Тема 1.
Техника гистологического исследования
В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей.
1.1. Световая микроскопия
1.1.1. Устройство микроскопа
В микроскоп входят 3 системы -
 оптическая,
осветительная и
механическая.
1. Оптическая система включает объектив и окуляр.
а) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название).
|
Схема - строение светового микроскопа.
Полный размер
|
Обычные увеличения объектива:
 8 , 20 , 40 (сухие объективы),
90 (иммерсионный объектив).
При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.
б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением
7, 10, 15.
в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например:
20 10 = 200 раз.
г) Таким образом, функция оптической системы -
формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.
|
2. Осветительная система - источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.
а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа).
б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.
|
|
Одна поверхность зеркала - плоская, вторая - вогнутая;
последняя используется при искусственном освещении.
в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.
г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.
Она ограничивает световой поток, падающий на препарат.
При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить - для ослабления сферической аберрации.
|
3. Механическая система - тубус (2), штатив (8), колонка (9) и предметный столик (10).
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты.
Они поднимают и опускают штатив с тубусом для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.
|
|
Макровинт используется при работе на малом увеличении,
а микровинт - на большом.
б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения.
|
В итоге, световые лучи проходят следующий путь:
источник света (4)  зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3).
Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.
Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.
|
1.1.2. Приготовление гистологического препарата
1. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:
а) срезы органов (толщиной 5-15 нм),
б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки),
в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты
Чаще всего используются срезы.
2. Приготовление препарата обычно включает 5 следующих этапов:
а) взятие и фиксация материала,
б) обезвоживание и уплотнение материала,
в) приготовление срезов,
г) окрашивание препаратов и
д) заключение в консервирующую среду.
|
1.1.2.1. Взятие и фиксация материала
1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч.
2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей.
Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков.
3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.
|
1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала
1. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме.
Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин.
2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).
а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов -
70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол -
до 24 часов (в зависимости от размера образца) в каждом спирту.
б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.
3. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин
на 1-2 ч при 52-56о С.
Дают парафину, остывая, затвердеть;
вырезают из него блок с заключённым образцом и
закрепляют на деревянном кубике.
|
1.1.2.3. Приготовление срезов
1. Кубики вставляют в специальный прибор - микротом, - служащий для приготовления срезов.
2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).
б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.
3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем - на предметное стекло.
|
1.1.2.4. Окрашивание препаратов
1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей:
ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)
(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)
2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами
помещают на определённое время в раствор красителя,
промывают водой,
обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и
вновь промывают водой.
|
1.1.2.5. Заключение препарата в консервирующую среду
1. Окрашенный препарат
опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией),
а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски.
2. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или
кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.
|
1.1.2.6. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления
1. Примеры тотального препарата - участки сальника или мягкой мозговой оболочки, растянутые на предметном стекле.
2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 5-и перечисленных в п. 1.1.2. этапов опускаются два -
уплотнение материала и
приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя).
3. Остаются:
фиксация,
окраска и
заключение в консервирующую среду.
|
В остальных же случаях (т.е. при получении срезов) приготовление гистологического препарата - весьма долгая и трудоёмкая процедура.
Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.
1.1.2.7. Экспресс-метод приготовления срезов
1. В ряде случаев (при экспресс-диагностике в ходе хирургической операции или при гистохимическом исследовании) применяют иную методику приготовления срезов:
изучаемый образец органа замораживают (без фиксации) углекислотой или жидким азотом;
это позволяет его сразу резать (получая тонкие срезы), минуя проводку по спиртам и заливку.
2. Но резка должна производиться в криостате или на специальном замораживающем микротоме.
|
1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов
1.1.3.1. Типы красителей
Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-
Тип
красителя
|
Пример
|
Окрашиваемые структуры
|
Кислые красители
|
Кислоты и кислые соли :
эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря);
кислый фуксин.
|
а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям).
б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
|
Основные красители
|
Основные соли :
гематоксилин
(точнее, продукт его окисления - гематеин);
азур 2, кармин.
|
а) Красящиеся структуры -
базофильные (сродство к основным красителям).
б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами -
ядра,
рибосомы,
аморфный компонент межклеточного вещества.
|
Нейтраль-
ные красители
|
Смесь двух красителей:
основного (азур 2) и
кислого (эозин).
|
а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином;
пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах.
