МИКРОЭЛЕКТРОДНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. Документ Microsoft Word (2). Различают три основных способа микроэлектродной отведения отведение от группы клеток (фокальное внеклеточное отведение)
 Скачать 22.99 Kb.
|
|
МИКРОЭЛЕКТРОДНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ — метод отведения биоэлектрических потенциалов, генерируемых возбудимыми тканями организма животных и человека, при помощи микроэлектродов к-рые могут быть погружены в глубь ткани без ее существенного повреждения. Различают три основных способа микроэлектродной отведения: отведение от группы клеток (фокальное внеклеточное отведение); отведение от отдельной клетки при расположении кончика микроэлектрода возле нее (единичное внеклеточное отведение); отведение от отдельной клетки при расположении кончика микроэлектрода внутри нее (внутриклеточное отведение). Во всех случаях источник электрических потенциалов (в данном случае клетка) расположен в толще ткани, к-рая представляет собой объемный проводник. Тем самым создаются своеобразные условия отведения, отсутствующие при обычной регистрации электрических реакций нерва или мышцы поверхностными электродами (см.). Применяют два основных типа микроэлектродов — металлические и стеклянные. Металлические микроэлектроды представляют собой иглу из твердого металла, покрытую на всем протяжении, за исключением самого кончика, слоем изолирующего материала. В ряде случаев несколько микроэлектродов скрепляют вместе, располагая их кончики на различной глубине, что создает возможность для одновременного отведения множества биоэлектрических потенциалов. Металлические микроэлектроды отличаются низким электрическим сопротивлением. Однако из-за того, что диаметр их кончика не может быть сделан меньше нескольких микрон, такие электроды используют только для внеклеточного отведения. Первым начал использовать металлические микроэлектроды амер. исследователь Р. Лоренте де Но (В. Lorente de No, 1935), а в СССР — И. С. Бериташвили и сотр., А. Б. Коган и др. Стеклянный микроэлектрод представляет собой микропипетку из стекла, заполненную электролитом. Диаметр кончика пипетки может быть равен нескольким десятым долям микрона. Поэтому стеклянный микроэлектрод может быть введен внутрь отдельной клетки без существенного нарушения ее функций. Недостатком стеклянных микроэлектродов является большая хрупкость, исключающая возможность их длительного применения, особенно в условиях хрон, опыта, а также высокое электрическое сопротивление (до нескольких десятков Мом). Сопротивление снижают путем заполнения стеклянных микроэлектродов концентрированными солевыми р-рами (чаще хлористым калием); однако при этом увеличивается вероятность диффузии электролита из открытого кончика в клетку, что может привести к нежелательным последствиям. Стеклянные микроэлектроды были впервые применены амер. исследователем Джерардом (В. W. Gerard) с сотр. (1946), а в СССР — П. Г. Костюком и др. Широкое распространение получило изготовление многоканальных стеклянных микроэлектродов, к-рые вытягиваются из нескольких предварительно скрепленных между собой стеклянных трубочек; при этом часть каналов может использоваться не для регистрации электрической активности, а для подведения к клетке или введения внутрь ее тех или иных веществ путем их диффузии (см.) или микроионофореза (см.). Во всех случаях микроэлектродного отведения источником биоэлектрических потенциалов является поверхностная мембрана возбудимой клетки с существующей на ней трансмембранной разностью потенциалов, создаваемой неравномерным распределением основных неорганических ионов между протоплазмой клетки п внеклеточной средой (см. Биоэлектрические явления, Биоэлектрические потенциалы). При внеклеточном отведении наличие разности потенциалов может быть обнаружено только в том случае, когда ее величина в определенном участке клетки будет изменена под действием факторов, меняющих ионную проницаемость мембраны. При этом появляются кольцевые электрические (ионные) токи между покоящимся и активированным участком клетки. В качестве индифферентного (т. е. относительного) используется электрод большой площади, расположенный на удалении (напр., на поверхности ткани); такой электрод можно рассматривать как имеющий постоянный нулевой потенциал. Соответственно микроэлектрод, расположенный в области выхода токов из клетки (область «источника» тока), будет регистрировать положительный потенциал по отношению к относительному электроду, а микроэлектрод, расположенный в области их входа (области «стока» тока), — отрицательный потенциал. Чем ближе подведение микроэлектрода к источнику тока, тем больше регистрируемая разность потенциалов. Положение же относительного электрода при условии, что он удален в область, где плотность проходящих токов практически оказывается ничтожной, не сказывается на результатах отведения. Амплитуда отводимых колебаний будет зависеть не только от количества возбужденных