Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
Тематика рефератов 1. История открытия рестриктаз. 2. Характеристика рестриктаз I и II типов. 3. Принцип действия и функция ДНК-лигаз. 397 Вопросы для самоконтроля 1. Какую функцию выполняют лигазы? 2. Что такое распознаваемые участки? 3. Приведите примеры известных вам рестриктаз. 4. Каким образом осуществляет разрезание фермент рестрикции EcoRI? 5. Что такое конструирование гибридных (рекомбинантных) ДНК? Задание 1. Разобрать понятия: ферменты рестрикции, распознаваемые участки, липкие концы, ровные (тупые) концы, EcoRI, Sma I, Hind III, конструирование ДНК. Задание 2. Решите предлагаемые задачи: 1. Имеется последовательность из 27 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава: 5`- ЦТГААТТАГГАТЦЦАГГЦААТАГТГТГ -3` 3`-ГАЦТТААТЦЦТАГГТЦЦГТТАТЦАЦАЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК? 2. Имеется последовательность из 24 нуклеотидных пар двухцепочечной ДНК следующего состава: 5`-ТЦАГААТГЦТГГЦЦААГТАЦТТАГ-3` 3`-АГТЦТТАЦГАЦЦГГТТЦАТГААТЦ-5` Каким способом и на сколько частей можно разрезать эту ДНК? 3. Ниже приведены две последовательности одноцепочечных молекул ДНК. Какую из них в двухцепочечной форме могут разрезать известные вам рестриктазы? а) 5`-АЦТЦЦАГААТТЦАЦТЦЦГ-3` б) 5`-ГЦЦТЦАТТЦГААГЦЦТГА-3` 4. Ниже приведены три последовательности одноцепочечных молекул ДНК. Какую из них в двухцепочечной форме могут разрезать известные вам рестриктазы? а) 5`-ТАГГЦТААГЦТТАЦЦГАТ-3` б) 5`-ЦГААТАТТТЦЦГГАТГАА-3` в) 5`-АГГТЦЦТТАТЦЦГАТААТТ-3` 5. Рестрикционный фермент Hpa II разрезает ДНК по 398 последовательности ЦЦГГ. Какова средняя длина фрагментов разрезанной ДНК? 6. Рестрикционный фермент EcoRI разрезает ДНК по последовательности ГААТТЦ. Насколько часто этот фермент будет разрезать двухцепочечную ДНК? 7. Если последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК распределяется случайным образом, то какова будет средняя длина фрагмента при разрезании ДНК рестриктазами, узнающими последовательность из восьми нуклеотидов? 8. Гаплоидный геном человека содержит около 3×10 9 нуклеотидных пар ДНК. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено при разрезании человеческой ДНК рестрикционным ферментом NotI, узнающим октамерную последовательность ГЦГГ- ЦЦГЦ? 9. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено при разрезании человеческой ДНК рестикционным ферментом Sma I? 10. Гаплоидный геном дрожжевого грибка Saccharomyces cerevisiae, состоящий из одной хромосомы, содержит около 13,5 ×10 6 нуклеотидных пар ДНК. Если вы порежете эту ДНК ферментом EcoRI, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено? 11. Гаплоидный геном Saccharomyces cerevisiae (13,5 ×10 6 н. п.) разрезали ферментом HaeIII. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено? 12. Геном кишечной палочки Escherichia coli, представляющий собой одну кольцевую хромосому, содержит около 4,7 ×10 6 н. п. Его разрезали ферментом HaeIII. Сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено? 13. Геном Drosophila melanogaster, состоящий из четырёх хромосом, содержит около 10 8 нуклеотидных пар ДНК. Если вы порежете эту ДНК ферментом EcoRI, то сколько различных рестрикционных фрагментов будет получено? 