б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
|
Индиффе-
рентные
красители
|
Судан III,
судан IV
|
Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).
|
Существует большое количество различных способов окраски.
Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.
1.1.3.2. Общие методы окраски
I. Окраска гематоксилин-эозином
1.а) Самый распространённый метод окраски.
б) Сочетает основной и кислый красители.
в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.
2. При этом
ядра прокрашиваются гематоксилином, т.е. приобретают сине-фиолетовый цвет,
а цитоплазма красится эозином в желтовато-розовый цвет.
3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
|
1. Препарат - срез тонкой кишки. Окраска гематоксилин-эозином. (*)
а) На снимке видны кишечные ворсинки (1): они находятся на внутренней поверхности тонкой кишки.
б) Ворсинки покрыты одним слоем эпителиальных клеток.
в) Ядра (2) этих клеток – фиолетового,
а цитоплазма (3) – розового цвета.
|
Полный размер
|
(*) Препараты, отмеченные в теме 1 звёздочкой и имеющие порядковый номер, изучаются на практическом занятии, а также входят в тесты по этой теме.
II. Окраска мазков по Романовскому
1. Применяется для окраски мазков крови и красного костного мозга. Здесь тоже используются 2 красителя:
основной – азур II, окрашивающий базофильные структуры в тёмно-синий цвет,
и кислый – эозин, красящий оксифильные структуры в ярко-розовый цвет.
2. Отличия от приготовления срезов таковы:
фиксацию мазков проводят чистым метанолом;
окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не несколько часов;
для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам.
3. В результате
эритроциты приобретают розовый цвет,
цитоплазма большинства лейкоцитов – голубой или синий цвет,
цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.
|
Препарат – мазок крови.
Среди многочисленных эритроцитов видны:
лейкоцит (1) с очень мелкой нейтрофильной (фиолетово-розовой) зернистостью в цитоплазме,
а также гораздо более мелкие тромбоциты.
|
|
III. Окраска железным гематоксилином (по методу Генденгайна)
1. Препарат
предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами,
а потом обрабатывают гематоксилином.
2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет.
3. Хорошо выявляются
|
структуры ядра,
границы клеток,
мышечные волокна.
Препарат - срез языка.
В мышечных волокнах видны ядра (1) и отчётливая поперечная исчерченность.
|
|
1.1.3.3. Выявление неклеточных структур соединительной ткани
I. Выявление коллагеновых волокон
А. Окраска по методу Маллори.
1. Краситель – смеськислого фуксина, анилинового синего и оранжевого G.
2. Коллагеновые волокна окрашиваются в синий цвет.
|
Препарат - срез мышцы.
Мышечные волокна (1) – розовые,
а прослойки соединительной ткани (2 и 3) между ними – синие.
|
|
2. Препарат - срез яичника кролика. Окраска по Маллори. (*)
а) На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.
Цитоплазма (1) клетки окрашена в слабо-розовый,
окружающая её блестящая оболочка (2) - в сине-голубой,
а ядра фолликулярных клеток (3) - в фиолетовый цвет.
|
Полный размер
|
б) Синий цвет блестящей оболочки свидетельствует о том, что в ней, помимо прочих компонентов, содержатся коллагеновые волокна.
3. Окраска по Маллори используется не только для выявления компонентов соединительной ткани, но и в иных целях –
например, для дифференциации эндокринных клеток гипофиза.
|
Б. Окраска по методу Ван Гизона.
Красители – пикриновая кислота и кислый фуксин:
коллагеновые волокна окрашиваются в ярко-красный цвет,
а элементы других тканей (напр., мышечные волокна) – в жёлтый цвет.
|
II. Выявление ретикулярных волокон –
импрегнация серебром.
1. Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем – восстановителями.
2. Выделяющееся серебро осаждается на ретикулярных (аргирофильных) волокнах(богатых SH-группами),
и волокнаприобретают чёрный цвет.
|
Препарат - срез лимфоузла.
Видны многочисленные ретикулярные волокна (1), образующие густую сеть.
|
|
III. Выявление эластических элементов
А. Окраска орсеином:
эластические волокна и мембраны(если таковые имеются) приобретают вишнёвый цвет;
остальные структуры – слабо-розовый.
|
Препарат - срез аорты.
