Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично, «ступенькой» между нуклеотидами Г и А (рис. 15). Рис. 14. а) схема действия фермента рестриктазы Sma I на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с тупыми концами после разрезания ферментом SmaI. Ц – Ц – Ц – Г – Г – Г Г – Г – Г – Ц – Ц – Ц Sma а) б) Г – Г – Г Ц – Ц – Ц Г – Г – Г Ц – Ц – Ц 298 Рис. 15. а) схема действия фермента рестриктазы EcoR I на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом EcoR I. Ц – Т – Т – А – А Г А – А – Т – Т – Ц Г Г – А – А – Т – Т – Ц Ц – Т – Т – А – А – Г EcoR I а) б) В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы притягиваются друг к другу, желая восстановить свои старые связи и скрепиться, как им и положено, водородными мостиками. Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов, то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу “липкие концы” (рис. 15). Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК. Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах. Несколько рестриктаз и участки ДНК, которые они могут разрезать, представлены в таблице 3. Таблица 3. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности. Рестриктазы Участки распознования и места разреза ДНК Bam I 5`-Г-Г-А-Т-Ц-Ц-3` 3`-Ц-Ц-Т-А-Г-Г-5` EcoR I 5`-Г-А-А-Т-Т-Ц-3` 3`-Ц-Т-Т-А-А-Г-5` Hind III 5`-А-А-Г-Ц-Т-Т-3` 3`-Т-Т-Ц-Г-А-А-5` 299 Hae III 5`-Г-Г-Ц-Ц-3` 3`-Ц-Ц-Г-Г-5` Hpa II 5`-Ц-Ц-Г-Г-3` 3`-Г-Г-Ц-Ц-5` Sma I 5`-Ц-Ц-Ц -Г-Г- Г-3` 3`-Г-Г- Г- Ц-Ц-Ц-5` С помощью этих и некоторых других ферментов многие исследователи начали конструировать и конструируют в настоящее время разнообразные по своим составным частям гибридные (рекомбинантные) ДНК. Ключевые слова и понятия ферменты рестрикции рестриктазы распознаваемые участки сайты рестрикции липкие концы ровные (тупые) концы EcoRI Sma I Hind III ДНК-лигаза гибридные (рекомбинантные) ДНК конструирование ДНК 300 ЛЕКЦИЯ 18. АНАЛИЗ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК (ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ) 1 Электрофоретический метод анализа. 2 Построение рестрикционных карт ДНК. 3 Метод Саузерн-блот гибридизации. 1 Электрофоретический метод анализа. При помощинабора ферментов рестрикции исследователи научились получать фрагменты ДНК разных размеров практически из любых видов. В ходе манипуляций с различными фрагментами ДНК часто необходимо определить размер или выделить конкретный участок ДНК из смеси. Оказалось, что фрагменты ДНК легче всего разделять с помощью метода электрофореза в агарозном геле. ДНК, обработанную одной или несколькими рестриктазами, помещают в лунки застывшего агарозного геля, который помещается в специальную камеру для электрофореза (рис. 16). В камере создается электрическое поле, под действием которого фрагменты ДНК начинают перемещаться в пористом, похожем на мармелад геле. Скорость продвижения фрагментов ДНК в геле зависит от их длины. Короткие фрагменты движутся быстрее, чем длинные. Это позволяет цепочкам ДНК разной длины отделиться друг от друга. При этом фрагменты ДНК не повреждаются и их можно выделить из геля без всяких повреждений и потери биологических свойств. Если после электрофореза окрасить гель специальным красителем этидиум бромидом, связывающимся с ДНК и поместить Рис. 16. Схематическое изображение камеры для электрофореза ДНК в агарозном геле. Справа представлена электрофореграмма фрагментов ДНК, окрашенная этидиум бромидом и помещенная под УФ свет. (М – маркеры, 1,2,3 – образцы одной и той же ДНК, разрезанные различными рестриктазами). Мост из фильтровальной бумаги Агарозный гель Лунки для образцов ДНК Электрод Буферный раствор Направление движения ДНК Источник тока М 1 2 3 Kb 10 1 7 6 5 3 301 гель под ультрафиолетовый свет, то на нем будут хорошо видны окрашенные в красный цвет, расположенные на различном расстоянии друг от друга светящиеся фракции ДНК. Каждая фракция соответствует одному фрагменту ДНК. Следует подчеркнуть, что разные рестриктазы дают разную картину расщепления одной и той же ДНК (электрофореграмма на рис. 16 справа). Таким образом, электрофорез в агарозном геле позволяет разделить, а затем легко извлечь любые рестрикционные фрагменты ДНК в чистом виде для последующего использования. 