Главная страница

Трансплантация эмбрионов.. Реферат 4 введение. 5 Обзор литературы. 8 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов. 8


Скачать 1.56 Mb.
НазваниеРеферат 4 введение. 5 Обзор литературы. 8 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов. 8
АнкорТрансплантация эмбрионов..doc
Дата08.03.2018
Размер1.56 Mb.
Формат файлаdoc
Имя файлаТрансплантация эмбрионов..doc
ТипРеферат
#16396
КатегорияБиология. Ветеринария. Сельское хозяйство
страница6 из 11
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

4. Собственные исследования.

4.1. Цель и задачи



Целью нашей работы была разработка методов профи­лактики и санитарного контроля технологических процессов при трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.

Для достижения этой цели нами поставлены на разрешение следую­щие задачи:

1. Изучить бактериальную контаминацию половых путей телок-реци­пиентов в фолликулярную и лютеальную фазы полового цикла.

2. Изучить влияние антибактериальных препаратов на микрофлору половых путей после их санации непосредственно перед извлечением и пересадкой эмбрионов.

3. Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов для санации половых путей.

4. Испытать антибиотики для санации промывных бу­ферных сред и отмывки эмбрионов.

5. Изучить влияние испытанных нами антибактериальных препаратов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов.

4.2. Материалы и методика исследований


Все исследования по данной работе проводились в лаборато­рии трансплантации эмбрионов сельско­хозяйственных животных Харьковского биотехнологического центра Украинской академии аграрных наук и на пункте трансплантации эмбрионов опытного хозяйства "Кутузовка". Работа выполнялась в период с июля 2000 года по август 2001 года.

Пункт трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, по­строенный по типовому проекту, имеет манеж для санитарной об­работки животных перед операцией, операционную, поисковую и стериль­ный бокс для первичной обработки эмбрионов, помещение для заморажи­вания и хранения эмбрионов, моечную и др. В манеже и операционной рас­положены специальные фиксационные станки. Операционная, поисковая и стерильный бокс оборудованы бактерицидными лампами. Пункт осна­щен необходимым лабораторным, технологическим оборудованием и ла­бораторной посудой.

Предметом исследования были коровы и телки черно-пестрой породы и по­лученные от них эмбрионы.

В опытном хозяй­стве "Кутузовка" беспривязная система содержания на глубокой несменяе­мой подстилке.

Кормление животных проводили по общепринятым нормам. Ра­ционы были сбалансированы по общей питательности, белку, фосфору, кальцию и витаминным добавкам.

Животные регулярно подвергались ветеринарно-профи­лактиче­ским и санитарным обработкам, клинико-гинекологическим обследованиям, постоянно находились под ветеринарно-зоотехни­ческим наблюдением.

Исследования проводили на коровах-донорах и телках-реципиентах с нормальным состоянием половых органов и цикличностью воспроизводи­тельной функции. Опытная группа состояла из коров в возрасте 3-8 лет, с живой массой 500-600 кг и телок в возрасте 16-18 месяца, с живой массой 350-380 кг. В контроль­ную группу отбирали коров и телок методом пар-аналогов. В экспериментах использовано 25 коров-доноров и 60 телок- реципиентов. Для вызывания суперовуляции применяли препараты ФСГ.

Животные обрабатывались по 4-х дневной схеме ФСГ-п производства фирм " Schering Corp" или " Burns Biotec" США и ФСГ-супер (Россия) в общей дозе 50 мг (Табл. 1).

Таблица 1.

Схема гормональной обработки коров-доноров препаратом ФСГ-п (50мг) производства США.

День эстраль­ного цикла


Название препарата


Доза (мг)


Об­щая доза


утро


вечер


10-12


ФСГ-п


7


7


14


11-13


ФСГ-п


6,5


6,5


13


12-14


ФСГ-п


6


6


12




Простог­ландин


250


250


500 мкг


13-15


ФСГ-п


5,5


5,5


11


14-16


Охота и осеменение








21-23


Нехирур­гическое извле­чение эмбрио­нов









Синхронизация полового цикла доноров и реципиентов осуществля­лась инъекцией экстрофана.

Осеменение коров-доноров проводилось дву­кратно двойной дозой замороженно-оттаянной спермы с содержанием не менее 25 млн активных спермиев (рис. 1). Из спермодозы готовили мазки для определения патологических форм спермиев. Мазки высушивали, фиксировали и окрашивали гематоксилином Караччи. Сперму, содержащую 18 % и более патологических спермиев, выбраковывали, так как высокий процент патологических спермиев снижает оплодотворяющую способность спермы.



