аминокислоты. Дәріс-14- Биотех негіздері - Амин қыш алу-2020. Таырыбы Амин ышылдарына сипаттама. Лизин жне триптофан аминышылдарын алу
 Скачать 42.69 Kb.
|
|
Дәріс-14. Тақырыбы: Амин қышқылдарына сипаттама. Лизин және триптофан аминқышқылдарын алу. Жалпы амин қышқылдары ауыл шаруашылығында, медицинада кеңінен қолданылады. Олар белокты қоректенуде маңызды роль атқарады. Әсіресе, алмастырылмайтын амин қышқылдарына: бидай, күріш, жүгері, т.б.жатады. Аминқышқылдарын алудың басты тәсілдеріне өсімдік шикізаттарынан белокты гидролизаттау экстракциясы, химиялық синтез, микробиологиялық синтез, оларға иммобилденген микробты клеткаларды және ферменттерді (микроорганизмдерден бөліп алынған) пайдалану жатады. Микробиологиялық синтез қазіргі уақытта көптеген аминқышқылдарды алуда перспективті және экономикалық тиімді болып табылады. Аминқышқылдары продуценттерін өсіру процесінде L-аминқышқылдары тікелей синтезделеді. Аминқышқылдарын микробиологиялық синтезінің басты міндеті - гендік инженерия әдістерін пайдалана отырып, продуцирлеуші жоғары штамдар алу болып табылады. Нақты осы тәсілмен L-трионинді продуцирлеуші жоғары белсенді штамм бөліп алынған. Аминқышқылдарын микробиологиялық синдездеуден басқа гидролиздеу жолымен құрамында белок бар жануар және өсімдік шикізатын алуға болады. Аминқышқылдары микробиологиялық әдістермен синдездеу қоректік ортада көп мөлшерде аминқышқылдары өнімдерін жинақтайтын микроорганизмдердің қабілетіне негізделеді. Микроорганизмдер арасында глутамин қышқылын продуцирлейтін көптеген бактериялар, саңырауқұлақтар, ашытқылар анықталған. Зерттелген штамм микроорганизмдер көбінесе α-аланин және глутамин қышқылын жинақтайды. Ал кейбір штамдарда аз мөлшерде аспарагин, лейцин, валин, изолейцин, лизинді бөліп шығарады. Микроорганизмдер аминқылын бөліп алуда әртүрлі мутагенді факторларды қолданады. Продуцент бірғана аминқышқылын бөліп шығару қажет. Бір уақытта бірнеше аминқышқылдарының жинақталуы оларды бөліп алу және тазартуда қиын. Аминқышқылдары продуцирлеуші микроорганизмдерге грамм оң спорасыз бактериялар: Micrococcus, Corinebacterium, Brevibacterium, Artrobacter туыстары жатады. Аминқышқылдарын синтездеуде ферментативті реакциялар клеткалардың ішкі құрылымында жүзеге асырылады. Алдымен аминқышқылдар клеткалар ішінде бос аминқышқылдар түрінде жинақталады. Культураның бастапқы өсу сатысында бос аминқышқылдары микроорганизмдердің конструктивті алмасуына қатысады. Мерзімді өсіруде аминқышқылдарының белсенді жинақталуы культураның өсуінің экспоненциальді фазасының ортасынан соңғы максимальді деңгейге дейін жүзеге асырылады. Лизин алмаспайтын аминқышқылын алу. Осыдан 50 жыл бұрын Осборн мен Мендель бидай ақуызында лизиннің мөлшері аз екендігін дәлелдеген. Қазіргі уақытта лизин организмде белоктың құрылымды элементі ғана емес, басқа да маңызды биохимиялық қызметтерді атқарады. Қазіргі уақытта көптеген елдерде лизин препаратын биологиялық бағалылығын жоғарылату және сыртқы пішінін жақсарту үшін нанға қосады. Сонымен қатар лизин аппетитті жақсартады, ас қорыту ферменттерінің секрециялануын қалыптастырады, балаларда тіс құртын болдыртпайды. Лизин – жануарлардың жем азықтарында жетіспейтін алмаспайтын аминқышқылы болып табылады. Егер лизинді жемге 0,1-0,4% қосқан жағдайда үй жануарларының өнімділігін жақсартады. Лизинді биосинтездеуде Brevibacterium sp., Micrococcus, Corynebacterium және т.