Реферат. Бактериофаги. Бактериофаги. Распространение фагов в природе. Методы культивирования, индикации и титров бактериофагов
 Скачать 108.18 Kb.
|
1 2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра Микробиологии, вирусологии. Реферат на тему: «Распространение фагов в природе. Методы культивирования, индикации и титров бактериофагов.» Выполнила: студентка группы Ст-207 А Арсланова Н. Я. г. Уфа 2019 Содержание: Введение 1. Бактериофаги, строение. 2. Взаимодействие бактериофага с бактериальными клетками 3. Применение бактериофагов. 4. Методы культивирования, титрования. Список литературы Введение Английский бактериолог Фредерик Туорт в статье 1915 года описал инфекционную болезнь стафилококков, инфицирующий агент проходил через фильтры, и его можно было переносить от одной колонии к другой. Независимо от Фредерика Туорта французско-канадский микробиолог Феликс Д’Эрель 3 сентября 1917 год сообщил об открытии бактериофагов. Наряду с этим известно, что российский микробиолог Николай Фёдорович Гамалея ещё в 1898 году, впервые наблюдал явление лизиса бактерий (сибиреязвенной палочки) под влиянием перевиваемого агента. После открытия явлений бактериофагии Д’Эрелль развил учение о том, что бактериофаги патогенных бактерий, являясь их паразитами, играют большую роль в патогенезе инфекций, обеспечивая выздоровление больного организма, а затем создания специфического иммунитета. Это положение привлекло к явлению бактериофагии внимание многих исследователей, которые предполагали найти в фагах важное средство борьбы с наиболее опасными инфекционными болезнями человека и животных. Также Феликс Д’Эрель выдвинул предположение, что бактериофаги имеют корпускулярную природу. Однако только после изобретения электронного микроскопа удалось увидеть и изучить ультраструктуру фагов. Долгое время представления о морфологии и основных особенностях фагов основывались на результатах изучения фагов Т-группы — Т1, Т2,…, Т7, которые размножаются на Е. coli (кишечная палочка) штамма B. Однако с каждым годом появлялись новые данные, касающиеся морфологии и структуры разнообразных фагов, что обусловило необходимость их морфологической классификации. 1. Бактериофаги. Бактериофаги (фаги) (от др.-греч. φᾰγω — «пожираю») — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нм. Структура типичного миовируса бактериофага (рис. 1). Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распространенную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов. Приблизительный размер популяции фагов составляет более 1030 фаговых частиц. В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, выделения человека и животных, вода и т. д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нём встречаются соответствующие фаги. Так, фаги, лизирующие клетки всех видов почвенных микроорганизмов, находятся в почвах. Особенно богаты фагами черноземы и почвы, в которые вносились органические удобрения. Бактериофаги выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций, в автолизе стареющих клеток, в переносе бактериальных генов, выступая в качестве векторных «систем». Действительно, бактериофаги представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Посредством трансдукции они привносят в бактериальный геном новые гены. Было подсчитано, что за 1 секунду могут быть инфицированы 1024 бактерий. Это означает, что постоянный перенос генетического материала распределяется между бактериями, обитающими в сходных условиях. Высокий уровень специализации, долгосрочное существование, способность быстро репродуцироваться в соответствующем хозяине способствует их сохранению в динамичном балансе среди широкого разнообразия видов бактерий в любой природной экосистеме. Когда подходящий хозяин отсутствует, многие фаги могут сохранять способность к инфицированию на протяжении десятилетий, если не будут уничтожены экстремальными веществами либо условиями внешней среды. Строение бактеорифагов. Строение бактериофаговБактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты5, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы в сотни и тысячи раз меньше микробных клеток.  Рис. 2. Строение бактериофага 1 – головка, 2 – хвост, 3 – нуклеиновая кислота, 4 – капсид, 5 – «воротничок», 6 – белковый чехол хвоста, 7 – фибрилла хвоста, 8 – шипы, 9 – базальная пластинка. Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2 – 4 раза больше диаметра головки. В головке содержится генетический материал – одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окруженная белковой или липопротеиновой оболочкой – капсидом, сохраняющим геном вне клетки. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Бактериофаги могут иметь икосаэдральный капсид, собранный из множества копий одного или двух специфичных белков. Обычно углы состоят из пентамеров белка, а опора каждой стороны из гексамеров того же или сходного белка. Более того, фаги по форме могут быть сферические, лимоновидные или плеоморфные. Хвост представляет собой белковую трубку — продолжение белковой оболочки головки, в основании хвоста имеется АТФаза, которая регенерирует энергию для инъекции генетического материала. Существуют также бактериофаги с коротким отростком, не имеющие отростка и нитевидные. Фаги, как и все вирусы, являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Хотя они переносят всю информацию для запуска собственной репродукции в соответствующем хозяине, у них отсутствуют механизмы для выработки энергии и рибосомы для синтеза белка. У некоторых фагов в геноме содержится несколько тысяч оснований, тогда как фаг G, самый крупный из секвенированных фагов, содержит 480 000 пар оснований — вдвое больше среднего значения для бактерий, хотя всё же недостаточного количества генов для важнейшего бактериального органоида как рибосомы. По механизму взаимодействия различают : Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки.После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности. По специфичности действия различают поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т. е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии. Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага получило название фаговой конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов. 2. Взаимодействие с бактериальной клеткой. Прикрепление вирионов фага к бактериальной клетке является реакцией первого порядка и происходит обычно на клеточной поверхности. Последняя различна по своей структуре у разных типов бактерий. Некоторые фаги прикрепляются к особым выростам, так называемым F и L-ворсинкам, которые принимают участие в процессе конъюгации. Вирионы фагов группы х обратимо прикрепляются к жгутикам бактерий и затем соскальзывают вдоль них к поверхности клетки, причем этому процессу, по-видимому, способствует движение самих жгутиков (поскольку неподвижные бактериальные мутанты не бывают хозяевами этих фагов). На поверхности бактериальной клетки имеются специфические рецепторы для фагов , однако данные об их природе весьма ограничены. Тот факт, что фаг неспособен адсорбироваться на бактериальном мутанте, не обязательно означает, что мутант утратил химические группы, выполняющие роль рецепторов фага, - последние могут быть просто скрыты другими компонентами клеточной оболочки. Рецепторы не всегда необходимы для самой клетки; например, при росте бактерий в определенных температурных условиях они могут утрачиваться. Из оболочки бактерий, чувствительных к фагу, удается экстрагировать специфическое вещество, способное инактивировать фаг. Возможно ,это вещество является самим рецептором или компонентом рецепторной структуры на поверхности бактерий. Сами по себе рецепторы, по-видимому, способствуют лишь первому обратимому этапу адсорбции. Не исключено, что они также участвуют в других процессах, частности в транспорте ионов железа. После прикрепления фага бактерия в течение некоторого времени (латентный период) не претерпевает заметных морфологических изменений даже и в том случае, если заражение, в конце концов ,приведет к лизису клетки, поскольку лизис наступает всегда внезапно. Проникновение фагового генома в клетку сопровождается физическим отделением нуклеиновой кислоты от большей части капсидных белков, которые остаются снаружи. Кроме фаговой нуклеиновой кислоты внутрь бактериальной клетки инъецируется также небольшое количество белка и некоторые другие вещества, в том числе олигопептиды и полиамины. Роль этих веществ в процессе развития фага неизвестна, некоторые из них являются остатками протеолиза капсидных белков при сборке вирионов. Если бактериальные клетки способны поглощать свободную ДНК из среды, то и геном фага может проникнуть в них в виде свободных молекул ДНК. Это явление называют трансфекцией. Способность бактерий поглощать молекулы ДНК может возникнуть как нормальное явление на некоторых этапах роста, что наблюдается, например, у В subtilis. В некоторых случаях