Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
штаммы фага λ. ДНК этого фага сравнительно невелика, гены его хорошо изучены и размножается он в бактериальных клетках очень интенсивно. 310 При получении λ векторов используется то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага λ не нужна для репликации в E. coli, а функционирует только при интеграции фаговой ДНК в бактериальную хромосому (в состоянии лизогении). Были сконструированы специальные штаммы λ, в ДНК которых сайты для EcoR1 расположены таким образом, что правый и левый концевые фрагменты фаговой ДНК, необходимые для репликации остаются нетронутыми. После расщепления с помощью EcoR1 эти концевые фрагменты благодаря их сравнительно большим размерам легко отделить от всех остальных EcoR1-фрагментов и использовать затем для получения новых λ-подобных фагов, каждый из которых содержит левый и правый концевые фрагменты, а также вставку чужеродной ДНК размером около 15 кб. Удобным оказалось то обстоятельство, что для созревания фага λ его ДНК должна иметь длину около 45 кб, благодаря чему при конструировании химерных ДНК in vitro для последующего размножения отбираются только те из них, которые содержат оба конца фаговой ДНК и вставку чужеродной ДНК подходящего размера, т.е. около 15 кб. Этапы клонирования фрагмента ДНК мыши длиной 15 кб в бактериофаге λ, с использованием рестриктазы EcoR1 и соответствующих сайтов рестрикции в геномах фага и мыши представлены на рис. 21. Многие гены эукариот оказались длиннее 15 кб, а некоторые достигают 35-40 кб. Кроме того, клонирование в фаге λ обычно не позволяет выделить два соседних гена в виде единой молекулы рекомбинантной ДНК. Поэтому клонирование значительно более длинных фрагментов ДНК в E. coli проводится в космидах. Рис. 21. Клонирование генов ДНК мыши в бактериофаге λ, с использованием рестриктазы EcoR1 и соответствующих сайтов рестрикции в геномах фага и мыши. 311 Космиды - это искусственные конструкции, созданные на основе плазмид и фага λ. Космида имеет последовательность ori, позволяющую ей реплицироваться в E. coli, селекционный маркёр amp r , полилинкер (сайт множественного клонирования) и так называемые cos-сайты встроенные из фага λ (рис. 22). Сos-сайты представляют из себя расположенные на обоих концах молекулы ДНК фага λ комплементарные одноцепочечные участки величиной 12 нуклеотидов, благодаря которым линейная форма фага, соединяясь со своим соседом через cos-сайт образует длинную цепь из сотен фаговых ДНК или конкатамер. Ферменты, катализирующие упаковку фаговой ДНК, узнают в конкатемере два cos-сайта находящихся на расстоянии 35-45 кб выщепляют расположенную между ними ДНК и упаковывают её в головку фага. Поэтому, когда в относительно небольшую космиду, несущую cos-сайты, встраивается чужеродная ДНК размером 35-45 кб, молекула достигает необходимой длины что бы упаковаться в фаговую частицу. Затем полученные фаги, несущие вставленную чужеродную ДНК вводятся в клетки E. coli для последующего размножения (клонирования). 2 Создание генных библиотек и их использование, получение к-ДНК. На следующем этапе развития генной инженерии учёные начали включать в векторы все гены различных организмов. Иными словами, они начали создавать генные банки или генные библиотеки. Генные инженера, раздробив с помощью определённой рестриктазы (техника «дробовика») суммарную ДНК конкретного организма на фрагменты, добавляют к ним вектор, обработанный той же рестриктазой, и всю эту смесь используют для трансформации бактерий. Обычно в каждую рекомбинантную клетку имеет шанс попасть одна молекула ДНК, представляющая собой гибрид вектора и какого-нибудь одного из многих фрагментов, Полилинкер сайт Рис. 22. Структура типичного космидного вектора, объединяющего свойства фага λ и плазмиды. 