б. ауксотрофты бактериялар туыстары жатады. Лизиннің продуценттері құрамында көмірсулар немесе сірке қышқылы, азот көзі және оттегі бар ортада өсіріледі. Бактериялар клеткаларында лизин пирожүзім қышқылынан, аспарагин және янтар қышқылынан синтезделеді. Лизинді алу барысында қажетсіз аралық өнімдер болмау қажет. Егер аэрация жетіспеген жағдайда лизиннің орнына аланиннің немесе сүт қышқылының түзілуі жүреді. Қоректік ортада гомосерин, метионин және треонин - аминқышқылдардың концентрациясының болуы маңызды фактор болып саналады. Brevibacterium sp. 22 культурасы лизинді биосинтездеуде және қалыпты өсу үшін 1 литр қоректік ортада 800 мг- треонин, 200 мг – метионин концентрациясы болу қажет. Сонымен қатар культураның өсуіне 200 мкг/л тиамин де қажет. Осы процестің маңызды реттегіші – биотин болып саналады. Мысалы, Brevibacterium sp. 22 1-4 мкг/л биотин бар қоректік ортада глутамин қышқылын синтездейді, ал 15-20 мкг/л концентрацияда лизинді синтездейді. Биотин клетка қабықшасының өткізгіштігін жоғарылатады. 2,5 мг/л биотин концентрациясы сүт қышқылының түзілуін қалыптастырады. Ферментацияның бастапқы сатысында өсу факторы ретінде треонин болу қажет. Алайда оның концентрациясы жоғары болмау қажет, себебі ферментацияның басқа сатыларында аспартаткиназа ферментінің ингибиторы ретінде әсер етуі мүмкін. Өндірістік жағдайда  1 молекула глюкозадан 0,35 молекула лизин түзіледі. Глюкозаның әрбір молекуласын қайта өңдеу кезінде 2,19 молекула оттегі қажет. Яғни культураның өсуі барысында аэрация көлемі 1 л қоректік ортада 2-4г оттегін құрайды. Лизин алуда қоректік орта мелассадан (7-12 қант), жүгері экстрактісі (1-2), аммоний тұздары (1-2), бір немесе екі алмасатын калий фосфатынан (0,05) тұрады.
Қоректік ортаны стерилиизациялағаннан кейін егу материалын өсіруге және басты ферментацияға қолданады. Алдымен культураны колбаларда, сосын көлемі 100 және 3000 л ферментерларда өсіреді. Егу материалының мөлшері 5-10, температура 30-33С, рН – 7,4. Егу материалының ферментация ұзақтығы әрбір сатыда 24 сағ. Құрайды. Басты ферментация 50-70 сағ құрайды. Лизиннің концентрациясы ерітіндіде 20-40г/л, қанттың көлемі 25-35. Клетка биомассасының концентрациясы 10-15 г/л құрайды. Мелассаны сахарозаға, қант қызылшасы шырынына, глюкоза немесе крахмал гидролизатына, ағаш сүрегі, қи сонымен қатар сірке қышқылымен алмастыруға болады. Кристалды лизин алуда клетка биомассасын центрифугалайды, ал культуральді сұйықтықты КУ-2 немесе КВ -4-Р-2 катиониттен өткізеді. Лизинді 2,0-3,5% аммоний гидроксидімен элюирлейді, элюатты вакуумда 60°С температурада булайды. Сосын тұз қышқылы көмегімен рН 4,5-5,0 келтіреді 14-18°С суытады және криссталтайды. Криссталдарды филтрлеу немесе центрифугалау арқылы техникалық лизин алады, оның құрамында 94-96% лизин монохлоргидрат болады. Таза лизин алуда кристалды техникалық лизинді аз мөлшерде сумен 70°С температураға дейін қыздырады, оған белсенді көміртегі қосады, араластырады және сүзеді. Тұз қышқылы көмегімен рН-4,9 келтіреді, ерітіндіні булайды және кристалдайды. Кристалдарды 60°С температурада кептіреді. Осылайша алынған лизиннің құрамында 99,9% лизин монохлоргидраттан, 0,1% күоден және 0,001% ауыр металдардан тұрады. Лизинді фильтраттан бөліп алғаннан соң және бетаин алынады, оны медицинада (асидин препаратын), мал шаруашылығында қолданады. Жем азығы ретінде лизин концентратын қолданады. Ол үшін ферментациядан кейін культуральді сұйықтықты рН 5,0-6,0 дейін қышқылдайды, тұрақтандыру үшін 0,15% натрий бисульфитін қосады және вакуум-аппараттарда құрғақ қосылыстар 40-50% болғанға дейін булайды. Алынған лизиннің сұйық концентратын (ЛСК) жем азықтарын байытуда қолданады. Лизиннің сұйық концентратын шашыратқын кептіргіштерде (300°С