3 Биологическая фиксация азота бобовыми культурами
при симбиозе.
Семена многих видов бобовых богаты белком. Они являются ценным сырьем для производства кормов и пищевых продуктов. Из растений умеренного климата можно назвать горох и фасоль. В тропических и субтропических зонах возделываются самые разнообразные культуры, вкл ючая сою, чечевицу, арахис. Многие бобовые – ценные пастбищные культуры, например, различные виды клевера. Они могут служить зеленым удобрением (люцерна), дают нам лесоматериалы, клеящие вещества, волокна, лекарства и пряности.
Роль бобовых определяется еще и тем, что они способны
230 фиксировать азот атмосферы в корневых клубеньках, которые формируются при участии почвенных бактерий рода
Rhizobium.
Образующиеся в них азотистые вещества необходимы для роста растений.
Об участии клубеньковых бактерий в фиксации атмосферного азота стало известно сравнительно недавно (примерно 100 лет назад).
Культура, из которой можно получать богатые белком пищевые продукты и которая не требует (или требует очень мало) азотных удобрений, несомненно выгодна, и бобовые стали важной сельскохозяйственной культурой в Европе, в Северной Америке и на других континентах. Установлено, что среди бобовых, играющих важную роль в сельском хозяйстве, примерно 98% видов могут образовывать клубеньки. У диких видов они чаще всего формируются при участии особых разновидностей бактерий-ризобиумов, существующих в природном местообитании.
Если какой-то вид бобовых долго растет на одном месте, это приводит к постепенному накоплению в почве азотфиксирующих бактерий. Урожай бобовых в значительной степени зависит от того, образовалась ли в данном месте эффективная ассоциация из растения и соответствующей разновидности
Rhizobium. Нужный штамм не всегда присутствует в том месте, где предполагается выращивать данную культуру, и в таком случае его приходится вносить в почву.
Как только стала ясна роль симбиоза бактерий рода
Rhizobium и бобовых, были разработаны способы внесения этих бактерий в почву для улучшения условий культивирования, их стали смешивать с семенами. Затраты на внедрение этого способа инокуляции невелики, транспортные расходы незначительны, а сами методы достаточно несложны, чтобы их можно было внедрить в сельское хозяйство развивающихся стран, где высока стоимость удобрений.
Выращивание бобовых с применением метода инокуляции семян нередко благоприятно сказывается на состоянии окружающей среды: оно помогает бороться с наступающей пустыней,
облегчает борьбу с эрозией почв, уменьшает перенос почвы ветром и позволяет с большим успехом восстанавливать истощенные земли. Большинство образующих клубеньки бобовых способны полностью удовлетворить свои потребности в азоте. Однако это бывает только тогда, когда и прочие условия благоприятствуют росту растений, т.е. растения получают достаточно воды и других питательных веществ.
Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы, взятой с полей, где выбранная для выращивания культура бобовых растет хорошо. Этот способ широко применялся еще в
231 конце ХIХ века. Недостаток его заключался в том, что при этом приходится перемещать много почвы, так как
Rhizobium составляют лишь малую часть микрофлоры и ничтожную часть самой почвы. В
Америке обычно вносили 100-1000 кг почвы на 1 га. Брали эту почву с расположенного неподалеку поля, где был получен хороший урожай нужной бобовой культуры. Еще один недостаток этого метода – возможность распространения с почвой болезней растений.
Гораздо меньше почвы необходимо вносить при помощи сеялок, когда бактерии попадают прямо к семенам, где они нужнее всего. На основе этого простого способа был разработан метод прямой инокуляции семян. Сначала применяли измельченную почву (всего примерно 0,5 кг почвы на 1 кг семян), а затем стали использовать методы, основанные на введении чистых культур бактерий.
Первая разновидность коммерческой культуры для инокуляции была запатентована в 1896 г. Она поступала на рынок под названием
«Nitragin». Для разных бобовых выпускалось 17 ее вариантов. Уже в
20-х гг. ХХ века на рынок поступало много других разновидностей инокулятов. Некоторые из них представляли собой чистые культуры бактерий, смешанные с почвой, песком, торфом, навозом или измельченной породой, другие – культуры, выращенные на агаре или в жидкой среде.
Суть метода инокуляции семян заключается в том, что на семена наносят большое число клеток
Rhizobium, соответствующих определенному виду растения-хозяина, что увеличивает вероятность быстрого образования клубеньков у проростков при участии данных микроорганизмов. Для этого нужно достаточно много бактерий, которые должны сохранять жизнеспособность до тех пор, пока в почве они не проникнут в корневые волоски. Для прямой инокуляции семян пригодны культуры
Rhizobium, выращенные в пробирках или колбах на среде с агаром.
