Учебник в 2 томах Под редакцией
 Скачать 0.74 Mb.
|
|
Глава 5 ГЕНЕТИКА МИКРОБОВ 5.1. СТРОЕНИЕ ГЕНОМА БАКТЕРИЙ Наследственная информация хранится у бактерий в форме после- довательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последователь- ность аминокислот в белке (строение ДНК изложено в разделе 3.1 и по- казано на рис. 3.1). Каждому белку соответствует свой ген, то есть дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательно- сти нуклеотидов. Совокупность всех генов бактерий называется геномом . Размеры ге- нома определяются количеством нуклеотидных пар оснований (н.п.). Геном бактерий имеет гаплоидный набор генов. Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной ре- пликации (воспроизведению), то есть репликонов. Репликонами явля- ются бактериальная хромосома и плазмиды. 5.1.1. Бактериальная хромосома Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной мо- лекулой ДНК. Размеры бактериальной хромосомы у различных пред- ставителей домена Procaryotae варьируют. Например, у Е. coli бактери- альная хромосома содержит 4,7×10 6 н.п. На ней располагается около 4300 генов. Для сравнения: размеры ДНК вирусов составляют порядка 10 3 н.п., дрожжей — 10 7 н.п., а суммарная длина хромосомных ДНК че- ловека составляет 3×10 9 н.п. Бактериальная хромосома у Е. coli представлена одной кольцевой мо- лекулой ДНК. Одну кольцевую хромосому имеет также ряд других бак- терий: Shigella spp., Salmonella spp., P. aeruginosa, B. subtilus. Однако такое строение генома не является универсальным. У некоторых бактерий, 182 Часть I. Общая микробиология в частности у V. cholerae, L. interrhogans, Brucella spp.,имеется две коль- цевых хромосомы. У ряда других бактерий (B. burgdorferi, Streptomyces spp.)обнаружены линейные хромосомы. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бакте- риальной клетки. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции. 5.1.2. Плазмиды бактерий Плазмиды представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК раз- мером от 10 3 до 10 6 н.п. Они могут быть кольцевой формой и линей- ными. Плазмиды кодируют не основные для жизнедеятельности бакте- риальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие: ● устойчивость к антибиотикам; ● продукцию факторов патогенности; ● способность к синтезу антибиотических веществ; ● образование колицинов; ● расщепление сложных органических веществ; ● образование ферментов рестрикции и модификации. Репликация плазмид происходит независимо от хромосомы с участием того же набора ферментов, который осуществляет репликацию бактери- альной хромосомы (см. раздел 3.1.7 и рис. 3.5). Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это озна- чает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид. Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку. Для характеристики плазмидных репликонов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспо- собностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бакте- риальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, кото- рые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же механизмом. Плазмиды, которые могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона, называются «интегративные», или «эписомы». Глава 5. Генетика микробов 183 Плазмиды, способные передаваться из одной клетки в другую, ино- гда даже принадлежащую иной таксономической единице, называют- ся «трансмиссивные» («конъюгативные»).Трансмиссивность присуща лишь крупным плазмидам, имеющим tra-оперон, в который объедине- ны гены, ответственные за перенос плазмиды. Эти гены кодируют по- ловые пили, которые образуют мостик с клеткой, не содержащей транс- миссивную плазмиду, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку. Этот процесс называется конъюгацией (подробно он будет рас- смотрен в разделе 5.4.1). Бактерии, несущие трансмиссивные плазми- ды, чувствительны к «мужским» нитевидным бактериофагам. Мелкие плазмиды, не несущие tra-гены, не могут передаваться сами по себе, но способны к передаче в присутствии трансмиссивных плаз- мид, используя их аппарат конъюгации. Такие плазмиды называют «мобилизуемые» ,а сам процесс — «мобилизация»нетрансмиссивной плазмиды. Особое значение в медицинской микробиологии имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам, которые по- лучили название R-плазмид (от англ. resistance — противодействие), и плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности, спо- собствующих развитию инфекционного процесса в макроорганизме. R-плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, раз- рушающих антибактериальные препараты (например, антибиотики). В результате наличия такой плазмиды бактериальная клетка становит- ся устойчивой (резистентной) к действию целой группы лекарственных веществ, а иногда и к нескольким препаратам. Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, распространяясь в популяции бактерий, делая ее недоступной к воздействию антибактериальных препаратов. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, очень часто являются этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Плазмиды, детерминирующие синтез факторов патогенности, в настоящее время обнаружены у многих бактерий, являющихся возбу- дителями инфекционных заболеваний человека. Патогенность возбу- дителей шигеллезов, иерсиниозов, чумы, сибирской язвы, иксодового бореллиоза, кишечных эшерихиозов связана с наличием у них и функ- ционированием плазмид патогенности. Некоторые бактериальные клетки содержат плазмиды, детерми- нирующие синтез бактерицидных по отношению к другим бактериям веществ. Например, некоторые Е. coli владеют Col-плазмидой, опреде- ляющей синтез колицинов, обладающих микробоцидной активностью 184 Часть I. Общая микробиология по отношению к колиформным бактериям. Бактериальные клетки, не- сущие такие плазмиды, обладают преимуществами при заселении эко- логических ниш. Плазмиды используются в практической деятельности человека, в частности в генной инженерии при конструировании специальных ре- комбинантных бактериальных штаммов, вырабатывающих в большом количестве биологически активные вещества (см. гл. 6). 5.1.3. Подвижные генетические элементы Подвижные генетические элементы обнаружены в составе бакте- риального генома как в бактериальной хромосоме, так и в плазмидах. К подвижным генетическим элементам относятся: ● вставочные последовательности; ● транспозоны. Вставочные (инсерционные) последовательности — IS-элементы (от англ. insertion sequences) — это участки ДНК, способные как целое пе- ремещаться из одного участка репликона в другой, а также между ре- пликонами. IS-элементы имеют размеры 1000 н.п. и содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения — транс- позиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулиру- ет весь процесс перемещения. Эти гены по флангам окружены инверти- рованными повторами,которые служат сайтами рекомбинации, сопро- вождающей перемещения вставочной последовательности при участии транспозиционных ферментов, в частности транспозаз. Инвертированные повторы узнает фермент транспозаза (рис. 5.1), которая осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, располо- женных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дубли- кат перемещается на новый участок. Перемещение подвижных генетических элементов принято назы- вать репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако, в отли- чие от бактериальной хромосомы и плазмид, подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их ре- пликация — составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся. IS-элементы различаются по размеру, типу и количеству инвертиро- ванных повторов. Глава 5. Генетика микробов 185 Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойства- ми, что и IS-элементы, но имеющие в своем составе структурные гены, то есть гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфи- ческим биологическим свойством, например токсичностью, или обес- печивающих устойчивость к антибиотикам. Перемещение подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами вызывает: ● инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются; ● образование повреждений генетического материала; ● слияние репликонов, то есть встраивание плазмиды в хромосому; ● распространение генов в популяции бактерий, что может приво- дить к изменению биологических свойств популяции, смене воз- будителей инфекционных заболеваний, а также способствует эво- люционным процессам среди микробов. 