В её средней оболочке (II) обнаруживаются многочисленные эластические мембраны (1) – в виде толстых извилистых линий, расположенных концентрически.
|
|
Б. Окраска пикрофуксином и гематоксилином:
эластические волокна окрашиваются в жёлтый цвет,
коллагеновые волокна – в красный цвет,
ядра клеток – в фиолетовый цвет.
|
Препарат - срез эластической связки.
Видны пучки эластических волокон (1) и между ними – клетки (фиброциты) (2).
|
|
IV. Выявление элементов костной ткани –
окраска по методу Шморля
1. Вначале кусочек кости для размягчения подвергают декальцинации (с помощью кислоты).
2. Краситель – раствор тионина.
3. Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет; остальной фон – светло-коричневый.
|
3. Препарат - срез трубчатой кости. Окраска по Шморлю. (*)
В костном веществе видны
костные полости (1), содержащие тела костных клеток (остеоцитов),
и костные канальцы (2), содержащие отростки остеоцитов.
|
Полный размер
|
1.1.3.4. Выявление элементов нервной системы
I. Выявление клеток нервной системы и их отростков –
импрегнация нитратом серебра
1. В этом методе
фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней,
а уплотнение образца осуществляют путём замораживания.
2. При окрашивании срез обрабатывают растворами
азотнокислого серебра,
формалина,
аммиачного серебра.
|
3. Клетки и волокна нервной системы окрашиваются в чёрный цвет, а окружающие ткани – в светло-коричневый цвет.
Препарат - срез спинного мозга.
Видны нервные клетки, имеющие
тёмную цитоплазму,
более светлое ядро (1) и
отростки (2 и 3).
|
|
II. Выявление базофильных структур в цитоплазме нейронов –
окраска по методу Ниссля
1. Красителем служит толуидиновый синий, окрашивающий умеренно базофильные соединения в синий цвет.
2. Таким образом в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля).
|
Препарат - срез спинного мозга.
Вышеуказанные глыбки содержатся в теле (1) нейрона и в некоторых отростках (2).
|
|
III. Выявление миелиновых нервных волокон –
фиксация или импрегнация осмием
а) Метод применим для выявления всех структур, богатых липидами или жирами, – мембран, жировых или липидных капель и т.д.
б) Растворяя в себе осмиевую кислоту, эти структуры приобретают чёрный цвет.
|
Препарат - поперечный срез нерва.
а) Видны поперечные срезы миелиновых нервных волокон.
б) У каждого из них светлый осевой цилиндр (1) окружён толстой миелиновой оболочкой (2).
|
|
в) Последняя имеет мембранную природу и потому – осмиофильна.
|
1.1.4. Гистохимические методы исследования
а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата.
б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.
I. Реакция Браше – на РНК
1. Реактив – смесь двух красителей: метилового зелёного и пиронина.
2. Пиронин окрашивает структуры, богатые РНК, в малиновый цвет. Другие структуры – зелёные.
3. Чтобы проверить специфичность окраски, делают контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой.
|
Препарат - срез поджелудочной железы.
В малиновый цвет окрашены
цитоплазма (1) и
ядрышки (2) секреторных клеток –
из-за высокого содержания в них РНК (в составе рибосом и их предшественников).
|
|
II. Реакция Фёльгина – на ДНК
1. Основной реактив – фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).
2. а) Под его действием ДНК-содержащие структуры окрашиваются в вишнёвый цвет.
б) Прочие структуры – зелёные.
|
Препарат - срез печени.
Распределение окраски – противоположное предыдущему:
в вишнёвый цвет красится хроматин (1) в ядрах,
|
|
а ядрышки (2) и цитоплазма (3) клеток оказываются зелёными.
|
III. Реакции на белки
Используются различные реакции; в том числе:
а) с бромфеноловым синим (у белков - тёмно-фиолетовая окраска);
б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа (белки приобретают красный цвет).
|
IV. ШИК-реакция – на полисахариды
1. Реактив - Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК).
2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.
3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют фиолетовый или тёмно-красный цвет.
|
Препарат - срез тонкой кишки.
а) На снимке (как и в п. 1.1.3.2.I)) – кишечная ворсинка.