312 присутствовавших в смеси. Клетка, получившая гибридную ДНК, размножившись, образует клон. Набор клонов бактерий, содержащих различные рекомбинантные молекулы, включившие все возможные фрагменты ДНК определённого организма и составляют геномную библиотеку (банк генов). Техника «дробовика» позволила получить набор клонов бактерий или гибридных фагов, различающихся по включённым фрагментам ДНК. Уже в 1974 г. Д. Хогнесс с сотрудниками создали геномную библиотеку дрозофилы в клетках E. coli. Через два года американцы Л. Кларк и Д. Карбон стали владельцами библиотеки всех генов самой бактерии E. coli. Вслед за этим были получены геномные библиотеки ряда других организмов, включая человека. Допустим, что у нас уже есть геномная библиотека какого-то животного, скажем морской свинки. Мы получили эту библиотеку, выделив из клеток свинки ДНК, расщепив её подходящей рестриктазой на фрагменты, встроив эти фрагменты в вектор и введя полученную рекомбинантную ДНК, например в E. coli. Но в какую из тысяч трансформированных клеток E. coli попал интересующий нас ген? Для решения этой задачи поиска иголки в стоге сена, в настоящее время применяются так называемые кДНКовые зонды, которые представляют собой радиактивно меченную ДНК, характерную для конкретного гена. Но сначала учёные научились выделять в достаточных количествах мРНК отдельных генов. Дело в том, что практически все мРНК эукариот на своих 3’ концах содержат последовательность poly(A). Эта поли(А) последовательность предоставляет прекрасную Рис. 23. Синтез двухцепочечной кДНК на мРНК. С роlу(А) «хвостом» мРНК гибридизуют короткий фрагмент oligo(dT). Этот - фрагмент служит затравкой для обратной транскриптазы, которая использует мРНК в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК. Оставшуюся мРНК разрушают обработкой NaOH, и с помощью ДНК-полимеразы I завершают синтез второй цепи ДНК, в результате чего получается двухцепочечная молекула кДНК. 313 возможность для синтеза ДНК комплементарной мРНК. Если смешать с мРНК короткие oligo(dT), они будут гибридизоваться с poly (A) и послужат затравками для работы фермента обратная транскриптаза (рис. 23). Этот интересный фермент, открытый Тёми- ным и Балтимором, использует РНК как матрицу для синтеза комплементарной цепи ДНК или кДНК (cDNA). Необходимо отме- тить, что она соответствует только структурной части гена, которая кодирует его белковый продукт, а регуляторные части гена и интроны в кДНК не представлены. Полученная с помощью обратной транскриптазы и ДНК- полимеразыI двухцепочечная молекула кДНК встраивается затем в плазмиду либо с помощью «хвостов» достроенных концевой трансферазой, либо путём пришивания к концам кДНК искусственных фрагментов, несущих сайты рестрикции. Эти фрагменты, так называемые линкеры, представляют собой последовательности, состоящие из 8-10 нуклеотидных пар химически синтезированных олигонуклеотидов. Линкеры пришивают к двухцепочечной кДНК с помощью ДНК-лигазы, а затем расщепляют их рестриктазой, и кДНК, содержащую теперь липкие концы, встраивают в плазмиду, разрезанную той же рестриктазой. Затем, полученную рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК вводят в клетки соответствующего штамма E. coli, где она размножается. 3 Методы скрининга. В настоящее время разработаны специальные методы скрининга (поиска), позволяющие с помощью кДНК, используемых в качестве зондов, обнаруживать нужные гены, хранящиеся в геномных библиотеках. Чаще всего геномная библиотека хранится в E. coli в виде набора бактериальных колоний, каждая из которых содержит различный фрагмент геномной ДНК. Если в чашках Петри к Рис. 24. Идентификация бактериальных колоний, содержащих плазмиду со вставкой фрагмента геномной ДНК. Конструируют библиотеку геномной ДНК, например в pBR322 и трансформируют ею Е. coli, после чего получают «реплику» образовавшихся колоний на нитроцеллюлозном фильтре. Бактерии с рекомбинантной плазмидой, содержащей последовательности, гомологичные последовательности меченого зонда, гибридизуются и выявляются радиоавтографически. Затем на исходной чашке отыскивают колонию, локализованную там же, где и соответствующая колония на фильтре-реплике. 