Учебник в 2 томах Под редакцией
 Скачать 0.74 Mb.
|
|
5.3. РЕКОМБИНАЦИЯ У БАКТЕРИЙ Генетическая рекомбинация — это взаимодействие между двумя ДНК, обладающими различными генотипами, которое приводит к об- разованию рекомбинантной ДНК, сочетающей гены обоих родителей. Особенности рекомбинации у бактерий определяет отсутствие по- лового размножения и мейоза, в процессе которых у высших организ- мов происходят рекомбинация, гаплоидный набор генов. В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые вос- принимают его. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, что приводит к формированию неполной Глава 5. Генетика микробов 191 зиготы — мерозиготы. В результате рекомбинации в мерозиготе образу- ется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основ- ном генотипом реципиента, с включенным в него фрагментом хромо- сомы донора. Реципрокные рекомбинанты не образуются. По молекулярному механизму генетическая рекомбинация у бакте- рий делится: ● на гомологичную; ● сайт-специфическую; ● незаконную. 5.3.1. Гомологичная рекомбинация При гомологичной рекомбинации в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Процесс гомологичной рекомбинации находится под контролем генов, объединенных в REС-систему, состоящую из ге- нов recA, B, C, D. Продукты этих генов производят расплетание нитей ДНК и их переориентацию с образованием полухиазмы, структуры Хо- лидея, а также разрезают структуру Холидея для завершения процесса рекомбинации. 5.3.2. Сайт-специфическая рекомбинация Этот тип рекомбинации не зависит от функционирования генов recA, B, С, D,не требует протяжных участков гомологии ДНК, но для его протекания необходимы строго определенные последовательно- сти ДНК и специальный ферментативный аппарат, специфичные для каждого конкретного случая. Примером этого типа рекомбинации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое про- исходит между идентичными IS-элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага лямбда в хромосому Е. coli. Сайт-специфическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участву- ет также в переключении активности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгутикового Н-антигена. 5.3.3. Незаконная, или репликативная, рекомбинация Незаконная, или репликативная, рекомбинация не зависит от функ- ционирования генов recA, B, С, D. Примером ее является транспозиция 192 Часть I. Общая микробиология подвижных генетических элементов по репликону или между репли- конами, при этом, как уже было отмечено в разделе 5.1.3, транспози- ция подвижного генетического элемента сопровождается репликацией ДНК. Рекомбинация является конечным этапом передачи генетического материала между бактериями, которая осуществляется тремя механиз- мами: конъюгацией (при контакте бактерий, одна из которых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (с помощью бактериофага), трансформацией (с помощью высокополимеризованной ДНК). 5.4. ПЕРЕДАЧА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ У БАКТЕРИЙ 5.4.1. Конъюгация Передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реци- пиент путем непосредственного контакта клеток называется «конъюга- ция» , впервые она была обнаружена Дж. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г. Необходимым условием для конъюгации является наличие в клетке- доноре трансмиссивной плазмиды. Трансмиссивные плазмиды кодиру- ют секреторную систему IV типа (см. гл. 3), аппарат которой формирует пилю, образующую конъюгационную трубочку между клеткой-доно- ром и клеткой-реципиентом, по ней плазмидная ДНК передается в но- вую клетку. Механизм передачи плазмидной ДНК из клетки в клетку заключается в том, что специальный белок, кодируемый tra-опероном, узнает определенную последовательность в ДНК плазмиды (называе- мую от англ. origin — начало), вносит в эту последовательность одно- цепочечный разрыв и ковалентно связывается с 5’-концом. Затем цепь ДНК, с которой связан белок, переносится в клетку-реципиент, а нера- зорванная комплементарная цепь остается в клетке-доноре. Клеточный аппарат синтеза ДНК достраивает одиночные цепи и в доноре, и в ре- ципиенте до двухцепочечной структуры. Белок, связанный с 5’-концом перенесенной цепи, способствует замыканию