б) В составе покрывающего её эпителия выделяются своей фиолетовой цитоплазмой т.н. бокаловидные клетки. (1).
|
|
в) Эти клетки активно секретируют слизь, отчего в их цитоплазме накапливаются полисахариды – компоненты слизи.
|
V. Реакция с толуидиновым синим – на гликозамингликаны.
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия – изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.
2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты межклеточного аморфного вещества соединительной ткани –
|
гликозамингликаны (являющиеся гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).
Препарат - срез аорты.
Снимок показывает, что стенка аорты богата гликозаминогликанами.
|
|
VI. Реакция с суданом III – на нейтральный жир
1. Как уже отмечалось в п. 1.1.3.1, судан III – представитель индифферентных, или липофильных, красителей.
2. Проникая в клетки, он (подобно осмиевой кислоте; п. 1.1.3.3) растворяется в жировых и липидных каплях и тем самым окрашивает их в ярко-оранжевый цвет.
|
4. Тотальный препарат сальника. Окраска суданом III и гематоксилином. (*)
а) Препарат является тотальным, т.е. перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутый на предметном стекле.
б) Видны жировые клетки;
каждая из них содержит крупную каплю жира (1), которая
занимает почти всю цитоплазму и
окрашена в ярко-оранжевый цвет.
|
Полный размер
|
в) Клеточные ядра (2) должны краситься гематоксилином в фиолетовый цвет. В данном случае они окрашены весьма слабо.
г) Ядро оттесняется жировой каплей к периферии клетки.
|
1.2. Электронная микроскопия
а) В световом микроскопе увеличение составляет от 10 до 1000 раз.
б) Электронный же микроскоп даёт увеличение от 100 до 500.000 (и даже более) раз, т.е. его максимальное увеличение примерно в 100 раз больше.
1.2.1. Принцип работы электронного микроскопа
1.2.1.1. Особенности:
электронная волна, электромагнитные "линзы"
1. В электронном микроскопе образец облучается не видимым светом, а пучком электронов.
Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой.
Соответственно, такая волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше.
2. Конструктивная же особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки.
|
Внешний вид электронного микроскопа
|
1.2.1.2. Типы электронных микроскопов
Основные типы электронных микроскопов:
трансмиссионные (просвечивающие) и
сканирующие (растровые).
1. При трансмиссионной микроскопии
пучок электронов проходит через изучаемый объект,
и в результате получается плоскостное изображение объекта.
2. При сканирующей же микроскопии
на поверхность объекта вначале наносится металлическое напыление,
а в ходе микроскопии электронный пучок последовательно “пробегает” по всем точкам поверхности объекта (сканирует поверхность), выбивая из напылённого вещества вторичные электроны (бета-лучи).
Последние формируют пространственное изображение поверхности.
|
1.2.1.3. Ход "лучей" в трансмиссионном микроскопе
Ход "лучей" рассмотрим лишь для трансмиссионного микроскопа.
В принципе, этот ход таков же, как в световом микроскопе.
1. а) Источником электронов служит катод (1),
а движущей силой - разность потенциалов между катодом и анодом (2).
б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.
в) Чтобы их поток далее не ослабевал, в тубусе микроскопа создаётся высокий вакуум.
|
Схема - ход лучей в световом (I) и электронном (II) микроскопе.
Полный размер
|
2. а) Одна электромагнитная катушка (3) служит в качестве конденсора (фокусирует пучки на образце (4)),
б) вторая катушка (5) - в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),
в) а третья катушка (6) - в качестве окуляра, или проекционной линзы.
|
3. Электронные "лучи", проходящие через последнюю катушку, попадают далее на люминесцентный экран (7) и вызывают его свечение в месте падения электронов.
|
1.2.2. Особенности приготовления препарата
1. Взятие материала и
фиксация
|
Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3 ),
а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии:
вначале глутаральдегидом (стабилизация белков),
затем - четырёхокисью осмия (стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).
|
2. Уплотнение материала
|
1. Образцы, как обычно, обезвоживают,
а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы .
2. а) Заливку производят в специальных формах,
б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате,
в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей.
|
3. Приготовление
срезов
|
1. Срез делают с помощью ультратома;
их толщина - 30-50 нм (ср. с микротомными срезами - 10.000 – 20.000 нм).
2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла).
|
4. Окрашивание
срезов
|
1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана).
б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны.
2.Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными.
|
|
Скачать 0.57 Mb.