14. Ниже приведены последовательности двух фрагментов ДНК, выделенных из организмов разных видов. 5`-АААГЦТТЦТГААТЦЦГАТЦГ-3` 3`-ТТТЦГААГАЦТТАГГЦТАГЦ-5` 5`-ГТАЦТЦАГАТЦЦТАГГАТААГЦТТА-3` 3`-ЦАТГАГТЦТАГГАТЦЦТАТТЦГААТ-5` 399 С помощью каких ферментов можно получить гибридную молекулу ДНК из этих фрагментов? Опишите последовательные этапы получения гибридной молекулы. 15. Опишите последовательные этапы получения гибридной ДНК из представленных ниже фрагментов. 5`-ТАЦТАТЦЦГГАГТАГГАТЦЦТ-3` 3`-АТГАТАГГЦЦТЦАТЦЦТАГГА-5` 5`-ЦГГАТЦЦТАГАТТЦЦАТА-3` 3`-ГЦЦТАГГАТЦТААГГТАТ-5` Задание 3. Объяснить следующие термины: рестриктазы, сайт рестрикции, ДНК-лигаза, гибридные (рекомбинантные) ДНК. Тест 1 Ниже приведены 4 правильных ответа для 8 задач (1–8). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют. –. В приведенной ДНК имеется один участок распознавания: ГГАТЦЦ для рестриктазы Bam I (см. таблицу на стр. 18). Поэтому ДНК может быть разрезана в одном месте с образованием двух фрагментов. –. Рестриктаза EcoR I может разрезать фрагмент а. –. Частота встречаемости четырехнуклеотидного фрагмента ЦЦГГ составит (1/4) 4 = 1/256. Таким образом, средняя длина фрагментов ДНК при разрезании Hpa II составит 256 нуклеотидных пар. –. Средняя длина фрагментов ДНК при разрезании рестриктазами, узнающими восьминуклеотидную последовательность, составит 65536 нуклеотидных пар. –. Средняя длина фрагментов при разрезании рестриктазами составит 53637 нуклеотидных пар. Тест 2 Ниже приведены 4 правильных ответа для 7 задач (9–15). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют. –. Должно получиться 732422 + 23 =732445 рестрикционных фрагментов. –. 52734 + 1 =52735 фрагментов. –. 24414 + 4. –. Bam I может разрезать фрагменты с образованием липких 400 концов, а ДНК-лигаза скрепит их в одну молекулу. –. 52734 фрагментов. Тест 3 Ниже приведены 4 правильных ответа для 8 задач (1–8). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют. –. ДНК может быть разрезана в одном месте рестриктазой Hae III с образованием двух фрагментов. –. Фрагменты а и б могут быть разрезаны рестриктазами Hind III и Hpa II соответственно. –. Средняя длина фрагментов ДНК при разрезании EcoRI составит 4096 нуклеотидных пар. –. В результате полного расщепления человеческой ДНК рестриктазой Not I должно получиться 45776 + 23 = 45799 фрагментов. –. Средняя длина фрагментов ДНК при разрезании EcoRI составит 2055 нуклеотидных пар. Тест 4 Ниже приведены 3 правильных ответа для 7 задач (9–15). Поставьте в ответах те номера задач, которые им соответствуют. –. 3296 + 1 = 3297 фрагментов. –. 18359 рестрикционных фрагментов. –. С помощью Hind III можно разрезать оба фрагмента ДНК с образованием липких концов АГЦТ. Затем при смешении фрагментов липкие концы скрепятся между собой за счет водородных связей, а окончательную сшивку в единую гибридную молекулу произведет ДНК-лигаза. –. 22575 рестрикционных фрагментов. Тест 5 1. Назовите функцию, которую выполняют ДНК-лигазы: а) доставка чужеродной ДНК в клетку; б) разрезание ДНК; в) сшивание двух фрагментов ДНК с образованием полной структуры. 