плазмиды в реципиент- ной клетке в кольцо. Этот процесс представлен на рис. 5.4, на примере переноса в реципиентную клетку плазмиды F (от англ. fertility — плодо- витость), которая является как трансмиссивной, так и интегративной плазмидой. Клетки-доноры, обладающие F-фактором, обозначаются Глава 5. Генетика микробов 193 как F + -клетки, а клетки-реципиенты, не имеющие F-фактора, обозна- чаются как F – -клетки. Если F-фактор находится в клетке-доноре в ав- тономном состоянии, то в результате скрещивания F + ×F – клетка-реци- пиент приобретает донорские свойства. Если F-фактор или другая трансмиссивная плазмида встраиваются в хромосому клетки-донора, то плазмида и хромосома начинают функ- ционировать в виде единого трансмиссивного репликона, что делает возможным перенос бактериальных генов в бесплазмидную клетку-ре- ципиент, то есть происходит процесс конъюгации. Штаммы, в которых плазмида находится в интегрированном состоянии, переносят свои хромосомные гены бесплазмидным клеткам с высокой частотой и по- этому называются Hfr (от англ. high frequency of recombination — высокая частота рекомбинации) (см. рис. 5.4, б). Процесс переноса хромосомных генов в случае скрещивания Hfr×F – всегда начинается с расщепления ДНК в одной и той же точке — в ме- сте интеграции F-фактора или другой трансмиссивной плазмиды. Одна нить донорской ДНК передается через конъюгационный мостик в ре- ципиентную клетку. Процесс сопровождается достраиванием компле- ментарной нити до образования двунитевой структуры. Перенос хро- мосомных генов при конъюгации всегда имеет одинаковую направлен- ность, противоположную встроенной плазмиде. Сама трансмиссивная плазмида передается последней. Переданная в реципиентную клетку и достроенная до двунитевой структуры нить ДНК донора рекомбинирует F + F – HfR HfR Конъюгант F + F – 3' 5' F + F + б а Рис. 5.4. Схема конъюгации у бактерий: а — передача F-плазмиды из F + - в F – - клетку; б — передача бактериальной хромосомы Hfr х F 194 Часть I. Общая микробиология с гомологичным участком реципиентной ДНК с образованием стабиль- ной генетической структуры. Из-за хрупкости конъюгационного мо- стика половой фактор редко передается в клетку-реципиент, поэтому образовавшийся рекомбинант донорскими функциями, как правило, не обладает. Вследствие направленности передачи генов конъюгация использует- ся для картирования генома бактерий и построения генетической карты. 5.4.2. Трансдукция Трансдукцией называют передачу бактериальной ДНК посред- ством бактериофага. Этот процесс был открыт в 1951 г. Н. Циндером и Дж. Ледербергом. В процессе репликации фага внутри бактерий (см. раздел 3.3) фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую ча- стицу и переносится в реципиентную бактерию во время фаговой ин- фекции. Существует два типа трансдукции. 1. Общая трансдукция — перенос бактериофагом сегмента любой ча- сти бактериальной хромосомы, происходит вследствие того, что в процессе фаговой инфекции бактериальная ДНК фрагментирует- ся, и фрагмент бактериальной ДНК того же размера, что и фаговая ДНК, проникает в фаговую головку, формируя дефектную фаго- вую частицу. Этот процесс происходит с частотой приблизительно 1 на 1000 фаговых частиц (рис. 5.5, а). При инфицировании клет- ки-реципиента дефектной фаговой частицей ДНК клетки-донора «впрыскивается» в нее и рекомбинирует гомологичной рекомби- нацией с гомологичным участком хромосомы-реципиента с об- разованием стабильного рекомбинанта. Этим типом трансдукции обладают β-фаги. 2. Специфическая трансдукция наблюдается в том случае, когда фаго- вая ДНК интегрирует в бактериальную хромосому с образованием профага. В процессе исключения ДНК-фага из бактериальной хро- мосомы в результате случайного процесса захватывается прилега- ющий к месту включения фаговой ДНК фрагмент бактериальной хромосомы, становясь дефектным фагом (рис. 5.5, б). Поскольку большинство умеренных бактериофагов интегрирует в бактери- альную хромосому в специфических участках, для таких бакте- риофагов характерен перенос в клетку-реципиент определенного участка бактериальной ДНК клетки-донора. ДНК дефектного фага Глава 5. Генетика микробов 195 рекомбинирует с ДНК клетки-реципиента сайт-специфической рекомбинацией. Рекомбинант