такое состояние вызывается искусственно, как, например, у Е coli. Процесс развития фага после трансфекции принципиально не отличается от происходящего при нормальной фаговой инфекции, за исключением того, что в этих случаях не наблюдается резистентности, вызываемой отсутствием рецепторов или другими свойствами оболочки клетки. Проникновение генома фага в чувствительную к нему бактерию приводит либо к лизогенной, либо к литической инфекции, в зависимости от природы фага (а иногда и бактерии) и от окружающих условий, например температуры. При лизогенном типе взаимодействия геном фага в неинфекционной форме передается бактериальными клетками из поколения в поколение, причем время от времени в некотором количестве клеток синтезируются соответствующие вирионы, лизирующие эти клетки и выходящие затем во внешнюю среду. Лизогенные клетки, повторно зараженные этими вирионами, не лизируются (ибо они иммунны к этому фагу), так что лизогенная культура продолжает нормально расти. Присутствие свободных вирионов можно выявить путем воздействия на клетки каких-либо иных, нелизогенных штаммов бактерий, лизируемых данным фагом. Фаги, способные лизогенизировать заражаемые ими бактерии, называются умеренными, а фаги, у которых такая способность отсутствует, - вирулентными. Следует, однако, помнить, что даже умеренные фаги при первой инфекции чувствительных к ним бактерий вызывают продуктивную инфекцию у многих или даже у всех клеток. Возникновение лизогении и предупреждение созревания вирионов и лизиса клеток требуют серии определенных событий, которые вовсе не всегда случаются со всякой зараженной бактерией. Вероятность появления лизогении или продуктивной инфекции варьирует от фага к фагу и зависит от условий культивирования. 3. Применение бактериофагов. В медицинеОдной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие. Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего двухцепочечную линейную молеклул ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения). Средняя часть генома бактериофага λ (содержит гены, контролирующие лизогению, то есть его интеграцию в ДНК бактериальной клетки) не существенна для его размножения и составляет примерно 25 тысяч пар нуклеотидов. Данная часть может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Такие модифицированные фаги проходят литический цикл, но лизогения не происходит. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК эукариот (то есть более крупных генов) размером до 23 т.п.н. Причем, фаги без вставок — менее 38 т.п.н или, напротив, со слишком большими вставками – более 52 т.п.н не развиваются и не поражают бактерии. В биологииБактериофаги M13, фаг Т4, T7 и фаг λ используют для изучения белок-белковых, белок-пептидных и ДНК-белковых взаимодействий методом фагового дисплея. бактериофаг клетка антимикробный пептидный Поскольку размножение бактериофага возможно только в живых клетках бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур. С помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий была показана возможность изучения этапов взаимодействия фаг-микробная клетка. В микробиологической промышленностиМикробиологическое производство, использующее бактерии-продуценты, может в определенных условиях оказаться зависимым от бактериофагов. Лизис бактерий в промышленных аппаратах – ферментерах, вызванный бактериофагами («фаголизис»), уменьшает выход конечного продукта или ухудшает его качество и тем самым приносит экономический ущерб. Фаголизис может стать и причиной особого, генетического, загрязнения внешней среды. В производстве обычно используются бактериальные культуры ограниченного числа видов. В случае их массового лизиса и попадания определенных фагов во внешнюю среду может наблюдаться не только качественное изменение состава микроорганизмов, но и взаимодействие «производственных» и «природных» фагов. Это может привести к появлению в природных условиях генетически новых вариантов фагов, еще более активно лизирующих данный продуцент или способных визировать близкородственные виды бактерий. Следовательно, нарушаются сложившиеся биоценотические отношения. Механизм терапевтического действия. Антибактериальный, который оказывают препараты бактериофагов, обусловлен специфическим лизисом, патогенных бактерий в очаге воспаления. Гибель бактерий наступает вследствие того, что вирулентные бактериофаги адсорбируются на поверхности гомологичной микробной клетки, проникают в ее цитоплазму, где