2. Рестриктазы действуют на: а) одноцепочечную ДНК; б) одноцепочечную РНК; в) двуцепочечную ДНК. 3. Какова длина распознаваемых рестриктазами участков ДНК? 401 а) 2-3 пары нуклеотидов; б) 4-8 пар нуклеотидов; в) более 8 пар нуклеотидов. 4*. Как называется место, в котором рестриктаза разрезает ДНК? а) сайт рестрикции; б) сайт узнавания; в) сайт расщепления; г) распознаваемые участки. 5. Назовите бактерию, из которой была выделена рестриктаза EcoR I: а) Bacillus amyloliquefaciens; б) Escherichia coli; в) Haemophilus haemolyticus; д) Bacillus subtilis. 6. Рестриктазы действуют: а) только на ДНК бактерий; б) только на ДНК вирусов; в) на ДНК растений и животных; г) им безразлично, чью ДНК разрезать. 7*. Выберите рестриктазы, которые разрезают ДНК с образованием тупых концов: а) Bam I; б) Sma I; в) Hae III; г) Hind III; д) Hpa II. 8. Назовите сайт узнавания для рестриктазы EcoR I: а) 5`-Г-А-А-Т-Т-Ц-3` 3`-Ц-Т-Т-А-А-Г-5` б) 5`-Г- Г-А-Т-Ц-Ц-3` 3`-Ц-Ц-Т-А-Г-Г-5` в) 5`-Ц-Ц-Ц -Г-Г- Г-3` 3`-Г-Г- Г- Ц-Ц-Ц-5` г) 5`-Ц-Ц-Г-Г-3` 3`-Г-Г-Ц-Ц-5`. 9. Какая из нижеприведенных рестриктаз узнает последовательность ДНК 5`-Ц-Ц-Ц-Г-Г-Г-3` 402 3`-Г-Г-Г-Ц-Ц-Ц-5`? а) Hae III; б) Hind III; в) Hpa II; г) Bam I; д) Sma I. 10. Сколько рестриктаз известно в настоящее время? а) более 120; б) более 300; в) более 500; г) около 1000. 11. Какую связь лигируют ДНК-лигазы? а) водородную; б) фосфодиэфирную; в) пептидную. 12. На сколько частей рестриктаза EcoR I разрежет предлагаемую последовательность ДНК из 23 нуклеотидов: 5΄- ГГТТЦАГАГААТТЦАЦГТААТЦЦ-3΄? 3΄- ЦЦААГТЦТЦТТААГТГЦАТТАГГ-5΄ а) на 2 части; б) на 3 части; в) на 4 части; г) не разрежет. 13. Какая из нижеприведенных рестриктаз может разрезать данную последовательность ДНК: 5΄ - ЦГГЦАТТГЦАТГТТАГЦЦГГТАГЦЦ-3΄ 3΄ -ГЦЦГТААЦГТАЦААТЦГГЦЦАТЦГГ-5΄ а) Sma I; б) Hae III; в) Bam I; г) Hpa II; д) Hind III. 14. Назовите нуклеотиды, образующие липкие концы при разрезании молекулы ДНК рестриктазой EcoR I: а) ААТТ ТТАА б) ГААТТ ЦТТАА 403 в) ГААТ ЦТТА г) ГААТТЦ ЦТТААГ. Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ. Цель занятия: ознакомиться с плазмидными, фаговыми и космидными векторами, освоить методы введения и клонирования чужеродных ДНК с помощью векторов на примере решения типовых задач, получить представление о геномных библиотеках и способах их создания на примере решения типовых задач. 1 Векторы и их применение. 2 Простейшие плазмидные векторы pSC101 и pBR322. 3 Плазмидные векторы усложненной конструкции. 4 Получение векторов с использованием фага λ. 5 Строение космид. 6 Создание генных библиотек и их использование. Тематика рефератов 1. Векторы прокариот и методы их введения в клетки. 2. Плазмидные векторы и принципы клонирования в космидах. 3. Векторы на основе бактериофагов, принципы клонирования. Вопросы для самоконтроля 1. Что такое векторы и какое применение они находят в генной инженерии? 2. Что такое плазмида? 3. Какими свойствами должны обладать плазмиды как векторы? 4. Дайте характеристику плазмидам pSC101 и pBR322. 5. Опишите строение и свойства плазмиды типа pUC. 6. Назовите виды векторов. 7. Каков недостаток плазмид как векторов? 