Рис. 1. Нормальные спермии быка



Рис. 2. Патологические формы спермиев



Рис. 3. Патологические формы спермиев




Рис. 4. Патологические формы спермиев

Для бактериологических исследований использовали мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Китт-Тароцци, Сабуро и Булира, агар Эндо.

МПА и МПБ использовали для культивирования различных микроор­ганизмов неопределенного состава.

Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали среду Китт-Тароцци (МППБ).

Среду Булира и агар Эндо применяли для культивирования ки­шечной палочки.

Для выращивания грибов использовали среду Сабуро.

Все среды перед бактериологическим исследованием разли­вали в пробирки по 5 мл. Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали автоклавированием при температуре 120° С в течение 15-30 минут. МПА после стерилизации скашивали, установив пробирки в наклон­ном положении до застывания среды.

Среду, предназначенную для культивирования бактерий на чашках разливали по 20-25 мл и оставляли на несколько минут до застывания агара. Когда требовалось вырастить микроорганизмы на агарезированной среде в виде изолированных колоний, чашки после засева помещали в термостат дном вверх.

Отбор проб для бактериологических исследований проводили на всех этапах подготовки эмбрионов к трансплантации.

4.2.1. Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионами.


В помещениях лаборатории, где подготавливали инструменты, обо­рудование, посуду, среды для получения, пересадки и криоконсервации эмбрионов, ежедневно проводили влажную уборку.

Все оборудование бокса, его стены, пол не реже одного раза в неделю мыли моющими средствами и протирали дезинфицирую­щими растворами. Для дезинфекции использовали 2%-ый раствор хлорамина "Б". Перед рабо­той бокс и другие помещения лаборатории облучали в течение 40-60 минут ультрафиолетовыми лучами из расчета 2-3 вт/м .

В боксе в день работы с эмбрионами проводили дополнительную об­работку столов и оборудования 96° этанолом.

Все сотрудники лаборатории работали в стерильных халатах и смен­ной обуви. Спецодежду (халаты, косынки, шапочки, марлевые повязки) сти­рали не реже одного раза в неделю с обязательным кипячением и проглажи­ванием утюгом. Обувь регулярно по окончании работы мыли и обеззаражи­вали 2%-ым раствором хлорамина.

Употребляемые для работы с эмбрионами инструменты, посу­ду стерилизовали различными способами в зависимости от материала, из ко­торого они изготовлены.

Стеклянную посуду (флаконы, колбы, пипетки, цилиндры и пр.), а также инструменты для пересадки эмбрионов закрывали пергаментной бу­магой и стерилизовали автоклавированием при 1,5 атм. в течение 30 мин. Затем сушили при температуре 80° С в течение 60 минут.

Шприцы, иглы, пинцеты, ножницы, влагалищные зеркала и системы для вымывания эмбрионов стерилизовали кипячением в течение 30 минут.

Перед стерилизацией новую стеклянную посуду мыли водо­провод­ной водой с мылом или порошком, с помощью щеток и ершей, ополаски­вали и погружали в раствор соляной кислоты (1ст. ложка соляной кислоты на 3 литра дистиллированной воды) и выдерживали в нем 24 часа. После чего посуду отмывали в проточной воде, а затем многократно в би- и три­дистиллированной воде и высушивали.

Бывшую в употреблении стеклянную посуду мыли в горячем
2-3% растворе двууглекислой соды, затем тщательно
ополаскивали водопроводной водой, после чего би- и тридистиллированной водой и высушивали.

Бывшие в употреблении металлические предметы также мыли в вы­шеуказанном растворе соды, ополаскивали водопроводной, би- и триди­стиллированной водой и высушивали.

Одноразовые полимерные инструменты (ампулы, чехлы, пипетки и др.) стерилизовали в боксе путем их облучения бактерицидными лампами БУФ-30 или ПРК-2 в течение 20 мин. с обеих сторон на расстоянии 20 см от источника облучения.

Резиновые инструменты (катетер для вымывания) обрабаты­вали 70° С спиртом-ректификатом. Наружную поверхность стерилизовали, облучая лам­пами БУФ-30 в течение 20 мин. на расстоянии 20 см от источника ультра­фиолетовых лучей, перед работой ополаскивали 2-3 раза средой Дюльбекко.

4.2.2. Подготовка доноров и реципиентов.