5.1.4. Интегроны Помимо плазмид и подвижных генетических элементов, у бактерий существует еще одна система, способствующая распространению ге- нов, — система интегронов. Интегроны являются системой захвата ма- лых элементов ДНК, называемых «генные кассеты» ,посредством сайт- специфической рекомбинации и их экспрессии. Интегрон состоит из консервативного участка, расположенного на 5’-конце, который содержит ген, кодирующий фермент интегразу, сайт рекомбинации att и промотор Р (рис. 5.2). ТЦГТ АГЦА АГЦА ТГЦТ 1 1 2 2 1 – ген репрессора 2 – ген транспозазы Транспозаза Рис. 5.1. Схема строения IS-элемента: 1 — ген репрессора; 2 — ген транспозазы (стрелками указаны места разрывов) 186 Часть I. Общая микробиология Кассета может существовать в двух формах: линейной, когда кас- сета интегрирована в интегрон, и в виде маленькой кольцевой двух- цепочечной ДНК. Кассеты имеют размеры от 260 до 1500 н.п. Они содержат преимущественно 1 ген антибиотикорезистентности и сайт рекомбинации, состоящий из 59 пар оснований, расположенный на 3 ’ -конце. Интеграза осуществляет рекомбинацию между участком 59 н.п. кас- сеты и участком att интегрона, включая гены кассеты в интегрон в такой ориентации, чтобы они могли экспрессироваться с промотора Р интегро- на. Интеграция кассет в интегрон является обратимым процессом. Инте- гроны могут располагаться как на хромосоме, так и на плазмидах. Поэтому возможно перемещение кассет с одного интегрона на другой как в преде- лах одной бактериальной клетки, так и по популяции бактерий. Один ин- тегрон может захватывать несколько кассет антибиотикорезистентности. Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций. Рис. 5.2. Строение интегрона: attI — сайт рекомбинации интегрона; intI — ген, кодирующий интегразу; P — промотор; attC — сайты рекомбинации кассет анти- биотикорезистентности attC1 attI attI attC2 attC1 attI attC1 attC2 5‘консервативный фрагмент кассета 1 кассета 2 Структура интегрона intI P Глава 5. Генетика микробов 187 5.1.5. Острова патогенности В геноме патогенных бактерий (см. гл. 7) имеются участки ДНК протяженностью не менее 10 000 пар нуклеотидов, которые отличают- ся от основного генома составом G–C-пар нуклеотидных оснований. Эти участки ответственны за синтез факторов патогенности, которые обес печивают развитие патологического процесса в организме хозяина, поэтому были названы островами патогенности . Острова патогенности обычно по флангам имеют прямые повторы последовательностей ДНК или IS-элементы. Некоторые имеют в своем составе участки, характер- ные для сайтов интеграции, расположенных вблизи генов тРНК. Боль- шинство островов патогенности локализовано на хромосоме бактерий (Salmonella),но также они могут находиться в составе плазмид (Shigella) и фаговых ДНК (V. cholerae O1, O139). 5.1.6. Системы регуляции экспрессии генома. Защита от чужеродной дезоксирибонуклеиновой кислоты Установлено, что в процессе регуляции генной активности при- нимают участие малые, длиной 50–200 нуклеотидов sРНК (от англ. small — маленький). Они реализуют свою регуляторную функцию или непосредственно связываются с комплементарной последова- тельностью иРНК, вызывая изменение ее вторичной структуры, спо- собствуя тем самым процессу трансляции или связываясь с белком, обозначенным как Cas9, обладающим эндонуклеазной активностью. В последнем случае комплекс sРНК–Cas9 соединяется с комплемен- тарным участком проникшей в клетку ДНК, уничтожая ее. Этим ме- ханизмом осуществляется так называемый адаптивный иммунитет бактериальной клетки, к повторному проникновению в нее умерен- ного фага, плазмиды или транспозонов. Реализация этого происхо- дит с участием РНК–Cas9 через CRISPR (clastered regularly interspaced short palindromic repeated), короткие палиндромные повторы, которые разделены вставками, представляющие чужеродный генетический материал (ДНК умеренных фагов и плазмид). При повторном попа- дании в бактериальную клетку ДНК фага или плазмиды sРНК транс- крибируются с CRISPR, соединяются с Cas9 и этим комплексом сое- диняются с комплементарным участком внедренной ДНК, разрушая ее (рис. 5.3). 188 Часть I. Общая микробиология 5.2. МУТАЦИИ У БАКТЕРИЙ Мутации — это изменения в последовательности отдельных нуклео- тидов ДНК, которые фенотипически ведут к таким проявлениям, как изменения морфологии бактериальной клетки, возникновение по- требностей в факторах роста, например в аминокислотах, витаминах, то есть ауксотрофности, к устойчивости к антибиотикам, изменению чувствительности к температуре, снижению вирулентности (аттенюа- ция) и т.