температурада) кептіру барысында лизиннің құрғақ концентратын алады (ЛҚК). Лизиннің ферментация өнімдерін термиялық құрғату барысында ортада лизиннің редуцирлеуші қанттармен байланысуы болуы мүмкін. Глюкозамен немесе басқа қосылыстармен мысалы, карбониль топтарымен, лизиннің ɛ-аминотоптарымен байланысу барысында ағзада сіңірілмейтін формаға айналуы мүмкін. Сондықтан ферментация кезінде редуцирлеуші қосылыстар толығымен пайдаланылуы тиіс, лизин ерітіндісінің рН-ы кептіру және булау алдында қышқыл болуы тиіс, сонымен қатар ортаны натрий сульфитімен немесе натрий гексамет фосфатпен тұрақтандырады. Лизиннің жемдік концентратының құрамы:
Құрғақ ЖҚЛ ылғал жұтқыш болып келеді, сондықтан оларды кептіргеннен соң бірден полиэтиленді – қағаз қапшықтарға салады. Лизин концентратының құрамында биологиялық белсенді қосылыстардвғ болуына байланысты витаминді-аминқышқылды премикстер дайындауда қолданылады. Лизинді екі сатылы әдіспен де алуға болады. Бірінші сатыда микробиологиялық синтез (лизин биосинтезіне ұқсас) немесе химиялық синтез (толуол, керосин) көмегімен α, ɛ- диаминопимелин қышқылын алады. Екінші сатыда α, ɛ- диаминопимелин қышқылының ферментативті декарбоксилденуі жүреді. Триптофан. Триптофан ароматты аминқышқылдары фенилаланин және тирозин сияқты кең қолданысқа ие. Триптофанның организмде тапшы болуы қатты ауруларға (диабет, түберкулез, пеллагра) әкеліп соғады. Триптофанды медицинада қолданады, сонымен қатар биохимиялық реакцияларда реагент ретінде және аз мөлшерде мал шаруашылығында қажеттіліктер үшін қолданылады. Триптофанды антранил қышқылынан Candida немесе Hansunella ашытқы штамдары қолданылады. Антранил қышқылы улы болып саналады. Ашытқыларды өсіруде меласса, қант қызылшасының диффузиялық шырын, сахароза, көміртегі көздері қолданылады. Триптофанның микробиологиялық синтезі Өндірісте триптофанды алуда: ауксотрофты мутантты бактериялар көмегімен бір сатылы синтез және екі сатылы синтез яғни алдымен триптофанды басты қосылыстан (антранил) алады да, сосын оны ферментативті жолмен соңғы өнімге – триптофанға айналдырады. Бактерияларда және басқа да организмдерде триптофан эритрозо-4-фосфат және фосфоенолпирожүзім қышқылынан түзіледі, мұнда бірнеше жүйелі реакциялардан, яғни шикимова және хоризмов қышқылдары түзіледі, олан әрі триптофанның басты қосылысы антранил қышқылы болып табылады (26-сурет). Триптофан синтезі соңғы өнімдермен аллостерлі ингибирленеді, яғни хоризма қышқылының түзілуіне байланысты бастапқы сатыларды катализдейтін ферменттерге әсер етеді. Триптофанның басты қосылыстан түзілу үшін хоризма қышқылы префен қышқылына айналуын блокирлейді, ол мутагенді факторлар әсерімен жүзеге асырылады. Фосфопируват Эритрозо-4-фосфат  5  -Дегидрохин қышқылы Шикимова қышқылы  Х  оризма қышқылы Антранил қышқылы Триптофан П рефен қышқылы n-Оксифенилпирожүзім қышқылы Фенилпирожүзім Тирозин қышқылы  Фенилаланин 26-сурет – Триптофан, фенилаланин және тирозин синтезінің сызбанұсқасы Продуценттері. Триптофанның өндірісте алуда ауксотрофты мутант Bacillus subtilis бактерия туысы негізінде технологиясы өнделген. Барлық технологиялық процестер лизинді алу сызбанұсқасы бойынша жүзеге асырылады. Ферментация ұзақтығы 48 тәулік 37°С температурада,триптофанның концентрациясы культуральді сұйықтықта 10 г/л құрайды. Культуральді сұйықтықты бактерия клеткаларынан бөліп алғаннан кейін, оны булайды және 110-120°С кептіреді. Кептірілген өнімді триптофанның азықтық концентраты (ТАК) деп атайды. Триптофаннан жоғары концентрленген препараттарын алу үшін культуральді сұйықтықты қосымша