Подготовку донора начинали в манеже с чистки и мытья кожного по­крова и конечностей. Затем животное переводили в операционную, фикси­ровали в станке, прямую кишку освобожда­ли от содержимого. Для снятия напряжения прямой кишки проводили эпидуральную анестезию 2%-ым раствором новокаина в дозе 5мл. По инструкции наружные половые органы и перенеальную область тщательно мыли водой с мылом, осушали салфеткой, дезинфицировали аэрозолем "Септонекс" или 70°-м этанолом. В опытах, корень хвоста, область промежности и наружные половые органы тщательно мыли теплой водой с мылом, осушали ватным тампоном. Кожу наружных половых органов и половые пути (преддверие влагалища, влагалище и вла­галищную часть шейки матки) орошали раствором Люголя. Для этой цели хвост отводили в сторону вперед, фиксировали его при помощи веревки за переднюю перегородку станка. Во влагалище вводили подготовленное вла­галищное зеркало. Через открытое зеркало орошали слизистые оболочки по­ловых путей раствором Люголя. Через 15 минут после санации половых путей проводили извлечение эмбрионов.

Подготовку реципиентов к пересадке эмбрионов осуществляли также, как и подготовку доноров для нехирургического извлечения зародышей. Для предотвращения заноса микрофлоры в матку реципиента проводили сана­цию половых путей раствором Люголя за 15 мин. до пересадки эмбрионов.

Приготовление раствора Люголя.

Раствор Люголя готовили по следующей прописи:

кристаллический йод - 1,0 г

йодистый калий - 2,0 г

дистиллированная вода - 300,0 мл.

2,0 г йодистого калия растворяли в 100 мл воды, добавляли
1,0 г кристаллического йода и ставили на 10-12 часов в термостат
до полного растворения йода. При этом йод растворяется в
йодистом калии. Раствор переливали в большую мерную склянку
и доводили общий объем до 300,0 мл. Затем его фильтровали и
хранили во флаконах из темного стекла. Раствор использовали не
более 30 дней.

4.2.3. Извлечение и подготовка эмбрионов к пересадке.



Извлечение эмбрионов проводили на 7-8 день полового цикла нехи­рургическим методом. Перед операцией донора готовили по методике, опи­санной в разделе 1.2, затем эпидурально вводили 5-7 мл 2%-ого новокаина в зависимости от веса животного. Беспокойным добавочно вводили 0,3-0,5 мл ромпуна. Ректально методом пальпации оценивали состояние полового аппарата, проводили подсчеты желтых тел и фолликулов. Для вымывания эмбрионов использовали катетеры различных конструкций. Про­мывная жидкость подавалась через закрытую систему самотеком из ем­кости, расположенной в верхнем гнезде штатива над донором. Промы­вание маточного рога проводили 8-10 раз, вводя по 60-50 мл промывной среды. На вымывание одного рога расходовали 450-500 мл модифици­рованной среды Дюльбекко с добавлением 1% инактивированной сыво­ротки крови крупного рогатого скота.

В научно-производственных опытах по санации промывных буфер­ных сред добавляли комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрациях 12 мкг/мл и 100 Ед/мл, соответственно. Бактерицидную дозу санирующих препаратов испытывали на штаммах микроорганизмов, как монокультуре, так и в ассоциации, методом серийных разведении. Безвредность санирующих препаратов для эмбрионов определяли мето­дом культивирования эмбрионов крупного рогатого скота в средах со­держащих различные дозы испытуемых препаратов.

Эффективность применения санирующих препаратов учитыва­ли по результатам приживляемости эмбрионов.

Смыв отстаивали 15-20 мин. при температуре 37°С в термо­стате. Надосадочную жидкость аспирировали с помощью сифона. Осадочную среду разливали в стерильные чашки Петри с расчерченным на полоски дном. Поиск зародышей производили под стереоскопическим микроско­пом МБС-9.

Обнаруженные эмбрионы переносили стерильным микро­шприцем на малую чашку Петри диаметром 40 мм. Жизнеспособность эмбрионов опреде­ляли по общепринятой методике оценки морфологического состояния эм­бриона (В. Shea et al.,1976), учитывая их компактность, симметричность, плотность. (Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, 1987).

В сравнительных опытах по многократному отмыванию эмбрионов использовали буферные среды, приготовленные за 10-15 мин. до начала поиска эмбрионов. Отмывная среда для эмбрионов состояла из стерильного буфера Дюльбекко с добавлением 15-20% инактивированной фетальной сы­воротки, которую в стерильных условиях расфасовывали в полиэтилено­вые ампулы по 2 мл. В другой емкости готовили такую же среду с добав­лением комплекса антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл). При отмывании использовали микрошприц и микропипетку для за­хвата эмбрионов с минимальным обьемом среды. Устройство применяли с целью захвата, переноса и микробной деконтаминации эмбрионов.

