Проточная цитометрия. опят25. Проточная цитометрия Принцип метода Проточная цитометрия

• Название: Проточная цитометрия Принцип метода Проточная цитометрия
• Анкор: Проточная цитометрия
• Дата: 24.05.2023
• Размер: 18.53 Kb.
• Имя файла: опят25.docx
• Тип: Документы; #1155256

Проточная цитометрия

Принцип метода:

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов. Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом.

Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки, регистрируют флюоресценцию и рассеянное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

 Преимущества метода:

• 
  короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости
  
• 
  анализ большого количества клеток (до 10⁸ клеток)
  
• 
  логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
  
• 
  измерение параметров редко встречающихся клеток
  
• 
  объективное измерение интенсивности флуоресценции
  

Применения:

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.
Проведение анализа

1. 
   Подготовить оборудование к запуску (проверить содержание сосудов с жидкостями, подачу питания.
   
2. 
   После подготовки включить оборудование;
   
3. 
   Произвести подготовку оборудования к анализу, отдав команду с компютера;
   
4. 
   Взять свежую пробу иследуемого абразца(в нашем случае крови человека которая не позднее 1 часа после забора);
   
5. 
   Подготовить пробу по указанной в инструкции методике:
   

1. 
   Внести в пробирку с искусственными элементами 20мкл щестицветной флуоресцентной метки;
   
2. 
   Добавить 50мкл пробы с антикоагулянтом применяя технику обратного пепитирования. Встряхнуть и оставить в темном месте при комнатной температуре на 15мин.;
   
3. 
   Прилить 450мкл лизирующего раствора. Встряхнуть и оставить в темном месте при комнатной температуре на 15мин.
   

6. 
   Установить пробу в ячейку для взятия пробы;
   
7. 
   Запустить выполнение программы с компьютера;
   
8. 
   Проанализировать и сохранить полученный результат;
   
9. 
   Очистить и законсервировать аппарат;
   
10. 
    Выключить аппарат и сопутствующее оборудование.
    
11. 
    Утилизировать сосут с биологическими отходами.
    

Результаты:

Исходя из полученных графиков видно:

Содержание лимфоцитов –984

Содержание Т-лимфоцитов – 718.67- 73,01%

Содержание Т-киллеров – 256-26.02%

Содержание Т-хелперов –450-45.72%

Соотношение 4/8: 1.76.

По данным видно, что соотношение CD4 к CD8 находится в пределах нормы. Также видно, что пациент перенес серьёзную болезнь, так как начало развитие лимфоцитопенея. НА это указывает содержание лимфоцитов, которое отклонено от нормы (нормой считается содержание 1800-3500).