Учебник в 2 томах Под редакцией
 Скачать 0.74 Mb.
|
|
Мультилокусное секвенирование-типирование. Метод генетического типирования, основанный на определении последовательности нуклео- тидов в небольших фрагментах (500 н.п.) ряда генов, с последующим сравнением соответствующих последовательностей у разных микро- организмов. Чаще анализу подвергаются «гены домашнего хозяйства», которые необходимы для протекания реакций основного метаболизма бактериальной клетки и, следовательно, присутствуют у всех бактерий. В силу своей исключительной важности они характеризуются низкой скоростью накопления мутаций. Сравнение нуклеотидных последовательностей таких генов позво- ляет легко установить степень филогенетического родства между попу- ляциями и систематизировать их. 200 Часть I. Общая микробиология 5.6.2. Методы, используемые для обнаружения микроба без выделения его в чистую культуру Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сход- ства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения, а также для об- наружения микроба в исследуемом материале без его выделения в чи- стую культуру. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатуриро- вать, то есть расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радиоактивными нуклидами, ферментом, флюорохромным красителем, с которой сравнивают исследуемую ДНК. Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на спе- циальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследу- емой ДНК они образуют между собой двойную спираль, факт которой фиксируют методами в зависимости от типа метки зонда: подсчетом радиоактивности, иммуноферментным анализом или денситометрией. Определение наличия микроба в исследуемом материале с помощью микрочипа Микрочип представляет стеклянную пластинку, с которой связано от 100 до 1000 молекулярных ДНК-зондов, представляющих последо- вательность нуклеотидов, специфичных для данной таксономической единицы, локализованных в определенных участках (рис. 5.7). Из исследуемого образца выделяют общую ДНК, которую можно амплифицировать по стабильной последовательности 16S РНК-гену. Выделенную ДНК метят флуорохромом или ферментом и обрабатыва- ют ею микрочип, создавая условия для гибридизации. Отмывают не- связавшуюся ДНК, определяют локализацию молекулярных гибридов постановкой иммуноферментного анализа или денситометрией. Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в иссле- дуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру. Глава 5. Генетика микробов 201 Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного мик- роба гена. Обнаружение гена осуществляют его накоплением. Для этого необходимо иметь праймеры (затравки) комплементарного 3’-концам ДНК исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняют следующим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК на- гревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участ- ками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функцио- нирования ДНК-полимеразы. В этих условиях в случае комплементар- ности ДНК гена и праймера происходит присоединение нуклеотидов к 3’-концам праймеров, в результате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена увеличивается каждый раз вдвое (рис. 5.8). Проводят реакцию в специ- альных приборах-амплификаторах. Результат оценивают последующей денситометрией амплифицированной ДНК или ее электрофорезом в полиакриламидном геле. Полимеразную цепную реакцию применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций. Рис. 5.7 Принцип обнаружения специфической последовательности дезоксири- бонуклеиновой кислоты с помощью микрочипа Много молекул мишений Сильный сигнал l Слабый сигнал Мало мишени Нет сигнала Нет мишени Стеклянная пластинка ДНК зонд Меченая искомая ДНК Прикрепленный флюорохром Фрагменты тотальной ДНК (молекулы мишени) 202 Часть I. Общая микробиология Для обнаружения РНК-содержащих вирусов используют полиме- разную цепную реакцию с оборотной транскрипцией (ОТ-ПЦР), вклю- чающую предварительный этап синтеза комплементарной ДНК на ма- трице искомой РНК при помощи ОТ. Рис. 5.8. Полимеразная цепная реакция (схема) 5' 5' 5' 5' 5' 3' 3' Денатурация 92–95 °С Участок связывания праймера α Участок связывания праймера δ Связывание праймеров при отжиге 37–60 °С α δ праймеры Добавление термостабильной ДНК-полимеразы, нуклеотидов Амплификация