интенсивно размножаются, используя структурные компоненты клетки и разрушают ее. Бактериофаги не затрагивают бактерии, ее составляющие нормальную флору организма. При отсутствии чувствительных к бактериофагу бактерий, длительность пребывания бактериофагов в организме 3 дня. Бактериофаг предохраняет организм от инфекции как профилактическое средство. Показания к применению. Препараты бактериофагов применяются при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, органов моче-половой системы, систем органов кровообращения, дыхания, опорно-двигательного аппарата, гнойно-септических заболеваний новорожденных, дисбактериозов различной локализации, а также при других заболеваниях, вызванных условно-патогенными возбудителями рода Klebsiella, Escherichiae, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus. Streptococcus. В связи с наблюдаемым снижением терапевтического действия антибиотиков, препараты бактериофагов используются в клинической практике как альтернатива антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Препараты бактериофагов не уступают антибиотикам по эффективности и не вызывают, при этом, побочных токсических и аллергических реакций Применение Применение препаратов бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний стимулирует факторы специфического и неспецифического иммунитета и, поэтому особенно эффективно для лечения хронических воспалительных заболеваний на фоне иммунодепрессивных состоянии. Отсутствие побочных патологических реакций позволяет успешно использовать препараты бактериофагов у новорожденных и детей первого года жизни. Противопоказания Не имеют противопоказаний к применению. Способ применения. Препараты бактериофагов назначают внутрь, а также используют для орошения ран, для введения в дренированные полости - брюшную, плевральную, полости пазух носа, среднего уха, абсцессов, ран, матки, мочевого пузыря, а также использую в виде аэрозолей. При пероральном и аэрозольном применении, а также при нанесении на поверхность слизистых оболочек бактериофаги проникают в кровь и лимфу и выводятся через почки санируя моче-выводящие пути. Препараты бактериофагов могут использоваться в сочетании с любыми другими лечебными препаратами. Назначение препаратов бактериофагов Бактериофаг стафилококковый Лечение и профилактика гнойных инфекций кожи, слизистых вызванных стафилококковыми бактериями а также при дисбактериозах. Применяется для лечения карбункулов, фурункулов, хронически остеомиелитов, флегмон маститов, циститов, холециститов, при ангине, энтероколите и др. Бактериофаг колипротейный Лечение и профилактика энтероколитов, кольпитов колипротейной этиологии и дисбактериозов. Бактериофаг псевдомонас аэругиноза (синегнойный) Лечение заболеваний различных органов и гнойных инфекций кожи, вызванных данным видом бактерий. Применяется для лечения абсцессов, хирургических инфекций, гнойноосложнснных ран, хронических остеомиелитов, маститов, циститов и др. Бактериофаг протейный Лечение и профилактика гнойных инфекций, вызванных протейными бактериями, а также при дисбактериозах. Применяется для лечения абсцессов, гнойноосложненных ран, циститов,хронических остеомиелитов и р. Пиобактериофаг Лечение и профилактика различных форм гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных бактериями стафилококков, стрептококков, эшерихий коли, клебсиелл, пневмоний, псевдомонас аэругиноза, протея. Применяется для лечения хирургических инфекций, ожогов, гнойных поражений кожи, циститов и пиелонефритов, гастроэнтероколитов, холециститов, дисбактериоз кишечника, а также пиодермий, энтеритов и дисбактериоза кишечника новорожденных и детей грудного возраста. Бактериофаг клебсиеллезный Лечение озены, риносклеромы, и гнойно-воспалительных энтеральных заболеваний, вызванных бактериями клебсиелл. Применяется для лечения отитов, воспалений пазух носа и для других гнойно-воспалительных заболеваний уха, горла и носа. Интести-бактериофаг Лечение острых и хронических заболеваний дизентерии, сальмонеллеза, диспепсии, колита, энтероколита. Бактериофаг дизентерийный Лечение больных дизентерией и профилактика этого заболевания. Санация реконвалесцентов. Препарат активен в отношении шигелл Зонне и Флекснера Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСДЕ Применяют для лечения детей и взрослых больных сальмонеллезами, санации реконвалесцентов, а также для профилактики но эпидпоказаниям. 4. Методы культивирования бактериофагов. 1 2 |