Основи біотехнології. Регулятори росту І розвитку рослин план лекції
 Скачать 211 Kb.
|
|
Культура калусної тканини та клітинних суспензій ПЛАН ЛЕКЦІЇ 1 .Культура калусної тканини. 2.Рослинні суспензійні культури. Культура калусної тканини. Калусною тканиною вищої рослини називають тканину, яка виникла шляхом неорганізованої проліферації із експлантів органів рослин після першого субкультивування. Крім того, калус утворюється в місцях пошкодження рослин. Відомий вчений - ботанік Н. Кренке 50 років тому частину своїх робіт присвятив вивченні ролі калусної тканини в цілій рослині. Він повязав її з фазами, які проходить калусна тканина. • перша фаза - швидкий ріст калусних клітин, які захищають місце пошкодження;
Культура калусів може бути отримана із різних експлантів: будь-яких органів рослин (наприклад коренів, пагонів, листя) або із клітин певного типу (ендосперм, пилок). При виборі експланту необхідно враховувати вік рослини. У молодих, ювенільних рослин здатність до ініціації калусу в умовах іn vitro значно вища ніж у зрілих. При використанні спеціалізованих тканин, наприклад ендосперму, утворення і ріст калусу залежать від часу його отримання. Як правило, калус важко утворюється на експлантах старше 8-11 діб після запилення. Шматочки стебла деревних рослин можна використати як експлант попередньо проробивши наступні маніпуляції: зрізати бокову гілку, дати можливість утворитися раневому калусу безпосередньо на рослині, потім новоутворений калус ізолюють, стерилізують і поміщають на стерильне поживне середовище. Калусні тканини можна також отримати із ізольованих клітин та їх агрегатів із суспензійної культури. Якщо, наприклад, клітинна культура звикла до росту в умовах суспензії, то при висаджуванні на агар, ріст її значно покращується. Насіння є чудовим вихідним матеріалом в наступних випадках: Для отримання калусу шляхом посадки цілих насінин на агаризоване середовище, яке містить регулятори росту; Д - для отримання із проростаючого насіння, яке помістили на агаризоване середовище без регуляторів росту, стерильних пагонів, коренів і листя, які потім використовують, як експланти. - для ізолювання тканин зародкового корінця і зародкової бруньки із насіння і подальшого їх використання як експлантів. Загальними факторами, які визначають ефективність дедиференціації тканини експланту і розвитку первинного калусу є: 1. Генотип вихідної рослини. При цьому сорти, лінії в межах виду можуть суттєво відрізнятися; 2. Епігенетична характеристика експланту, в тому числі однорідність і неоднорідність тканини за рахунок груп різних клітин. 3. Зовнішні умови, із яких найбільш важливі екзогенні регулятори росту (переважно фітогормони), а також речовини, що діють як засоби противиділення експлантом блокуючих калусогенез речовин (активоване вугілля, антиоксиданти). Розмір і форма вихідного експланту не впливає на проліферацію калусу. Однак існує мінімальний критичний розмір, зменшивши який, неможливо визвати ріст експлантів - це 4 мг. Для отримання калусу найчастіше використовують середовище Уайта, Мурасіге-Скуга, Гамборга, які доповнені 2% сахарозою чи глюкозою, сумішшювітамінів та регуляторами росту. Для одержання первинного калусу, експланти тканин рекомендують культивувати одночасно на декількох середовищах з різним співвідношенням регуляторів росту. Успіх отримання калусу залежить від підбору регуляторів росту, які індукують клітинне ділення. Як ауксини використовують 2,4-Д та індолілоцтову кислоту. Індолілоцтова кислота має меншу активність завдяки тому, що вона руйнується ІОК-оксидазою первинного експланту. Для індукції утворення калусу речовини ауксинової природи використовують в 10 разів вищій, ніж та, яка використовується для підтримки його росту. Іноді необхідно вносити більш складні компоненти, такі як кокосове молоко (5-20%), гідролізат казеїну (200-800 мг/л), дріжджовий екстракт (50-100). Культивують калусні тканини без доступу світла при температурі +26-27С т а вологості повітря 70%. Для вирощування калусних тканин використовують термостати, кондиціоновані кімнати, які обладнані стелажами, шафи або (кліматичні камери). Деякі тканини мають фізіологічну полярність. Очевидно в зв'язку з цим калус утворюється більш інтенсивно на стороні експланту, яка на материнській рослині повернена до кореня, тому при отриманні калусу на фрагментах стебла, шматочках коренеплоду моркви, пастернаку, петрушки, експланти поміщають на агар апікальною стороною. У випадку ізоляції експлантів із бульбоплодів (топінамбур, картопля) полярність значення не має. Для повного виключення впливу полярності експланти топінамбуру необхідно поміщати на середовище тангентально. Інтенсивність росту окремих калусів одного і того ж варіанту може значно варіювати. Тому окремі варіанти до слідів з калусними тканинами повинні мати не менше шести повторностей. Облік росту калусних тканин проводять за наступними параметрами: І.