Rhizobium, выращенные на агаре или в жидкой среде, после высушивания на поверхности семян быстро погибают, да и сами культуры их нежизнестойки. Этих недостатков лишены инокуляты на торфяной основе,
которые были созданы в США, и сейчас применяются повсеместно.
При получении культуры нужного штамма
Rhizobium выращивают обычным способом в ферментере объемом несколько литров в жидкой среде. К моменту смешивания с торфом (носителем)
– плотность культуры должна быть достаточно высокой, 5·10 8
-10 9
клеток/мл. В случае медленно растущих штаммов, со средним временем удвоения числа клеток около 10 часов, обычно бывает сложно получить культуру с высокой плотностью, и нередко даже
232 размножение более быстро растущих штаммов подавляется видами- загрязни-телями. Для обеспечения быстрого роста культуры на жидкой среде полезно вносить сразу много бактерий.
При приготовлении носителя для
Rhizobium торф высушивают либо при обычной температуре, либо при осторожном нагревании до влажности 10%, затем измельчают при помощи мельницы и доводят до рН 6,5-7, добавляя СаСО
3
. Рост и выживание бактерий в торфе зависят от многих факторов. Поэтому на каждой партии торфа для получения инокулятов проводят пробные выращивания именно тех штаммов, которые предполагается использовать.
Твердый инокулят состоит из бактерий и носителя, роль которых заключается в поддержании жизнеспособности клеток, поскольку он частично защищает их от пересыхания. Кроме того, носитель способствует более равномерному распределению бактерий в массе семян и помогает им прикрепиться к поверхности семян. Хотя в случае бактериальных суспензий нередко получают хорошие результаты, считается, что применение торфа как носителя более эффективно: т.к. при использовании жидких культур или же суспензий клетки
Rhizobium после инокуляции и прикрепления их к поверхности семян оказываются практически беззащитными.
Поэтому при производстве коммерческих инокулятов вначале чаще всего использовали именно торф. Однако торф есть далеко не везде, а если он имеется, то сказать заранее, пригоден ли он как носитель, невозможно.
В связи с этим были предприняты поиски альтернативных носителей с такими же защитными свойствами, как у торфа.
С неодинаковым успехом для этой цели были испробованы всевозможные композиции: разнообразные смеси почвы и торфа, измельченная солома, нильский ил с добавками питательных веществ, кокосовые хлопья, древесный уголь. Сегодня для поддержания жизнеспособности
Rhizobium получают носители из самых разнообразных веществ, но лучшим носителем все же является торф.
В некоторых регионах, например в развивающихся странах, определенную ценность могут представлять дешевые местные заменители торфа.
Самый простой но наиболее эффективный метод инокуляции – смешивание сухого инокулята и семян перед посевом. При этом к семенам
прикрепляется мало бактериальных клеток, большая часть их теряется, и необходимое условие нанесения достаточного числа клеток
Rhizobium на семена не выполняется. Поэтому лучше вносить инокулят в виде водной кашицы. Хорошо прилипает к семенам инокулят на торфе, особенно если добавить к нему водорастворимый
233 клей
(карбоксиметилцеллюлозу).
При этом повышается выживаемость бактерий после высушивания семян.
Симбиотические отношения, приводящие к фиксации азота, - это наиболее эффективный способ биологического образования аммиака, потребляемого сельскохозяйственными культурами. Влияя на них можно достичь значительного прогресса в использовании биологической фиксации азота для производства пищевых продуктов.
Для расширения масштабов и эффективности систем фиксации азота необходимо глубже понять генетику бактерий Rhizobium, чтобы не зависеть столь сильно от природных систем симбиоза, а формировать их с участием любого желаемого вида растений, употребляемых в пищу.
4 Биологический контроль.
Уже в самом начале развития микробиологии стало известно, что одни микроорганизмы могут подавлять рост других (биологический контроль). Наиболее важным результатом интенсивных исследований в этой области было открытие антибиотиков и разработка способов их применения в клинике. Большое внимание привлекла к себе возможность использования одних микроорганизмов для регуляции численности популяций других благодаря действию антагонистических или конкурентных механизмов.
Биологический контроль осуществляется в природе и помогает предотвратить болезни растений, но мы далеко не всегда понимаем, каков его механизм и как им можно управлять с пользой для сельского хозяйства. Успехи в этой практической области исследований весьма незначительны, потому что слишком мало усилий предпринималось для изучения поведения смешанных популяций микроорганизмов в почве и на поверхности растений.
Есть и примеры систем биологического контроля, которые можно считать биотехнологическими.
Например: известна антагонистическая активность гриба Trichoderma. Если внести во влажную почву значительное количество Trichoderma lignorum, то он подавит болезнь «черная ножка» (выпревание проростков), главным образом благодаря действию токсина, который можно выделить из фильтратов культур гриба. Известно, что другие виды Trichoderma вступают в антагонизм или прямо паразитируют на многих грибах и способны существенно снижать заболеваемость, вызываемую рядом почвенных патогенов растений.