Глава 5. Генетика микробов 203 Полимеразная цепная реакция в реальном времени представляет уско- ренный метод полимеразной цепной реакции, при котором амплифика- ция и определение продукта амплификации проводится одновременно. Полимер азная цепная реакция в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20–60 мин и теоретически способна обнаружить даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе. Для этой цели в амплификационную пробирку вводят дополнительный молекулярный зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмен- та. К концам этого зонда присоединены флуорофор и тушитель. Когда флуорофор и тушитель связаны с разными концами олигонуклеотид- ного зонда, тушитель подавляет свечение флуорофора. Во время про- цесса амплификации, когда этот зонд связывается с амплифициро- ванной цепью за счет 5’-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, флюоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флюоресцентный сиг нал, усиливающий- ся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата (рис. 5.9). Реакция проводится в автоматическом режиме. Праймер 1 Праймер 2 ДНК или РНК инфекционного агента Флуоресценция Флуоресцентный зонд Рис. 5.9. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (схема) Опосредованная транскрипцией амплификациярРНК используется для диагностики смешанных инфекций. Этот метод основан на обнару- жении с помощью молекулярной гибридизации амплифицированных рРНК, специфичных для определенного вида бактерий. Исследование проводят в три этапа: 1) амплификация пула рРНК на матрице, выделенной из исследуемо- го материала ДНК с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы; 204 Часть I. Общая микробиология 2) гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными ви- доспецифическими рРНК-олигонуклеотидами, меченными флюо- рохромом или ферментами; 3) определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммуноферментного анализа. Реакцию проводят в автоматическом режиме в установках, в кото- рых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различным видам бактерий, достигается разделением амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносят для гибридизации комплементарные видоспецифические рРНК-меченые олигонукле- отиды. 5.7. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Генная инженерия — технология получения рекомбинантных ДНК, содержащих ген, экспрессия которого приводит к синтезу по- лезного для нужд человека вещества. Генная инженерия является инструментом биотехнологии (от греч. bios — жизнь, tecen — искус- ство, logos — наука) — области знаний, которая на основе изучения био- технологических процессов, протекающих в живой клетке, использует эти процессы для получения полезных для человека веществ в промыш- ленных условиях. С помощью биотехнологических процессов получают профилакти- ческие, лечебные и диагностические препараты, в том числе вакцины, антибиотики, лечебные сыворотки и иммуноглобулины, диагностиче- ские системы и др. Генная инженерия является инструментом новейшей биотехноло- гии. Она позволяет непосредственно вмешиваться в генетический ап- парат и служит для получения генетически модифицированного орга- низма, обладающего желанными качествами. Основу генной инженерии составляют результаты открытий, сде- ланных во второй половине ХХ в. ● Открытие ферментов рестриктаз (Смит Х., Натанс Д., Арбер В., 1970) ● Создание синтезатора гена, специального аппарата, снабженного ЭВМ, в память которой заложены программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. ● Разработка метода секвенирования , определения последовательно- сти нуклеотидных оснований в гене (У. Гильберт, Ф. Сэнгер). Глава 5. Генетика микробов 205 Методика получения рекомбинантных ДНК основана на исполь- зовании рестриктаз (см. раздел 5.6.1.1) 2-го типа, которые разрушают двойную спираль ДНК в районе палиндромных последовательностей. Палиндромные последовательности обладают центральной симметрией и считываются одинаково в обе стороны от симметрии (рис. 5.10). Точка разрыва может совпадать с осью симметрии, а может быть сдви- нута относительно ее, как в случае действия рестриктазы EcoR1. В резуль- тате действия такой рестриктазы образуются фрагменты, с комплемен- тарными одноцепочечными концами, которые могут соединяться по- средством водородных связей между комплементарными основаниями, после чего посредством фермента ДНК-лигазы происходит сшивка фраг- ментов с образованием ковалентных связей между соседними нуклеоти- дами. Причем сшиваться могут различные фрагменты ДНК. Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструировании рекомби- нантной молекулы ДНК, будет представлять самостоятельный репликон, например плазмиду, то таким образом можно встроить требуемый ген в плазмиду. При этом репликон (плазмида) становится носителем, или век- тором,для гена, если эту рекомбинантную плазмиду передать в бактери- альную или дрожжевую клетку, в которой эта рекомбинантная плазмида будет реплицироваться, размножая при этом встроенный в нее ген. Пере- дача плазмиды в бактериальную или дрожжевую клетку осуществляется методом электропарации. Схема получения рекомбинантной плазмиды показана на рис. 5.11. Для клонирования чужеродных фрагментов ДНК в составе репликона Ф. Больваром и Р. Родригесом была специально скон- струирована искусственная плазмида pBR 322. Для отбора клонов бактерий, несущих гибридную плазмиду, прово- дят идентификацию методом гибридизации зондом, несущим требуе- 5 ГААТЦ Рестриктаза Рестриктаза ГААТЦ ЦТТААГ ЦТТААГ 3 5 3 Рис. 5.10. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (схема) 206 Часть I. Общая микробиология мый ген, или вводят в плазмиду генный маркер, например ген устой- чивости к какому-то антибиотику. В этом случае клон бактериальных клеток, несущих рекомбинантную плазмиду, можно выделить на пита- тельной среде, с добавлением антибиотика. Определив методом секвенирования нуклеотидную последователь- ность генов, детерминирующих синтез требуемых для человека веществ, в настоящее время на основе этой последовательности нуклеотидов синтезируют искусственный ген, к концам которого присоединяют с помощью ферментов лигаз линкеры — синтетические фрагменты ДНК, несущие сайты рестрикции. Такая структура затем может быть встрое- на в плазмиду-вектор, которая будет передана в клетку для экспрессии продукта желанного гена. Методы рекомбинантной ДНК открывают широкие перспективы в развитии медицины, ветеринарии и других отраслях народного хозяйства. В настоящее время получены рекомбинантные штаммы бактерий, про- дуцирующие инсулин, гормон роста, интерферон (ИФН) (схема их полу- Рис. 5.11. Получение гибридной плазмиды (схема) ГААТТЦ ГААТТЦ ЦТТААГ 5' 3' ЦТТААГ ГААТТЦ Р ААТТЦ Р ААТТЦ ГААТТЦ Р Г Г Г Р Г Г Ц ТТАА Г ЦТТАА Р Г ЦТТААГ ЦТТАА Р ЦТТАА Р ГЕН Р Фосфатаза Лигац ия ГЕН ГЕН ГЕН ААТТ Ц Рестрикция ААТТЦ Г Г Г Ц ТТАА Г ЦТТАА ГЕН ААТТ Ц ЦТТАА Р Г Г Р ААТТЦ Г Г ААТТЦ ЦТТАА ГААТТЦ ЦТТААГ Глава 5. Генетика микробов 207 чения на рис. 5.12). Методом рекомбинантной ДНК получены рекомби- нантная вакцина против гепатита В (см. гл. 16) и рекомбинантная вакци- на Gardasil для предупреждения развития рака шейки матки (см. гл. 16). Задания для самоподготовки (самоконтроля) А. Назовите процесс, в котором принимает участие бактериофаг: 1. Конъюгация. 2. Трансформация. 3. Трансдукция. 4. Репарация. Б. Назовите свойства плазмиды, необходимые для осуществления передачи хромосомы путем конъюгации: 1. Интегративность. 2. Гипермутабельность. 3. Трансмиссивность. 4. Суперспирализованность. Рис. 5.12. Схема получения рекомбинантных инсулина и интерферона Эукариотическая клетка Хромосомы Выделение требуемого гена Требуемый ген Бактерия Плазмиды Получение рекомбинантной плазмиды Трансформация рекомбинантной плазмиды в бактериальную или дрожжевую клетку Выработка требуемого вещества Бактерия или дрожжевая клетка 208 Часть I. Общая микробиология B. Назовите структуры, которые участвуют в распространении генов в популяции бактерий: 1. Плазмиды. 2. Интегрон. 3. Транспозон. 4. Репликон. Г. Назовите ферменты, которые применяются в генной инженерии: 1. Рестриктазы. 2. Лигазы. 3. Протеазы. 4. ДНК-полимераза. Д. При санитарно-бактериологическом контроле продукции молоч- ного завода из образцов сметаны был высеян возбудитель дизентерии Shigella fl exneri. Сразу же была проведена проверка сотрудников этого завода на бактерионосительство, во время которой от сотрудника К. был выделен возбудитель того же вида и серовара. Назовите метод, ко- торый можно использовать для внутривидовой идентификации выде- ленных культур, позволивший подтвердить или опровергнуть тот факт, что сотрудник К. был источником заражения продукции. |