становится меродиплоидом по при- внесенному гену. В частности, бактериофаг передает специфиче- ской трансдукцией gal-ген у Е. coli. 5.4.3. Трансформация Феномен трансформации впервые был описан в 1928 г. Ф. Гриффит- сом, обнаружившим превращение бескапсульного R-штамма пнев- мококков (Streptococcus pneumoniae)в штамм, образующий капсулу S-формы. Гриффитс ввел мышам одновременно небольшое количе- ство авирулентных R-клеток и убитых нагреванием S-клеток. R-клетки были получены от штамма, капсульное вещество которого принадле- жало к типу S II, а убитые нагреванием S-штаммы — к типу S III. Из крови погибших мышей были выделены вирулентные пневмококки с капсулой S III. В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти установили природу трансформирующего фактора, показав, что ДНК, экстрагированная из инкапсулированных пневмококков, может трансформировать некапсу- лированные пневмококки в инкапсулированную форму. Таким обра- зом, было доказано, что именно ДНК является носителем генетической информации. Процесс трансформации может самопроизвольно происхо- дить в природе у некоторых видов бактерий B. subtilis, H. infl uenzae, Рис. 5.5. Схема трансдукции: а — неспецифическая (общая); б — специфическая Бактерия- донор Бактерия- реципиент б а Состояние лизогении Формирование дефектного фага Транс- дуктант 196 Часть I. Общая микробиология S. pneumoniae,когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захваты- вается реципиентными клетками. Процесс трансформации зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния донорской трансфор- мирующей ДНК. Компетентность — это способность бактериальной клетки погло- щать ДНК. Она зависит от присутствия особых белков в клеточной мембране, обладающих специфическим аффинитетом к ДНК. Состо- яние компетентности у грамположительных бактерий связано с опре- деленными фазами кривой роста. Состояние компетенции у грамотри- цательных бактерий приходится создавать искусственным путем, под- вергая бактерии температурному или электрошоку. Трансформирующей активностью обладает только двунитевая высо- коспирализованная молекула ДНК. Это связано с тем, что в клетку-ре- ципиент проникает только одна нить ДНК, тогда как другая — на кле- точной мембране — подвергается деградации с высвобождением энер- гии, которая необходима для проникновения в клетку сохранившейся нити. Высокая молекулярная масса трансформирующей ДНК увеличи- вает шанс рекомбинации, так как внутри клетки трансформирующая нить ДНК подвергается воздействию эндонуклеаз. Интеграция с хро- мосомой требует наличия гомологичных с ней участков у трансформи- рующей ДНК. Рекомбинация происходит на одной нити, в результате чего образуется гетеродуплексная молекула, одна нить которой имеет генотип реципиента, а другая — рекомбинантный генотип. Рекомби- нантные трансформанты формируются только после цикла репликации (рис. 5.6). В настоящее время этот метод является основным методом генной инженерии, используемым при конструировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом. ДНК Бактерия- донор Бактерия- реципиент Трансформант Рис. 5.6. Схема трансформации Глава 5. Генетика микробов 197 5.5. ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИКИ ВИРУСОВ Особенность строения вирусного генома заключается в том, что на- следственная информация может быть записана как на ДНК, так и на РНК в зависимости от типа вируса. Мутации у вирусов могут возникать спонтанно в процессе реплика- ции нуклеиновой кислоты вируса, а также под влиянием тех же внеш- них факторов и мутагенов, что и у бактерий. Фенотипически мутации вирусного генома проявляются изменени- ями антигенной структуры, неспособностью вызывать продуктивную инфекцию в чувствительной клетке, чувствительностью продуктивно- го цикла к температуре, а также изменением формы и размера бляшек, которые образуют вирусы в культуре клеток под агаровым покрытием (см. раздел 3.2). Свойства вирусов могут изменяться при одновременном зараже- нии несколькими вирусами чувствительной клетки, причем изме- нения свойств при таких условиях могут происходить в результате как обмена между материалами нуклеиновых кислот, принадлежа- щих разным вирусам (генетическая рекомбинация и генетическая реактивация), так