Реферат. Бактериофаги. Бактериофаги. Распространение фагов в природе. Методы культивирования, индикации и титров бактериофагов

• Название: Распространение фагов в природе. Методы культивирования, индикации и титров бактериофагов
• Анкор: Реферат. Бактериофаги
• Дата: 21.12.2019
• Размер: 108.18 Kb.
• Имя файла: Бактериофаги.docx
• Тип: Реферат; #101447
• страница: 2 из 2

Выделение фага из объектов окружающей среды

Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37 °С в течение 18 - 24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами.[3]

Качественный метод определения фагов E.coli

Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 °С в течение 10--15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.[3]

Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа

Для постановки опыта предварительно:

а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;

б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3 - 4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10^-2 - 10^-7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10^-7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 ⁰С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.

Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10^-6) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем - из разведения 10^-5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37⁰ С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его титром (табл.1).[3]



Таблица 1. Результаты титрования фага но методу Грациа (форма протокола)

Определение спектра литического действия фага

Чашку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуемых бактериальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю соответствующей бульонной культуры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем на каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплошной лизис бактерий или так называемые стерильные пятна на бактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.[3]

Фаготипирование бактерий

Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 6).[3]



Рис.6. Постановка опыта фаготипирования культуры стафилококка.

Определение лизогении

Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, последний будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через 1 сутки инкубации при 37 ⁰С образуются очаги лизиса "стерильные" пятна. При отрицательном результате опыта исследуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ - облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.

Титрование бактериофага.

Осуществляется по количеству активных корпускул фага, содержащихся в 1 мл исследуемого фильтрата и обеспечивающих лизис тест-культуры.

Титр выражают отрицательным логарифмом, в котором степень указывает на разведение фага (10 ^-4, 10^-7).

1 .Титрование бактериофага по Аппельману:

• 
  составить ряд из 8 сухих чистых пробирок;
  
• 
  пипеткой налить в каждую из пробирок по 9 мл МПБ;
  
• 
  в первую пробирку влить 1 мл фильтрата бактериофага (разведение 1:10 или 10^-1) после чего 1 мл из нее перенести во вторую (разведение 10^-2);
  
• 
  процедуру повторять до 8 пробирки включительно. Из нее для уравнивания объемов 1 мл вылить в дез. раствор;
  

• 
  8 пробирка - контроль с МПБ без бактериофага;
  
• 
  в каждую пробирку ряда налить по 0,5 мл известной тест-культуры;
  
• 
  поставить в термостат при +37 С⁰на сутки;
  
• 
  учесть результаты титрования.
  

2. Постановка реакции нарастания титра фага (РНТФ)осуществляется с известным бактериофагом и его титром. Бактериофаг вносится в анализируемый объемс предполагаемым инфектом. Через сутки контакта из объекта выделяют бактериофаг и определяют его титр. При отсутствии инфекции титр бактериофага падает, при наличии - растет, а РНТФ соответственно отрицательная и положительная.

Методика фаготипирования бактерий

Испытуемую суточную бульонную культуру в количестве 0,5 мл ввести в пробирку с рас плавленным 0,7% и охлажденным до +45 с МПА, перемешать и равномерно распределить по поверхности 2% МПА в чашке Петри.

После застывания среды с культурой чашку слегка подсушить в термостате, затем разделить по дну на сектора или квадраты), пастеровскими пипетками раскапать различные бактериофаги.

После суточной инкубации следует посмотреть чашку и отметить те квадраты, в которых имеется лизис бактерии.

Фаготип бактерий определяют по фагу, вызвавшему их лизис.

Список литературы.

1. 
   Ожерельева Н. Г. Краткая Медицинская Энциклопедия, М.: изд-во «Советская Энциклопедия», 1989. — издание второе.
   
2. 
   Русалеев В. С., Таксономия вирусов бактерий / В. С. Русалеев // Ветеринария. — 1990. — № 12. — C. 25-28.
   
3. 
   Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. — Минск: БГУ, 2007. — 430 с.
   
4. 
   Адамс М., Бактериофаги / М. Адамс. — М.:Медгиз, 1961. — 521 с.
   
5. 
   Гольдфарб Д. М., Бактериофагия / Д. М. Гольдфарб. — М.: Медгиз, 1961. — 299 с.
   
6. 
   Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия / С. Н. Щелкунов. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.