь ДНК образца 2, где присутствуют как спирализованные, так и неспирализованные участки. В неспирализованных участках фрагменты цепей ДНК не комплементарны, т.е. в ходе гибридизации получаются несовершенные гибриды. Методом молекулярной гибридизации можно установить:
При проведении гибридизации ДНК-РНК были выделены гибридные молекулы, содержащие одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Если для эксперимента были взяты ДНК и РНК (первичный транскрипт), выделенные из одного организма, то образовывались совершенные гибриды, потому что молекула РНК комплементарна цепи ДНК. Гибридизацией ДНК-РНК было впервые установлено, что все виды РНК клетки имеют на молекуле ДНК комплементарные участки. 31. Третичная структура ДНК. Роль гистоновых и негистоновых белков в компакти-зации ДНК. Организация хроматина. Ковалентная модификация гистонов и ее роль в регуляции структуры и активности хроматина. Третичная структура ДНК (суперспирализация ДНК) Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится 46 хромосом. Общая длина ДНК всех хромосом клетки составляет 1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр которого в миллионы раз меньше. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определёнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы: гисгоновые и негистоновые белки. Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином. Гистоны - белки с молекулярной массой 11-21 кД, содержащие много остатков аргинина и лизина. Благодаря положительному заряду гистоны образуют ионные связи с отрицательно заряженными фосфатными группами, расположенными на внешней стороне двойной спирали ДНК. Существует 5 типов гистонов. Четыре гистона Н2А, Н2В, НЗ и Н4 образуют октамерный белковый комплекс (Н2А, Н2В, НЗ, Н4)2, который называют "нуклеосомный кор" (от англ.nucleosome core). Молекула ДНК "накручивается" на поверхность гистонового октамера, совершая 1,75 оборота (около 146 пар нуклеоти-дов). Такой комплекс гистоновых белков с ДНК служит основной структурной единицей хроматина, её называют "нуклеосома". ДНК, связывающую нуклеосомные частицы, называют линкерной ДНК. В среднем линкерная ДНК составляет 60 пар нуклеотидных остатков. Молекулы гистона H1 связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз . В ядре каждой клетки присутствует около 60 млн молекул каждого типа гистонов, а общая масса гистонов примерно равна содержанию ДНК. Аминокислотные остатки лизина, аргинина и концевые аминогруппы гистонов могут модифицироваться: ацетилироваться, фосфорилироваться, метилироваться или взаимодействовать с белком убиквитином (негистоновый белок). Модификации бывают обратимыми и необратимыми, они изменяют заряд и конформацию гистонов, а это влияет на взаимодействие гистонов между собой и с ДНК. Активность ферментов, ответственных за модификации, регулируется и зависит от стадии клеточного цикла. Модификации делают возможными конформационные перестройки хроматина. Негистоновые белки хроматина В ядре эукариотической клетки присутствуют сотни самых разнообразных ДНК-связывающих негистоновых белков. Каждый белок комплементарен определённой последовательности нуклеотидов ДНК (сайт ДНК). К этой группе относят семейство сайт-специфических белков типа "цинковые пальцы". Каждый "цинковый палец" узнаёт определённый сайт, состоящий из 5 нуклеотидных пар. Другое семейство сайт-специфических белков - гомодимеры. Фрагмент такого белка, контактирующий с ДНК, имеет структуру "спираль-поворот-спираль". К группе структурных и регуляторных белков, которые постоянно ассоциированы с хроматином, относят белки высокой подвижности (HMG-белки - от англ, high mobility gel proteins). Они имеют молекулярную массу менее 30 кД и характеризуются высоким содержанием заряженных аминокислот. Благодаря небольшой молекулярной массе HMG-белки обладают высокой подвижностью при электрофорезе в полиакриламидном геле. К негистоновым белкам принадлежат также ферменты репликации, транскрипции и репарации. При участии структурных, регуляторных белков и ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить нуклеосом преобразуется в высококонденсированный комплекс белков и ДНК. Образованная структура в 10 000 раз короче исходной молекулы ДНК. 32. Репликация. Принципы репликации ДНК. Стадии репликации. Инициация. Белки и ферменты, принимающие участие в формировании репликативной вилки. Живые организмы в течение S-фазы клеточного цикла, которая предшествует делению клетки, удваивают содержание ДНК таким образом, что каждая дочерняя клетка после деления получает набор хромосом, идентичный родительской клетке. Процесс удвоения хромосом называют репликацией (редупликацией). Хромосома содержит одну непрерывную двухцепочечную молекулу ДНК. При репликации каждая цепь родительской двухцепочечной ДНК служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Вновь образованная двойная спираль имеет одну исходную (родительскую) и одну вновь синтезированную (дочернюю) цепь. Такой механизм удвоения ДНК получил название"полуконсервативная репликация"(рис. 4-14). Первичная структура дочерней цепи определяется первичной структурой родительской цепи, потому что в основе её образования лежит принцип комплементарности оснований (G ≡ С и А = Т). Ферменты и белки, участвующие в репликации, должны работать быстро и точно. Эти условия выполняются с помощью особого мультиферментного комплекса. Репликацию можно разделить на 4 этапа: образование репликативной вилки (инициация), синтез новых цепей (элонгация), исключение праймеров, завершение синтеза двух дочерних цепей ДНК (терминация). А. Инициация репликации Синтез ДНК у эукариотов происходит в S-фазу клеточного цикла. Инициацию репликации регулируют специфические сигнальные белковые молекулы - факторы роста.Факторы роста связываются рецепторами мембран клеток, которые передают сигнал, побуждающий клетку к началу репликации . Синтез новых одноцепочечных молекул ДНК может произойти только при расхождении родительских цепей. В определённом сайте (точка начала репликации)происходит локальная денатурация ДНК, цепи расходятся и образуются две репликативные вилки,движущиеся в противоположных направлениях. В образовании репликативной вилки принимает участие ряд белков и ферментов. Так, семейство ДНК-топоизомераз (I, II и III), обладая нуклеазной активностью, участвует в регуляции суперспирализации ДНК. Например, ДНК-топоизомераза Iразрывает фосфоэфирную связь в одной из цепей двойной спирали и ковалентно присоединяется к 5'-концу в точке разрыва . По окончании формирования репликативной вилки фермент ликвидирует разрыв в цепи и отделяется от ДНК. Разрыв водородных связей в двухцепочечной молекуле ДНК осуществляет ДНК-хеликаза.Фермент ДНК-хеликаза использует энергию АТФ для расплетения двойной спирали ДНК. В результате происходит раскручивание участка суперспирализованной молекулы ДНК. В поддержании этого участка ДНК в раскрученном состоянии участвуют SSB-белки (от англ, single strand binding proteins,т.е. белки, связывающиеся с одноцепочечными нитями ДНК). SSB-белки, не закрывая азотистых оснований, связываются с одноцепочечной ДНК по всей длине разделившихся цепей и таким образом предотвращают их комплементарное скручивание и образование "шпилек". Они обладают большим сродством к одноцепочечным участкам ДНК, независимо от первичной структуры цепей. |