2 Построение рестрикционных карт ДНК. Анализируя электрофоретические спектры ДНК на геле, наблюдая за исчезновением одних и появлением других фракций под действием разных рестриктаз, исследователи начали составлять генетические рестрикционные карты расположения участков ДНК для разных видов. Первую полную физическую карту расположения участков 14 рестриктаз составил Д. Натанс для ДНК вируса SV-40. 3 Метод Саузерн-блот гибридизации. В 1975 году был разработан метод, который позволяет идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофоретического разделения. Суть метода заключается в том, что сначала фрагменты ДНК, разделенные в агарозном геле, денатурируются до одноцепочечных молекул, а затем весь электрофоретический спектр ДНК отпечатывается (blotting) за счет капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембране (пленке), после чего фиксируется при помощи высокой температуры (рис. 17). Далее мембрана помещается в гибридизационный буфер, содержащий специальный радиоактивно меченый ДНКовый зонд – короткую специфическую последовательность ДНК. Зонд способен гибридизоваться с определенным комплементарным фрагментом ДНК и свяжется только с одной или несколькими конкретными фракциями из всего электрофоретического спектра полученных рестрикционных фрагментов ДНК. На последнем этапе к нитроцеллюлозной мембране, содержащей весь спектр полученных фрагментов ДНК,включая фракции, гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом, прикладывают рентгеновскую пленку. На пленке (авторадиограмме) после экспозиции выявляются засвеченные места, соответствующие расположению меченых фракций ДНК. Это метод получил название Саузерн-блот гибридизации в честь разработавшего его Эдварда Саузерна. 302 К настоящему времени удалось практически полностью расшифровать (прочитать) абсолютное большинство генов даже у таких сложных видов, как человек и дрозофила. Для этих и многих других видов получено огромное количество различных ДНКовых зондов (проб), которые успешно используются в Саузерн-блот анализе. Ключевые слова и понятия ферменты рестрикции фрагменты ДНК манипуляции с фрагментами ДНК электрофорез в агарозном геле электрофоретическая камера разделение рестрикционных фрагментов ДНК выделение рестрикционных фрагментов ДНК из геля светящиеся фракции ДНК идентификация генов и рестрикционных фрагментов ДНК blotting нитроцеллюлозная мембрана радиоактивно меченый ДНКовый зонд Саузерн-блот гибридизация ДНК пробы фракции гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом Пробы ДНК, меченные радиоактивным Р 32 1 2 3 4 Фотопленка Авторадиограмма Авторадиогра фия Проявка пленки 1 2 3 4 1 2 3 4 Нитроцеллюлозна я пленка Агарозный гель Гибридизация с уникальной ДНК-пробой Перенос ДНК– фрагментов на мембрану (нитроцеллюлозную пленку) Электрофорез Рис. 17. Схематическое изображение основных этапов Саузерн-блот гибридизации. 303 денатурация ДНК авторадиограмма Саузерн-блот анализ ЛЕКЦИЯ 19. ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ – СПЕЦИАЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ДОСТАВКИ И КЛОНИРОВАНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ 1 Векторы и их применение. 2 Простейшие плазмидные векторы pSC101 и pBR322. 3 Плазмидные векторы усложненной конструкции. 