клеток и величины участка, охваченного соответствующим электрическим изменением, но и от расстояния от источника биопотенциалов до кончика микроэлектрода. При внутриклеточном отведении источник эдс (т. е. поверхностная мембрана клетки) оказывается между микро- и относительным электродом, что приводит к отведению постоянной разности потенциалов в несколько десятков милливольт. Скачкообразное появление такой разности является основным критерием проникновения кончика микроэлектрода внутрь клетки. Появление активной реакции в отводимой клетке регистрируется как изменение постоянной разности потенциалов в сторону ее уменьшения или извращения (явление деполяризации) либо увеличения (гиперполяризация). Фокальное микроэлектродное отведение находит применение при изучении распространения возбуждения в пределах отдельных мозговых структур. Особенно успешным оно является в случае правильной ориентации соответствующих нейронных структур (напр., слоистой), поскольку создаваемые в этом случае отдельными клетками электрические поля суммируются и соответственно усиливаются. Поэтому при фокальном отведении могут быть зарегистрированы даже слабые эффекты, создаваемые синаптическими влияниями (см. Синапс). Особенно широко фокальное отведение используется при исследовании коры больших полушарий головного мозга, позволяя в определенной степени отделить процессы, протекающие в дендритах пирамидальных нейронов (образующих верхние слои серого вещества), от процессов, протекающих в их телах. В стволе головного мозга и в спинном мозге также имеется относительно правильная ориентация мотонейронов и их аксонов, поэтому фокальное отведение было использовано здесь для установления особенностей распространения процесса возбуждения в различных частях клетки (миелинизированная и немиелинизированная части аксона, сома и отчасти дендриты). Большое значение метод фокального отведения имел при разработке подробных карт распределения потенциалов по определенному сечению мозга в различные моменты времени после поступления в мозг афферентной сигнализации. Такие карты позволяют сделать ряд выводов о распространении процессов возбуждения в пределах данной области мозга. Единичное внеклеточное микроэлектродное отведение нашло применение при отведении биоэлектрических потенциалов от мышц, нек-рых рецепторов (сетчатка глаза) и т. д. В первом случае обычно изучают электрическую активность группы мышечных волокон, иннервируемых одним двигательным волокном и образующих функциональную нейромоторную единицу (см. Электромиография). При отведении биопотенциалов от сетчатки возможна регистрация деятельности отдельных ганглиозных элементов путем прикладывания микроэлектрода к внутренней поверхности сетчатки (без погружения внутрь клетки). Внеклеточное отведение активности отдельных нейронов мозга широко производится сейчас от всех его участков как в эксперименте, так и в клин, условиях во время нейрохирургических операций. Основным критерием отведения активности отдельной клетки является при этом регистрация разряда импульсов постоянной амплитуды. Особенно успешным такое отведение является, естественно, в случае ритмически-активных клеток, что создает удобные условия для сравнения амплитуд последовательных разрядов. Внеклеточное отведение с успехом используется для исследования механизма процесса конвергенции возбуждающих и тормозящих синаптических влияний, изменений деятельности нейронов в различных физиол, условиях, под действием фармакол, факторов и т. д. Внеклеточное отведение синаптических потенциалов отдельных клеток значительно менее эффективно, чем отведение импульсной активности, поскольку создаваемые ими электрические поля во много раз слабее полей, создаваемых потенциалами действия. Кроме того, практически невозможно достоверно подтвердить факт отведения активности от одной клетки, поскольку синаптические потенциалы не подчиняются правилу «все или ничего» (см. «Все или ничего» закон) и величина их является весьма вариабельной в одном и том же нейроне. Внеклеточное отведение потенциалов отдельных нейронов является пока единственно возможным методом тонкого анализа деятельности нервной системы. При особых методах погружения микроэлектродов возможно достаточно длительное внеклеточное отведение на животных без наркоза при сохраненной высшей нервной деятельности и даже в условиях свободного поведения. Внутриклеточное отведение — это основной метод изучения внутренних механизмов функционирования возбудимых клеток, в т. ч. ионных механизмов генерации потенциала действия, возбуждающих и тормозящих постсинаптических потенциалов и т. д. Именно с помощью внутриклеточного микроэлектродного отведения была впервые показана связь постсинаптического торможения с гиперполяризацией постсинаптической мембраны. Широкое применение внутриклеточное отведение нашло при изучении деятельности рецепторов, в частности при изучении происхождения и функционального значения генераторных потенциалов. Наряду