314 поверхности плотной среды, на которой посеяны различные колонии E. coli, хранящие геномную библиотеку, приложить фильтр из нитроцеллюлозы каждая колония разделится – часть останется на чашке, а часть отпечатается на фильтре (рис. 24). Под действием раствора щелочи бактерии на фильтре лизируются, а ДНК распадается на однонитчатые цепочки. После того как фильтр прогреют при высокой температуре в вакуумной печи, цепи ДНК прочно свяжутся с нитроцеллюлозой. Затем на фильтр наносят радиоактивно меченную кДНК интересующего гена. Меченный кДНК-зонд будет комплементарно гибридизоваться только с фрагментом геномной ДНК содержащим искомый ген. Если на нитроцеллюлозный фильтр положить рентгеновскую плёнку, то местоположение метки можно определить по участкам затемнения. Этот метод называемый ДНК-ДНК гибридизацией даёт возможность узнать в какой колонии бактерий находится наш ген. Колонии отбирают, выделяют из неё ДНК и анализируют. Убедившись, что нужный ген «пойман», решают, как изучать его строение, определить функции, как заставить его работать в новых хозяевах и нельзя ли улучшить его свойства. Ключевые слова и понятия химерные плазмиды большие вставки хромосомной ДНК штаммы фага λ λ вектор центральная часть ДНК фага λ лизогения концевые фрагменты фаговой ДНК созревание фага λ геном фага λ геном мыши клонирование в фаге λ космиды последовательность ori селекционный маркёр amp r полилинкер cos-сайты конкатамер генные банки геномные библиотеки суммарная ДНК организма трансформация бактерий набор клонов бактерий набор клонов гибридных фагов геномная библиотека дрозофилы библиотеки всех генов E. coli кДНКовые зонды последовательность poly(A) короткие oligo(dT) обратная транскриптаза ДНК полимераза 1 комплементарная цепь ДНК кДНК (cDNA) структурная часть гена регуляторная часть гена линкеры двухцепочечная молекула кДНК концевая трансфераза фильтр из нитроцеллюлозы лизирование меченный кДНК-зонд 315 техника «дробовика» ДНК-ДНК гибридизация 316 ЛЕКЦИЯ 21. ГЕННАЯ ДАКТИЛОСКОПИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК 1 Минисателлитная ДНК. 2 Генная дактилоскопия. 3 Методы секвенирования фрагментов ДНК. 1 Минисателлитная ДНК. В геноме каждого человека имеется так называемая минисателлитная ДНК. В основе её строения лежит повторяющаяся последовательность, состоящая из 14 - 100 нуклеотидов. Цепочка одной минисателлитной ДНК может насчитывать таких повторяющихся последовательностей от одной до нескольких тысяч. У людей имеется два и более десятков минисателлитных цепочек, расположенных на разных хромосомах. В совокупности они образуют набор минисателлитных ДНК, различающихся по длине. Было обнаружено, что для каждого человека характерен свой, присущий только ему вариант набора таких тандемно повторяющихся последовательностей, отличающихся по длине, то есть по числу отдельных звеньев. Иными словами, ситуация оказалась сходной с отпечатками пальцев человека. У каждого имеется собственная минисателлитная ДНК. Поэтому и метод анализа фрагментов минисателлитной ДНК получил название генной дактилоскопии (фингерпринт ДНК). 2 Генная дактилоскопия. Технология генной дактилоскопии включает ряд хорошо разработанных и уже рассмотренных нами методов. Сначала из каких либо клеток выделяют ДНК и с помощью рестриктаз разрезают её на фрагменты разной длины. Среди фрагментов естественно будут те, которые содержат вариабельные минисателлиты. Далее проводится стандартный Саузерн-блот анализ. Все полученные фрагменты подвергаются электрофорезу в геле и фракции, содержащие минисателлитную ДНК выявляются с помощью специального меченого зонда, комплементарного повторяющемуся фрагменту нуклеотидов. Так как зонд радиоактивен, то он засвечивает ренгеновскую плёнку только в определённых местах, давая картину из нескольких десятков чередующихся темных фракций, соответствующих отдельным минисателлитам. Схематическое изображение этапов использования вариабельного числа тандемных повторов (VNTRs, variable number tandem repeats) при 317 проведении фингерпринта ДНК, взятой у двух мужчин Василия и Михаила представлена нарис. 