и процессов, не сопровождаемых обменом гене- тического материала (комплементация и фенотипическое смеши- вание). Генетическая рекомбинация встречается чаще у ДНК-содержащих вирусов. Среди РНК-содержащих вирусов она наблюдается у тех из них, которые обладают фрагментированным геномом, например у ви- руса гриппа. При рекомбинации происходит обмен между гомологич- ными участками генома. Генетическая реактивация наблюдается между геномами родствен- ных вирусов, имеющих мутации в разных генах. В результате перерас- пределения генетического материала формируется полноценный до- черний геном. Комплементация встречается в том случае, когда один из двух виру- сов, инфицирующих клетку, в результате мутации синтезирует нефунк- циональный белок. Немутантный вирус, синтезируя полноценный бе- лок, восполняет его отсутствие у мутантного вируса. Фенотипическое смешивание наблюдается в том случае, если при смешанном заражении чувствительной клетки двумя вирусами часть потомства приобретает фенотипические признаки, присущие двум ви- русам, при сохранении неизменности генотипа. 198 Часть I. Общая микробиология 5.6. ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Генетические методы применяются в практических целях как для обнаружения микроба в исследуемом материале без выделения чистой культуры, так и для определения таксономического положения микро- ба и проведения внутривидовой идентификации. 5.6.1. Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий Рестрикционный анализ основан на применении ферментов, но- сящих название «рестриктаз». Рестриктазы представляют собой эндо- нуклеазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов молекулярной генетики имеют рестриктазы, которые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии, так называемыми палиндромами. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относитель- но нее. В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участ- ки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходить разрыв двойной спирали ДНК. В геноме конкретной таксономической единицы находится строго определенное (генетически задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы. Если выделенную из кон- кретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фраг- ментов ДНК фиксированного размера. Размер каждого типа фраг- ментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более круп- ные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашивают бро- мистым этидием и фотографируют в ультрафиолетовым излучении. Таким способом можно получить рестрикционную карту определен- ного вида микробов. Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различ- ных штаммов, можно определить их генетическое родство, выявить Глава 5. Генетика микробов 199 принадлежность к определенному виду или роду, а также обнару- жить участки, подвергнутые мутациям. Этот метод используется также как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гиб- ридизации. Определение плазмидного профиля бактерий. Плазмидный профиль позволяет произвести внутривидовую идентификацию бактерий. Для этого из бактериальной клетки выделяют плазмидную ДНК, которую разделяют электрофорезом в агарозном геле для определения количе- ства и размеров плазмид. Риботипирование. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, характеризуется наличием как консер- вативных участков, которые подверглись малым изменениям в про- цессе эволюции и имеют сходное строение у различных бактерий, так и вариабельных последовательностей, которые родо- и видоспецифичны и являются маркерами при генетической идентификации. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких копиях. Фраг- менты ДНК, полученные после обработки ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены ме- тодом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующе- го вида бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов, как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам, варьируют у различных видов бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования,который позволяет произ- водить мониторинг выделенных штаммов и определение их вида. В на- стоящее время риботипирование проводится в автоматическом режиме в специальных приборах. |