1 Векторы и их применение. С помощьюферментов рестриктаз и лигаз исследователи научились конструировать разнообразные по своим составным частям гибридные (рекомбинантные) ДНК, путём сшивки фрагментов разных видов in vitro. Но как полученным гибридным генам попасть в клетку и начать там “работать” – производить белки? Для доставки чужеродных генов в различные организмы учёные стали применять специальные устройства, так называемые векторы. Вектор – это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. В английской литературе вектор часто обозначается словом vehicle – повозка. Идеальными векторными молекулами, созданными самой природой, оказались плазмиды, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, самостоятельно живущие в цитоплазме бактерий. Плазмиды способны к автономной репликации, обладают генами устойчивости к различным антибиотикам, что позволяет легко обнаружить их присутствие в клетках, плазмиды могут внедряться в хромосому клетки хозяина, а также имеют участки ДНК (сайты рестрикции) для действия ряда рестриктаз. Это означает, что каждая такая рестриктаза может разрезать кольцо плазмидной ДНК и переводить её в линейное состояние. После чего линейную плазмиду можно легко соединить с фрагментом ДНК другого вида с подходящими липкими концами. 2 Простейшие плазмидные векторы pSC101 и pBR322. 304 Первым успешным вектором-повозкой, который начали использовать в генной инженерии, стала кольцевая плазмида pSC101. Она несет только один участок расщепления (сайт рестрикции) рестриктазой EcoR1 и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концы которой могут «слипаться» между собой или с любыми фрагментами другой ДНК, полученными под действием той же рестриктазы. Кроме того, она несет ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, а значит легко обнаруживается в бактериях, если их растить на среде с этим антибиотиком. Все эти свойства pSC101 и были использованы для создания и клонирования первых гибридных (рекомбинантных) ДНК, которые были бы функционально активными, то есть могли бы стабильно существовать в клетке и наделять (трансформировать) ее новыми признаками. Этапы введения фрагмента чужеродной ДНК в плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoR1 схематически показаны на рис. 18. По мере развития методов генной инженерии совершенствовались и плазмидные векторы. Широкое Рис. 18. Введение фрагмента рекомбинантной молекулы ДНК в плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoRI, образующей «липкие» концы: а)—разрезание молекул ДНК рестриктазой и образование фрагментов с «липкими» концами; б) — гибридизация и сшивание ферментом лигазой фрагментов ДНК. pSC101 EcoRI ДНК А А Т Т Т Т А А А А Т Т Т Т А А Т Т А А А А Т Т А А Т Т Т Т А А а) б) Фрагмент ДНК EcoRI EcoRI 305 распространение получила плазмида pBR322. У нее больше участков, разрезаемых различными рестриктазами, следовательно, с ней можно «сшивать» самые разные фрагменты ДНК. Более того, у pBR322 не один, а два маркера для селекции на бактериальных средах: помимо тетрациклина эта плазмида кодирует еще ус- тойчивость к ампициллину (рис. 19). Если один из этих генов (на- пример, ген устойчивости к тетрациклину) разрезать определенной рестриктазой, то при встраивании в это место фрагмента чужеродной ДНК целостность гена нарушается и определяемый им признак исчезает. Это позволяет легко отбирать гибридные плазмиды, специальным образом введённые в бактериальные клетки кишечной палочки E. coli при помещении их на твёрдую питательную среду с антибиотиками ампицилином и тетрациклином и на среду только с ампициллином. Трансформированные бактерии E. coli, т.