25. Для двух людей картина на авторадиограмме существенно отличается как по числу, так и по расположению и интенсивности фракций. Чем более родственны анализируемые особи, тем число сов-падающих полос после фингерпринта ДНК будет больше и наоборот. Полностью совпадающие спектры минисателлитной ДНК выявляются только у однояйцевых близнецов. Следует добавить, что метод фингерпринта минисателлитной ДНК обладает высокой чувст- вительностью и анализ можно проводить на одной капле крови или нескольких волосяных луковиц. Ниже рассмотрен пример успешного применения этого метода в криминалистике. Так несколько лет назад в ходе расследования убийства на месте преступления была обнаружена капля крови, принадлежащая убийце. Рис. 25. Упрощенная схема использования вариабельного числа тандемно повторяющихся последовательностей в проведении фингерпринта ДНК. Число копий повторяющихся последовательностей Саузерн-блот Сайты рестрикции Повторяющаяся последовательность нуклеотидов ДНК Василия ДНК Михаила локус 1 Разрезание рестриктазами и загрузка ДНК в гель Гомологичные хромосомы локус 2 локус 3 318 Спектры ДНК данной капли крови, а также семи подозреваемых, полученные в результате фингерпринта минисателлитной ДНК, представлены на радиограмме, приведенной на рис. 26. Спектр ДНК образцов капли крови, оставленный преступником на радиограмме, отмечен звёздочкой, а спектры семи подозреваемых - цифрами. Исходя из представленных спектров ДНК, после фингерпринта легко определить, кто из семи подозреваемых является предполагаемым преступником. Это может быть только человек, образцы ДНК которого представлены на дорожке № 3, поскольку только здесь все фракции полностью совпадают со спектрами ДНК капли крови предполагаемого преступника, которую удалось обнаружить на месте преступления. В тоже время подозрение в совершении преступления с других шести человек на основании полученных молекулярно-генетических данных можно снять. 3 Методы секвенирования фрагментов ДНК. Фингерпринт, Саузерн блоттинг и другие методы анализа рест- рикционных фрагментов ДНК дали возможность сделать много важ- ных открытий в генной инженерии, но настоящим успехом стала раз- работка методов секвенирования фрагментов ДНК длиной 100-500 нуклеотидных пар. Первый прямой метод определения последователь- ности ДНК был предложен Ф. Сэнгером в 1975 г. Он основан на элонгации ДНК при помощи фермента ДНК-полимеразы. Этим способом была быстро секвенирована короткая ДНК фага х174, длиной 5,4 кб. Столь же мощный метод сиквенса ДНК был разработан А. Максамом и У. Гилбертом в 1977 г. в Гарвардском университете. С его помощью менее чем за год удалось установить последова- тельность ДНК для вируса sv-40 (5,2 кб) и плазмиды рBR322 (4,3 кб). Рис. 26. Фингерпринт спектров минисателлитной ДНК образца капли крови убийцы и семи подозреваемых в преступлении. 1 2 3 4 5 6 7 * 319 Метод секвенирования ДНК по Максамому- Гилберту заключается в следующем. Один из концов фрагмента ДНК, последова-тельность которого нужно определить (прочитать), метят с помощью изотопа 32 Р. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обра- батывают реагентом, специфически разру- шающим одно из четы- рех оснований ДНК. Ус- ловия реакции подби- рают таким образом, чтобы на каждую моле- кулу ДНК приходилось лишь несколько по- вреждений. Когда эти повреждённые молекулы обрабатывают пиперидином, в ДНК образуется разрыв в том месте, где находилось разрушенное основание. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоя-нием от раз- рушенного основания до конца молекулы. Например, если остатки Г находятся на расстоянии 2, 6, 11 и 16 нуклеотидов от меченого конца, как в случае, рассмотренном на рисунке выше, то обработка данной цепи ДНК реагентами, разрушающими Г, приведёт к образованию меченых фрагментов длиной 2, 6, 11 и 16 нуклеотидов (при этом, естественно Химическим путем разрушают одно из четырех оснований, в результате чего происходит расщепление цепи в соответствующих точках. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы в каждой точке расщеплялись только некоторые из цепей; при этом получается набор фрагментов разной длины Радиоактивная метка |