В Европе базидиомицет Fomes annosus является основным возбудителем сердцевинной гнили хвойных, особенно елей. Он сражает также лиственные породы и лесоматериалы. Заражение этим
234 грибом сосновых пней тоже нежелательно, так как
инфекция распространяется на их корни, а затем и на корни соседних здоровых деревьев. Заселение пней этим грибом можно предотвратить, засеяв их спорами другого гриба-базидиомицета,
Peniophora gigantea. Гриб разрастается на пнях, и, контактируя с
Fomes annosus, подавляет развитие сердцевинной гнили.
Скорее всего любой организм, избранный в будущем для осуществления биологического контроля, будет действовать на патогены двояким способом: либо образуя вещества-ингибиторы, либо конкурируя за питательные вещества.
Ключевые слова и понятия биологическая продуктивность биологический контроль инокуляция патогенны протопласты симбиоз бактерии-ризобиумы сорт гриб Trichoderma lignorumбазидиомицет Fomes annosus
235
ЛЕКЦИЯ 10. ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА
И БИОТЕХНОЛОГИЯ
1 Роль биотехнологии в охране окружающей среды.
2 Технология биологической переработки отходов.
3 Отходы молочной промышленности, производства красителей и целлюлозно-бумажной промышленности.
4 Биодеградация нефтяных загрязнений, пестицидов и поверхностно- активных веществ.
1 Роль биотехнологии в охране окружающей среды.
С момента возникновения цивилизованного общества перед ним все время стояла проблема охраны окружающей среды. Из-за промышленной, сельскохозяйственной и бытовой деятельности человека постоянно происходили изменения физических, химических и биологических свойств окружающей среды, причем многие из этих изменений были весьма неблагоприятны.
Ожидается, что биотехнология будет оказывать многообразное и все возрастающее влияние на способы контроля за окружающей средой и на ее состояние. Хорошим примером такого рода служит внедрение новых, более совершенных методов переработки отходов, однако этим применение биотехнологии в данной сфере отнюдь не ограничивается. Она будет играть все большую роль в химической промышленности и сельском хозяйстве и поможет хотя бы отчасти решить многие из существующих проблем.
Сегодня быстро развиваются многообразные отрасли промышленности, в которых процессы жизнедеятельности микробов
236 используются для создания замкнутых систем, для контроля за загрязнением сточных вод, для использования альтернативных энергоресурсов и химического сырья в промышленности; эти процессы широко используются в сельском хозяйстве.
Для переработки отходов уже построены огромные биореакторы емкостью 4000-5000 м
3
. Поскольку потенциал бактерий в таком реакторе может быть порядка 10 8
-10 9
клеток в 1 мл, биотехнологи получают в свое распоряжение достаточно мощный источник
«биологической энергии».
Биотехнологическая переработка отходов опирается на ряд дисциплин
– биохимию, генетику, химию, микробиологию, химическую технологию и вычислительную технику. Усилия всех этих дисциплин концентрируются на трех основных направлениях:
1. Деградация органических и неорганических токсичных отходов;
2. Возобновление ресурсов для
возврата в круговорот веществ углерода, азота, фосфора и серы;
3. Получение ценных видов органического топлива.
2 Технология биологической переработки отходов. Тысячелетиями отходы деятельности человека перерабатывались естественным путем, при участии соответствующих микроорганизмов. В настоящее время для этих целей используются специальные установки (биофильтры, аэротенки). Одной из важнейших проблем экологической биотехнологии является очистка сточных вод. В наиболее широко распространенных установках для очистки сточных вод выполняются четыре основные операции:
1. При первичной обработке удаляются твердые частицы, которые либо отбрасываются, либо направляются в биореактор.
2. На втором этапе происходит расщепление растворенных органических веществ при участии природных аэробных микроорганизмов. Образующийся ил, состоящий главным образом из микробных клеток, либо удаляется, либо перекачивается в реактор.
3. На третьем этапе (необязательном) производится химическое осаждение и разделение фосфора и азота.
4. Для переработки ила, образующегося на первом и втором этапах, обычно используется процесс анаэробного разложения. При этом уменьшается объем осадка и количество патогенов, устраняется запах, а кроме того, образуется ценное органическое топливо – метан.
Сходные процессы применяются для очистки сточных вод химической, пищевой и целлюлозно-бумажной промышленности.
237
Поэтому любые биотехнологические усовершенствования этих процессов находят немедленное применение в промышленности.
Такие усовершенствования могут быть направлены на увеличение мощности перерабатывающих установок, повышение выхода полезных побочных продуктов, на замену обычно применяемых синтетических химических добавок, устранение запаха и удаление металлов, а также не поддающихся переработке соединений.