Культивирование эмбрионов проводили при температуре 37,5° С без доступа кислорода в модифицированной среде Дюльбекко, содержащей 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

В среду для культивирования подопытных эмбрионов вносили комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин (12 мкг/мл и 100 Ед/мл), в первом контроле использовали пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (50 Ед/мл), во втором контроле для культивирования эмбрионов использо­вали среду без антибиотиков.

Эмбрионы в средах с антибиотиками выдерживали 2 часа. Затем ме­няли среду и культивировали 72 часа. Морфологическое состояние эм­брионов оценивали через 2, 24, 48 и 72 часа.

4.2.4. Влияние микробного фактора на приживляемость эм­брионов.


При проведении опытов по определению влияния микробного фак­тора на приживляемость эмбрионов использовали чистые культуры микро­организмов, ранее выделеные из половых путей коров-доноров и телок-реци­пиентов. Инокуляцию отмытых и подготовленных к пересадке эмбрионов проводили чистыми суточными культурами. Чистые культуры Staph.a и E.coli выделяли методом Коха. Принцип метода заключается в полу­чении чистой культуры из колонии, рост которой считали результатом развития одной клетки.

Для выделения чистой культуры производили высев на по­верхность агаровой среды из накопительной культуры (с ее разведения). Разведение делали с таким расчетом, чтобы получить на поверхности агаровой среды изолированные колонии. Для посева на поверхность плотной агаровой среды наносили каплю этой культуры, ко­торую осторожно распределяли по всей поверхности стерильным шпате­лем с последующим переносом ее на поверхность агара последовательно во вторую, третью и четвертую чашки. В первых двух чашках после ин­кубации при температуре 37 ° С для Staph. aureus и 43 "С для E.coli на­блюдали "сплошной" рост микроорганизмов, тогда как в последующих чашках отмечали рост изолированных колоний. Одну из колоний отби­рали стерильной петлей и производили высевы в пробирки с МПБ и на поверхность скошенного агара. Идентификацию E.coli проводили путем высева на среду Булира и Эндо, a Staph. aureus на МПБ и МПА с добав­лением 1% глюкозы.

Чистые культуры Staph. aureus и Е. coli в разведении 1:10 конта­минировали в среды с эмбрионами.

Для получения определенного количества микроорганизмов в 1 мл среды необходимо было получить суспензию этих культур и приготовить их разведение. Чаще всего для инокуляции используют чистые суточные культуры микроорганизмов в разведении 1:10 - 1:10 . Для приготовления таких разведении, сте­рильный физиологический раствор разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исходной суспензии, взятой стерильной пипеткой, переносили в первую пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора - получали первое разведение 1:10. Затем этой же пипеткой брали 1 мл полученного разведения и переносили его во вторую про­бирку. Получали второе разведение

Таким же образом готовили и последующие разведения.

В эксперименте по определению влияния микробного фактора
на приживляемость эмбрионов было взято две группы животных-
аналогов по 20 голов в каждой. Телкам-реципиентам опытных
групп пересаживали эмбрионы, инокулированные чистыми куль­
турами микроорганизмов в вышеуказанных разведениях. 10
животным трансплантировали эмбрионы, инфицированные
Staph.aureus, другим 10 - эмбрионы с внесенной культурой E.coli,
20 контрольным телкам пересаживали эмбрионы, отмытые в пяти
чашках стерильными буферными средами, без добавления
микроорганизмов.

В природе отмечено, что микроорганизмы в ассоциациях могут быть синергистами либо антагонистами. Поэтому нами прове­дены исследования по определению антагонизма микро­организмов, выделенных из половых путей самок. В этих опытах применяли метод посева испытуемых мик­робов на чашках Петри с МПА радиальными штрихами к предварительно выращенным колониям предполагаемого антагониста по методике В.В. Аврех и А.Ф. Зак, описанной в справочнике И.О.Биргера (1973).

В экспериментах по определению бактериальной загрязненно­сти по­ловых путей доноров и реципиентов нами выделено в основном 4 вида бак­терий: Bac.subtilis, E.coli, Staph.aureus и Ps.aeruginosa. Перечисленные виды микроорганизмов относятся к группе возбудителей специфических половых инфекций. Известно, что в определенных условиях резистентность организма значительно ослабевает и нормальный количественный и качест­венный состав микрофлоры изменяется или активизируется деятельность имеющихся микроорганизмов.

Попадание микробов в глубокие отделы полового аппарата самки в природных условиях при естественном спаривании явление не столь уж редкое. Именно вследствие этого возникла у самок активная защитная ре­акция в эстральном периоде. И у самих зародышей в процессе эволюции вы­работался защитный механизм, особенно необходимый на ранних стадиях развития, когда еще не существует плацента с ее барьерной функцией. Это подтверждено опытами Б.П.Токина(1956).
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


написать администратору сайта