д. Мутация, приводящая к потере функции, называется прямой мута- цией. У мутантов может произойти восстановление исходных свойств, то есть реверсия (от англ. reverse — обратный). Если происходит восста- новление исходного генотипа, то мутация, восстанавливающая генотип и фенотип, называется обратной или прямой реверсией. Если мутация восстанавливает фенотип, не восстанавливая генотип, то такая мутация имеет название «супрессорная» . Супрессорные мутации могут возни- Рис. 5.3. Иммунитет к повторному проникновению гомологичной плазмиды и умеренного бактериофага в бактериальную клетку с участием CRISPR (схема) ДНК фага проникает в клетку Палиндромы Белок Cas9 (эндонуклеаза, молекулярные ножницы) Образуется sRNA CRISPR sPHK направляет молекулярные ножницы (Cas9) к цели. Разрез ДНК фага и ДНК плазмиды Встраивание ДНК фага и ДНК плазмиды (формирование новых спейсеров) Глава 5. Генетика микробов 189 кать как в пределах того самого гена, в котором произошла первичная мутация, так и в других генах, или могут быть связаны с мутациями в тРНК. По протяженности изменений повреждения ДНК различают мута- ции точечные, когда повреждения ограничиваются одной парой нук- леотидов, и протяженные, или аберрации. В последнем случае могут наблюдаться выпадения нескольких пар нуклеотидов, которые назы- ваются «делеция» ,добавление нуклеотидных пар, то есть дупликации , перемещения фрагментов хромосомы, транслокации и перестановки нуклеотидных пар — инверсии . Мутации могут быть: ● спонтанными, то есть возникающими самопроизвольно, без воз- действия извне; ● индуцированными. Точечные спонтанные мутации возникают в результате ошибок при репликации ДНК, что связано с таутомерным перемещением электро- нов в азотистых основаниях. Тимин (Т), например, обычно находится в кетоформе, в которой он способен образовывать водородные связи с аденином (А). Однако если тимин во время спаривания оснований при репликации ДНК перехо- дит в енольную форму, то он спаривается с гуанином. В результате в новой молекуле ДНК на месте, где раньше стояла пара А–Т, появляется пара Г–Ц. Спонтанные хромосомные аберрации возникают вследствие пере- мещения подвижных генетических элементов. Индуцированные мутации появляются под влиянием внешних факто- ров, которые называются «мутагены» . Мутагены бывают физическими (ультрафиолетовые лучи, γ-радиация), химическими (аналоги пури- новых и пиримидиновых оснований, азотистая кислота и ее аналоги и другие соединения) и биологическими — транспозоны. Аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, например 2-ами- нопурин, 5-бромурацил, включаются в нуклеотиды, а следовательно, и в ДНК, но при этом они значительно чаще в силу таутомерных превра- щений спариваются с «неправильными» партнерами, в результате вы- зывая замену пурина другим пурином (А–Г) или пиримидина другим пиримидином (Т–Ц). Замена пурина другим пурином, а пиримидина другим пиримидином называется «транзиция» . Азотистая кислота и ее аналоги вызывают дезаминирование азоти- стых оснований, результатом чего являются ошибки при спаривании и, 190 Часть I. Общая микробиология как следствие, возникновение транзиции. Аденин в результате дезами- нирования превращается в гипоксантин, который спаривается с цито- зином, что приводит к возникновению транзиции АТ–ГЦ. Гуанин же при дезаминировании превращается в ксантин, который по-прежнему спаривается с цитозином; таким образом, дезаминирование гуанина не сопровождается мутацией. Акридин и профлавин внедряются между соседними основаниями цепи ДНК, вдвое увеличивая расстояние между ними. Это простран- ственное изменение при репликации может привести как к утрате нук- леотида, так и к включению дополнительной нуклеотидной пары, что приводит к сдвигу рамки считывания тРНК. Начиная с того места, где произошло выпадение или включение нуклеотида, информация считы- вается неправильно. Ультрафиолетовое облучение затрагивает преимущественно пири- мидиновые основания, при этом два соседних остатка тимина ДНК мо- гут оказаться ковалентно связанными. На бактериях, подвергнутых ультрафиолетовому облучению, было показано, что повреждения, вызванные облучением в бактериальных ДНК, могут частично исправляться благодаря наличию репарационных систем. У различных бактерий имеется несколько типов репарацион- ных систем. Один тип репарации протекает на свету, он связан с дея- тельностью фотореактивирующегося фермента, который расщепляет тиминовый димер. При темновой репарации дефектные участки цепи ДНК удаляются и образовавшаяся брешь достраивается с помощью ДНК-полимеразы на матрице сохранившейся цепи и соединяется с це- пью лигазой. |