с изучением электрических реакций возбудимых клеток микроэлектродная техника применяется также для локального раздражения и поляризации различных структур, а также для подведения к ним или введения внутрь клеток физиологически активных веществ. При этом для подведения физиологически активных веществ используется не только метод микроионофореза, но и способ введения раствора с помощью создания в микроэлектроде повышенного давления (в несколько атмосфер). Микроэлектродная аппаратура Применяемая в М. м. и. аппаратура включает в себя различные виды микроэлектродов, приборы для их изготовления, устройства для закрепления, манипулирования, отведения регистрируемых электрических параметров и т. д. Весьма малые размеры электродов позволяют производить измерения при минимальном повреждении тканей и клеток. Стеклянные микроэлектроды, называемые еще жидкостными, состоят из микропипетки (диаметр их зависит от цели и объекта изучения) и заполняющего электролита. Для успешного применения микроэлектродов существенное значение имеют свойства его узкой части, к-рая должна быть достаточно гибкой, чтобы не повреждать клетки, и достаточно прочной, чтобы прокалывать ткани и поверхности клеток. Для стеклянных микроэлектродов характерны также простота и легкость изготовления, надежность изоляции, возможность использования для внутриклеточных инъекций. Недостатки их: малая прочность, возможность диффузии ионов из электролита микроэлектрода в среду, наличие собственного потенциала кончика (с. п. к.). Для отведения быстрых потенциалов с. п. к. несуществен. При отведении постоянных потенциалов с. п. к. электрода суммируется с отводимой разностью, что может явиться серьезной помехой исследованию, т. к. собственный потенциал кончика может изменяться при переходе микроэлектрода из одного электролитного р-ра в другой. Стеклянные микроэлектроды изготавливают в основном из тугоплавкого стекла пирекс. Существуют ручной и автоматические способы изготовления микроэлектродов. При ручном способе участок заготовки, представляющий стеклянную трубочку, разогревают на пламени микрогорелки до размягчения и быстро растягивают. Эту операцию можно производить и в несколько этапов, Более тонкостенные капилляры получаются при быстром растяжении. При строгом отборе лишь ок. 5% микропипеток, приготовленных таким способом, можно признать годными для работы. Для облегчения работы и стандартизации пипеток применяют различные автоматические и полуавтоматические устройства. Упрощенное устройство для вытяжки микропипеток состоит из держателя заготовки, нагревательного элемента и элемента, вытягивающего заготовку с определенной, заранее выбранной силой; за процессом изготовления можно наблюдать в микроскоп. Принципиальная схема одного из таких устройств показана на рис, 1. Готовые микропипетки заполняют р-ром электролита. Существует ряд способов заполнения микроэлектродов: кипячение в электролите при пониженном атмосферном давлении; вытягивание микропипеток из стеклянных трубок, заранее заполнен-ных электролитом; с использованием разности давления паров двух несоприкасающихся жидкостей (т. е. электролита и воды); с помощью стеклянной иглы; под действием повышенного давления и др. Во многих лабораториях применяют собственные способы заполнения микроэлектродов. Металлические микроэлектроды отличаются от стеклянных большей прочностью, долговечностью, малыми сопротивлениями. К их недостаткам следует отнести возможность поляризации, что влечет за собой появление на кончике нестабильного постоянного потенциала. Для изготовления металлических микроэлектродов применяют следующие металлы: нихром, константан, вольфрам, платину, сурьму, свинец, олово. Наиболее тонкие микроэлектроды получают из вольфрама. Кусочек тонкой металлической проволоки затачивают на конце на тонкой наждачной бумаге или шлифовальном камне либо электролитическим способом. Регулируя глубину и время погружения кончика, угол наклона к поверхности, добиваются нужной формы микроэлектрода. При термическом способе обработки кончик стачивается накаленной платиновой нитью. Заточенные, микроэлектроды изолируют различными диэлектриками: лаками, эмалями, оргстеклом и т. п. Иногда изготовляют металлические микроэлектроды в стеклянной изоляции. Для закрепления и присоединения электродов к входному усилителю применяют различные держатели. Доставка микроэлектрода к месту измерения и манипулирование им осуществляют посредством различных микроманипуляторов (см. Микроманипулятор). На рис. 2 представлена схема простого микроманипулятора для электрофизиол, исследований. Библиография: Костюк П. Г. Микроэлектродная техника, Киев, 1960, библиогр.; Мещерский Р. М. Анализ нейронной активности, М., 1972, библиогр.; Экклс Дж. Физиология нервных клеток, пер. с англ., М., 1959; Hubbard J. I., L linas R. a. Q u as-tel D. М. J. Electrophysiological analysis of synaptic transmission, Baltimore, 1969. П. Г. Костюк; Ю. В. Агибалов, А. Б. Цыпин (техн.). |