тазарту арқылы жүзеге асырылады. Алдымен оны тұз қышқылымен рН - 1,0 дейін қышқылдайды және центрифугалау арқылы түзілген тұнбаны бөліп алады. Одан әрі триптофан бар центрифугатты катион алмастырғыш колонкалар арқылы жіберіледі, нәтижесінде аминқышқылдармен байланысу жүреді де, оны культуральді сұйықтықтан бөліп алады. Колонкаларды шайылғаннан соң триптофанды 5% аммиак ерітіндісімен десорбциялайды. Элюатты вакуум-булағыш аппаратына жібереді, аяқталғаннан кейін аминқышқылын 4-8°С кристалдайды. Кристаллды түрде бөлінген триптофан тұзын этанолмен жуады да, 60°С вакуумда кептіреді. Кептірілген кристалды препаратта 99% триптофан хлорид түрінде болады. Культуральді сұйықтықтан бөліп алынған құрамында бактериялар клеткаларынан тұратын тұнбаны кептіреді, сосын оны жоғары ақуызды азықтық қоспа ретінде қолданады. Триптофанды синтездеу екі сатылы сызбанұсқада жүзеге асырылады. Алдымен химиялық синтездеу әдісімен триптофанның басты қосылысы – антранил қышқылын алады, сосын микроп тектес ферменттер қатысымен триптофанға айналдырады. Антранил қышқылының триптофанға биохимиялық айналуы 3 сатыдан тұрады: бірінші сатыда антранил қышқылынан фосфорибозилпирофосфат қатысында аминогликозид – N-(5-фосфорибозил)- антранил қышқылы түзіледі, екінші сатыда ішкімолекулалық қайта топтасудан және декарбоксилирлену нәтижесінде индол-3-глицерофосфатқа айналады. Соңғы сатыда триптофансинтетаза ферменті әсерінен индол -3-глицерофосфаттан және сериннен триптофан түзіледі. Осыған байланысты триптофансинтетаза ферментінің белсенді тобы ретінде пиридоксальфосфат қызмет атқарады, бұл коферменттің ортада болуы антранил қышқылының триптофанға айналуын жылдамдатады. Фермент көзі ретінде ашытқылар пайдаланылады. Антранил қышқылының триптофанға биохимиялық айналуының өндірістік процесі екі сатыдан тұрады. Бірінші сатыда ферменттерді продуцирлейтін ашытқы биомассалары өсіріледі. Ашытқыларға арналған қоректік орта қызылша мелассадан, мочевинадан, минеральді тұздардан дайындалады. Ферментация 24 тәулік аралығында 30°С температурада жүргізіледі. Одан әрі ферментерға антранил қышқылының 5% спиртті ерітіндісі және 50% мочевина ерітіндісі қосылады. Ферментерға антранил қышқылы қосылғаннан кейін 3-4 сағаттан соң қосымша көміртегі субстраты – мелассаның 25% ерітіндісі беріледі. Ферментацияның келесі сатыларында антранил қышқылы мен мочевина әрбір 6 сағат сайын және меласса ерітіндісі – 12 сағат сайын мерзімді беріліп отырылады. Ферментациялау ұзақтығы 120 сағат, ал ашытқы биомассаларын қосы есептегенде – 144 сағатты құрайды. Триптофанды медицинада қолданады. Сонымен қатар триптофанды Candida және Hansunella ашытқы штамдарын қолдана отырып, антранил қышқылын алады. Антранил қышқылы улы болып табылады. Ашытқылар триптофанды синтездей отырып, олардың клеткалары уытты қосылыстардын босатылады. Ашытқылады өсіруде қолданылатын шикізаттарға меласса, қант қызылшасының шырыны, көмірсулар –сахароза жатады. L-триптофан алуда Candida utilis 295 ашытқы мутантын қолданады. Candida utilis мутант клеткасы антранил қышқылын 3,4 цикл аралығында тасымалдауға қабілетті. Сонымен қатар өндірісте Candida utilis мутантын ферментациялауда 2 сатылы процесті қолданады. 1-ші сатыда турбистат әдісі бойынша меласса қоректік ортада белсенді биомассалары жинақталады. Ал 2-ші сатыда антранил қышқылының микробиологиялық жолмен триптофанға тасымалдануы жүзеге асырылады. 1-ші сатыда биомасса концентрациясы 120 г/л дейін болу қажет. Осы биомассада ғана 6г/л триптофан алынады. Ашытқылардың белсенді штамдарын сусло агарда 4°С-та сақтайды. |