Аэробная переработка стоков – это самая обширная область контролируемого использования микроорганизмов в биотехнологии.
Отличительной особенностью аэробной биологической системы является свободный доступ воздуха к аэробным микроорганизмам, участвующим в превращении различных веществ, содержащихся в отходах, в относительно стабильные продукты. Аэробная переработка отходов включает следующие стадии:
1. Адсорбция субстрата на клеточной поверхности;
2. Расщепление адсорбированного субстрата внеклеточными ферментами;
3. Поглощение растворенных веществ клетками;
4. Рост клеток;
5. Высвобождение экскретируемых продуктов;
6. «выедание» первичной популяции организмов вторичными потребителями.
В идеале это должно приводить к полной минерализации отходов до простых солей, газов и воды. Эффективность переработки пропорциональна количеству биомассы и времени контактирования ее с отходами.
Системы аэробной переработки можно разделить на системы с биофильтрами и системы с использованием активного ила.
Биофильтр был самой первой системой,
примененной для биологической переработки отходов, причем его конструкция фактически не изменилась со времени создания в 1890 г. Эта система используется в 70% очистных сооружений Европы и Америки и обладает рядом преимуществ, которые состоят в простоте, надежности, малых эксплуатационных расходах, образовании небольших излишков биомассы и возможности длительного использования установки (в течение 30-50 лет).
В биофильтрах сточные воды пропускают через слой крупно- зернистого материала (гравий или пластмассы), покрытого тонкой бактериальной пленкой, благодаря которой интенсивно протекают процессы биологического окисления. Использование пластмасс
238 позволяет применять такие системы для переработки промышленных стоков высокой концентрации. Другим важным преимуществом является то, что пластмассы – легкий материал, и это позволяет строить высокие, не занимающие много места очистные сооружения.
Для создания оптимальной поверхностной площади, вентиляции и пористости пластмассы размалывают.
Основное изменение в конструкцию очистных сооружений было внесено в 1973 году (в Англии), когда был создан вращающийся биологический реактор. Он представляет собой вращающиеся «соты» из пластиковых полос, попеременно погружаемые в сточные воды и поднимаемые на поверхность. При таком способе увеличивается площадь поверхности, с которой может контактировать биомасса, и улучшается аэрация.
Основной недостаток биофильтра – сложность контроля условий, в результате чего происходит избыточный рост на нем микроорганизмов, ухудшается вентиляция, ограничивается протекание жидкости и, в конечном счете, фильтр засоряется и выходит из строя.
С 1914 г. применяется переработка отходов с помощью активного ила, осуществляемая сложной смесью микроорганизмов. Этот процесс осуществляется в специальных установках – аэротенках.
Аэротенки — огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощью активного ила из бактерий и микроскопических животных, которые бурно развиваются в этих сооружениях, чему способствуют органические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего с потоком подаваемого воздуха.
Бактерии, склеивающиеся в хлопья, выделяют в среду ферменты, разрушающие органические загрязнения. Ил с хлопьями оседает, отделяясь от очищенной воды. Инфузории, жгутиковые, амебы, коловратки и другие мельчайшие животные, пожирая бактерии, не слипшиеся в хлопья, омолаживают бактериальную массу ила.
Сточные воды сначала подвергают механической, а после химической очистке для удаления болезнетворных бактерий путем хлорирования жидким хлором или хлорной известью. Для дезинфекции используют также ультразвук, озонирование, электролиз и другие методы.
Процесс переработки отходов с
помощью активного ила является более эффективным, чем фильтрация, и позволяет перерабатывать сточные воды в количестве, в десять раз превышающем объем реактора. Однако он обладает рядом недостатков: более высокими эксплуатационными расходами из-за необходимости перемешивания и аэрации; большими трудностями в осуществлении и поддержании процесса; образованием большого избытка биомассы. Несмотря на
239 все это, процесс, использующий активный ил, остается наиболее распространенным методом переработки сточных вод в густонаселенных районах, поскольку требует меньших площадей, чем эквивалентная фильтрационная система.
Эффективность данного процесса можно повысить, изучив механизмы регуляции метаболизма в микрофлоре систем с активным илом. Регуляция биодеградации – это сложная задача. Однако, зная биохимию соответствующих процессов, можно вмешиваться в их регуляцию. Например, добавление к илу промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот в низких концентрациях (2-5 мг/л), глюкозы, аминокислот и витаминов (в частности, аланина и никотиновой кислоты) приводит к ускорению окисления ряда соединений.
Все возрастающая стоимость переработки отходов с помощью аэробного разложения и энергетический кризис, с одной стороны, и новые достижения микробиологии и технологии – с другой, возродили интерес к
Скачать 6.85 Mb.