Сира вага, яка визначається або в кінці досліду, або на протязі періоду росту калусних тканин для визначення його динаміки. Підраховують по формулі: Wt-Wо Wо Wt - вага в кінці досліду, г Wо - вага на початку досліду, г. Завдяки показнику сирої ваги можна визначити величину приросту ваги по формулі: Wt - Wо×100 Wо 2. Суха вага, яка визначається в кінці досліду проводять її загальноприйнятим методом із середньої проби.. 3. Визначення числа клітин на одиницю ваги тканини або на калус проводять в основному за методом Брауна. Даний метод дає можливість визначити за рахунок яких процесів проходить збільшення маси тканин - чи за рахунок ділення клітин чи за рахунок розтягнення клітин, а також розрахувати середню вагу клітини. Періодичне визначення числа клітин на протязі експериментів дає можливість побудувати криву росту. Враховуючи, шо традиційне вимірювання динаміки росту тканини потребує великої кількості рослинної тканини, середовищ, посуду і є громіздким був створеyий фотометричний прилад для визначення динаміки росту тканин. Калусна тканина, яка вирощується поверхневим способом, являє собою аморфну масу тонкостінних паренхімних. клітин, які не мають строго певної анатомічної структури. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним - пігментованим антоціанами повністю або зонально. В залежності від умов вирощуваннята походження калусні тканини бувають:
3) компактними, щільними з зонами редукованого камбію та судин (в основному трахеїдоподібних елементів). Анатомічна структура рихлих калусів характеризується великою кількістю центрів меристематичної активності, розділених великими не диференційованими клітинами. Компактні калуси менш диференційовані і містять багато великих вакуолізованих клітин. Існує різниця між цими типами калусів в упакуванні клітин: компактні калуси складаються із щільно упакованих клітин. Також вони відрізняються по хімічному складу: у компактних калусів загальна кількість поліцукрів клітинної стінки вища, але низький % целюлози в порівнянні з пектиновими речовинами та геміцелюлозами. Калусні культури відрізняються по морфології та ступеню гетерогенності клітинних популяцій, по морфогенетичним і біосинтетичним потенціалам. рихлий тип калусів в рідкому поживному середовищі дуже легко відділяє одиночні клітини і дає початок суспензійній культурі. Як правило в довготривалій перевивній культурі, на середовищах, які містять ауксини, особливо синтетичний аналог ауксину 2,4-Д, калусні тканини втрачають пігментацію і стають більш рихлими. В циклі вирощування калусні клітини після ряду поділів проходять звичайний для клітини рослин онтогенез, вони приступають до росту розтягненням, потім диференціюються як зрілі калусні клітини і на кінецьдеградують. Калусні клітини в перевивній культурі можуть спонтанно набути гормононезлежності. Природа такої гормононезалежності до одного або двох гормонів (ауксину та цитокініну), які використовуються при вирощуванні клітинних культур рослин, може бути генетичною (результат мутації) або епігенетичною (результат експресії генів, які визначають гормононезалежність клітини). При генетичній гормононезалежності калусні тканини ведуть себе так як пухлинні, при епігенетичній - вони втрачають ознаку гормононезалежності в ряді перетворень клітина-рослина-клітина, що і є доказом негенетичної пророди такої набутої гормононезалежності. Техніка культивування тканин рослин позволяє отримати довготривалу, перевивну калусну культуру із будь-яких живих тканин клітин інтактної рослини. Різнодиференційовані клітини (в тому числі і меристематичні) переходять іn vitro до складного процесу диференціації, втрачають присутню їм структурну організацію і специфічні функції та індукуються до ділення, утворюючи первинний калус. В процесі субкультивування формується штам, який характеризується індивідуальними генетичними та фізіологічними особливостями. Рослинні суспензійні культури. Суспензійні культури - це гомогенна популяція клітин та клітинних агрегатів в керованому рідкомусередовиші певного складу. Основним способом отримання суспензійних культур є занурення шматочка недиференційованого калусу в рідке поживне середовище, яке перемішується. В більш рідких випадках використовують експлантати тканин, стерильні проростки, які в рідкому поживному середовипїі дедиференціюються і утворюють калус, який розпадається на окремі клітини. Іноді суспензійну культуру можна ініціювати певною кількістю гомогенату тканин, яка містить живі і зруйновані клітини. Для ініціації суспензійної культури необхідно 2-3 г свіжої маси калусноїтканини на 60-100 мл рідкого поживного середовиша. Первинну суспензію отримують на качалці шейкерного типу зі швидкістю перемішування 100-120об/хв. Фактори , які впливають на дисоціацію калусу:
Популяція вільноживучих клітин є зручною моделлю для вивчення фізіологічних закономірностей росту, дифеіренціації, регуляції певних сторін клітинного метаболізму соматичних клітин. Вирощування клітинних суспензій в рідкому поживному середовищі має ряд переваг перед вирощуванням калусних тканин поверхневим способом:
Характерною особливістю суспензійних культур клітин рослин є морфологічна та біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються по формі та розміру. Значне покращення диспергованості клітинної суспензії може бути досягнене при внесенні в поживне середовище низьких концентрацій пекто-целюлозних ферментів (пектинази, целюлази) в невеликих концентраціях (0,02%). Рівень клітинної агрегації змінюється на протязі ростового циклу культури. Клітинні агрегати утворюються, в основному, в експоненціальній фазі в результаті мінімального розділення проліферуючих клітин. Для вирощування клітинних суспензій використовують ті ж середовища, що і для калусних культур. Однією із цікавих особливостей, встановлених при вирощуванні суспензійних культур, є залежність їх розмноження від одночасної або попередньої присутності в середовищі клітин, які активно діляться. Було встановлено, що клітини, які активно діляться не тільки адсорбують поживні речовини середовища, але і якимось чином змінюють, «кондиціонують» її виділяючи продукти власної біосинтетичної діяльності, сприяючи росту одиночних клітин. Способи культивування клітинних суспензій 1. Вирощування калусу на містках-підтримках. Вперше використання обеззолених фільтрувальних підтримок було запропоновано в 1949 році вченими Готре та Еллером для культивування ізольованих тканин в вертикальнихпробірках в рідкому поживному середовищі. На сучасному етапі метод використовується в основному для культивування зав'язей, зародків, проростків.
Безперервні культуральні системи підрозділяють на: -напівпроточні системи, режим вирощування яких оснований на принципі відбору певної частини клітинної суспензії через певний проміжок часу та розведення частини культури, що залишилась свіжим поживним середовищем. Дана система використовується в основному для отримання великої маси суспензії з метою її подальшого біохімічного дослідження.
По принципу відношення до факторів поживного середовища, які покладені в основу безперервного культивування, відкриті проточні системи підрозділяють на: хемостати- це система з суспензією, що перемішується в яку по раніше розробленій програмі з постійною швидкістю безперервно подається свіже середовище і з такою ж швидкістю відбирається частина культури. Загальний об'єм культури при цьому залишається постійним. турбідостати- це системи культивування, в яких проходить при надлишку субстрату, без зовнішнього лімітування фактору живлення. Інтенсивність росту в даному випадку визначається тільки властивостями хімічних і фізичних факторів навколишнього середовища (температури, освітлення, газообмін, кислотність) і швидкістю протікання метаболічних процесів в клітині. Цей вид культивування більш досконалий, так як озволяє в значній мірі автоматизувати роботу ферментера і підтримувати ріст клітинної популяції на протязі декількох років. Основні параметри росту культури клітинних суспензііі. 1. Щільність клітинної популяції - концентрація клітин в 1 мл суспензії. По величині щільності клітинної популяції можна визначити питому швидкість росту і час генерації клітин.
10. Розмір клітин визначають вимірюванням їх довжини і ширини під мікроскопом з допомогою шкали окуляр-мікрометра та об'єкт мікрометра.
Клітини вищих рослин, що довготривало культивуються, утворюють специфічну популяцію. Клітини калусів, що вирощуються поверхнево та клітини суспензій, які культивують глибинно є самостійними одиницями і розмножуються клонально. Популяції соматичних клітин фізіологічно асинхронні і генетично гетерогенні. Найбільш важливою характеристикою популяції є її ріст. Як правило ріст популяції клітин in vitro оцінюють по числу клітин та загальній біомасі, не дивлячись на асинхронність популяції і відносну самостійність клонів, з яких вона складається, клітини in vitro в цілому проходять фази ростового циклу, характерні для клітин вищих рослин in vitro. Ріст клітинної популяції в циклі вирощування виражається 8-образною кривою. В процесі субкультивування клітини послідовно проходять такі фази: 1 |