е. содержащие гиб- ридные плазмиды, растут на среде с ампицилином, но не растут на среде с двумя антибиотиками, потому что ген тетрациклиновой устойчивости в плазмиде повреждён вставкой. Селективный рост позволяет отбирать и выращивать только клетки, содержащие гибридные молекулы ДНК. 3 Плазмидные векторы усложненной конструкции. Многие годы успешно применяется еще один класс плазмидных векторов, относящихся к типу pUC. На рисунке 20 представлена схема использования плазмиды pUC18. У этой плазмиды величиной 2,7 кб селекционным маркёром является ген резистентности к ампициллину (amp r ). Кроме того, имеется крайне интересный ген lacZ, в котором расположен полилинкер или участок множественного клонирования длиной около 200 н.п., содержащий Рис. 19. Вектор pBR322, схема расположения сайтов рестрикции. Ap r и Tc r – гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Bam I EcoR I Bal I Ava I Hind III Sal I Ap r Tc r Hind I Pvu I Pst I Pvu I Cla I pBR322 4.3 т. н. п. 306 10 сайтов рестрикции. В результате инсерции (вставки) чужеродной ДНК в полилинкер нарушается работа гена lacZ в плазмиде. Колонии бактерий содержащие нормальный и повреждённый вставкой гены легко различаются если поместить клетки в чашки Петри на среду содержащую субстрат Х-Gal, который расщепляется ферментом - галактозидазой (продукт гена lacZ), с образованием нерастворимого осадка сине-голубого цвета. Если образовались колонии, окрашенные в синий цвет, значит, в этих бактериальных клетках плазмиды не содержат вставки чужеродной ДНК. В тоже время бактериальные клетки, которые содержат плазмиды со встроенной ДНК, образуют неокрашенные колонии. Следовательно, достаточно лишь взглянуть на трансформированные бактериальные клетки и можно с уверенностью сказать успешно ли прошло клонирование вставленной в плазмиду pUC18 чужеродной ДНК или нет. Поэтому гены подобные lacZ получили название репортерных. 307 Помимо плазмид в качестве векторов стали успешно использовать фаги и вирусы. Позже были созданы космиды – особый тип векторов, сочетающих свойства плазмиды и фага. Таким образом, последовательна была создана основная триада элементов техники генной инженерии: выделение генов, «сшивание» их с вектором, доставка гибридной структуры в конкретный (реципиентный) организм, где она сможет размножаться и наследоваться в потомстве. Ключевые слова и понятия рестриктазы и лигазы маркер для селекции Голубые колонии Белые колонии Плазмида без чужеродной ДНК Плазмида с чужеродной ДНК чужерод- ная ДНК Чашки Петри с ампициллином и X-Gal Трансформация бактерий полилинкер pUC 18 Разрезание вектора и чужеродной ДНК рестриктазой Рис. 20. Схема использования плазмиды pUC18 в ходе клонирования фрагмента чужеродной ДНК 308 вектор плазмиды кольцевые молекулы ДНК чужеродная ДНК самостоятельная репликация клонирование экспрессия гены устойчивости трансформация участок расщепления сайт рестрикции pSC101 pBR322 pUC18 lacZ полилинкер участок множественного клонирования Х-Gal -галактозидаза фаги вирусы космиды реципиентный организм трансформированные организмы репортерные гены ЛЕКЦИЯ 20. ФАГОВЫЕ И КОСМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ И СОЗДАНИЕ ГЕНОМНЫХ БИБЛИОТЕК 1 Получение векторов с использованием фага λ. 2 Создание генных библиотек и их использование, получение к-ДНК. 3 Методы скрининга. 309 1 Получение векторов с использованием фага λ. В принципе не составляет труда получить тысячи химерных плазмид, каждая из которых содержит специфический фрагмент, например ДНК человека, мыши или дрозофилы и посредством скрининга большого числа таких плазмид исследовать весь геном любого из этих организмов. Однако, как оказалось плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК не стабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размерах. Это связано с тем, что генетический материал ненужный для размножения плазмиды неизбежно утрачивается. Большие фрагменты хромосомной ДНК (размером около 15 кб) нестабильные в составе плазмид становятся весьма стабильными при встраивании их в специально сконструированные |