выступление. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800 1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 250 грамм
 Скачать 16.4 Kb.
|
|
Есть разные способы получения инсулина: получение рекомбинантного инсулина из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота, модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом, генно-инженерным способом. В данной работе будет рассмотрен последний. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800 – 1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 – 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Вдобавок, препарат вызывал аллергические реакции и в организме больного к нему постепенно образовывались антитела. Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. coli. Исследователи из компании «Генентек» впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Клетки Е. coli, трансформированные рекомбинантными плазмидами, содежащими синтетические гены инсулина, производили гибридные белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождался. Однако образование дисульфидных мостиков между двумя цепями происходило с трудом. В 1980 г. датская компания разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и времени действия. В этом же году была выделена мРНК инсулина из опухолевых клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНК встроили в плазмиду E. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выделяли из такого белка трипсином. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы. В 1981г. синтезирован ген-аналог проинсулина — мини-С-про-инсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в Е. coli. После окончания выращивания культуры ее концентрируют на сепараторе и разрушают на гомогенизаторе Гаулина, содержащем мочевину и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Тельца включения - частицы, состоящие из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков, отделяют центрифугированием. Выделение гибридного белка: Выделение гибридного белка из гранул проводят по следующей схеме: 1. Тельца включения растворяют в буфере, содержащем трис (гидроксиметил аминометана), мочевину, после чего добавляют дитиотреитол. 2. Гибридный белок инсулина ренатурируют путем инкубации в 5-10-кратном объеме глицин-NaOH буфере. 3. Кислотное осаждение проводят доведением рН до 4-6 раствором НСl. Образовавшийся осадок отделяют микрофильтрацией. 4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на КМ-сефарозе, уравновешенной трис-HCl буфером, при определенной рн. Белок элюируют т.е извлекают из твердого носителя вымыванием уравновешивающим буфером, содержащим NaCl и мочевину. 5. Ферментативное расщепление гибридного белка трипсином.Реакцию останавливают иодкислением соляной кислотой до рН 3,8-4. 6. Продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной аммоний-ацетатным буфером, с определенной рн, содержащим мочевину. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом хлористого калия в уравновешивающем буфере. Объединяют фракции, содержащие не менее 95% диаргинининсулина. 7. Ферментативное расщепление диаргинининсулина карбоксипептидазой Б. Реакцию останавливают добавлением НСl до рН 3,8-4. 8. Очистку инсулина методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией проводят на стандартном оборудовании Kiloprep 250, заполненный силикагелем. Регистрацию процесса разделения ведут на проточном спектрофотометре. Сбор фракций белка ведут при помощи коллектора хроматографа или вручную. Собранные фракции основного пика инсулина анализируются на содержание примесей методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Фракции инсулина, не содержащие примесей дезамидоинсулина, передают на стадию финишной очистки. 6. Финишная очистка и кристаллизация инсулина. Фракции, содержащие не менее 98% инсулина, объединяют и добавляют уксуснокислый цинк, рН раствора доводят до необходимого значения и образовавшийся осадок центрифугируют. Окончательную очистку инсулина проводят гель-фильтрацией на колонке размером 250/60, заполненной сефадексом G-50. Для этого колонку уравновешивают раствором уксусной кислоты. Таким образом, проведение хроматографической очистки на нейтральных носителях позволяет получить инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не ниже 27,5 Ед/мг. |