8. Как конструируются специальные штаммы λ? 9. Назовите этапы клонирования фрагмента ДНК. 404 10.Что называют космидами и каково их строение? 11.Что такое cos-сайты. 12. Как происходит составление геномных библиотек? Задание 1. Разобрать понятия: маркер для селекции, реципиентный организм, трансформированные организмы, гены устойчивости, участок множественного клонирования, кольцевая молекула ДНК, чужеродная ДНК, самостоятельная репликация. Задание 2. Решить предлагаемые задачи: 1. Ниже приведён фрагмент ДНК, можно ли встроить его в плазмиду pSC101? 5`-АГГЦЦТГААТТААГГЦААТАГТГТГААТЦА-3` 3`-ТЦЦГГАЦТТААТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТАГТ-5` 2. Ниже приведены два одноцепочечных фрагмента ДНК. Какой из них в двухцепочечном варианте можно использовать для встраивания в плазмиду pSC101? а) 5`-ГГЦЦТГААТТЦААГЦАТАГТГТГААТТЦАА-3` б) 5`-ТЦЦГГАЦТТААТТГТТАТЦАЦАЦТТАГТ-5` 3. Кольцевая плазмида pBR322 имеет участки расщепления различными рестриктазами. Какой из ниже приведённых фрагментов двухцепочечной ДНК можно встроить в данную плазмиду? 5`-ЦЦГАТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГАТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТААГТГТ-5` 5`-ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГААГЦТТТЦААТГ-3` 3`-ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦТТЦГАААГТТАЦ-5` 4. Какой из ниже приведённых фрагментов двухцепочечной ДНК можно встроить в плазмиду pBR322? 5`-ЦЦГААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТ-5` 5`-ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГААГЦТТЦАЦАТГ-3` 3`-ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦ ТТЦГААГТГТАЦ-5` 5. В плазмиде pUC18 имеется полилинкерный участок, который содержит сайты рестрикции для 10 различных рестриктаз. Можно ли встроить в эту плазмиду приведённые ниже фрагменты 405 7 kb 6 kb 4 kb 2 kb 1 kb H in d II I S m aI С м ес ь Рис. 2. Электрофореграмма фрагментов ДНК двухцепочечной ДНК? 5`- ЦЦГААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГ ТГААТТЦАЦА-3` 3`- ГГЦТТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦ АЦТТААГТГТ-5` 5`- ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГА АГЦТТТЦААТГ-3` 3`- ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦТ ТЦГАААГТТАЦ-5` 6. Имеется фрагмент двухцепочечной ДНК следующего состава: 5`- ТАГГАТЦЦАТТАААТАГТГГАТЦЦГТ -3` 3`- АТЦЦТАГГТААТТТАТЦАЦЦТАГГЦА- 5` Можно ли встроить данный фрагмент в плазмиду pBR322? Как подтвердить, что фрагмент чужеродной ДНК встроен в плазмиду pBR322? 7. В плазмиду pBR322 вставлен фрагмент чужеродной ДНК. Трансформированные такой плазмидой бактерии растут на питательной среде с ампициллином, но не растут на питательной среде, содержащей тетрациклин. Какой известной вам рестриктазой можно вырезать чужеродную ДНК из плазмиды? 8. Ген Ms находится в кольцевой плазмиде величиной 5 000 нуклеотидных пар (5 000 нп). Разрезание плазмиды рестрикционным ферментом Hind III дает фрагменты 1, 2 и 3, как показано на рисунке 1 (H - Hind III рестрикционные сайты): Тандемная копия гена Ms содержится только в одном Hind III фрагменте. Если ген Ms кодирует регуляторный белок MSS4, состоящий из 300 аминокислот, то укажите, в каком фрагменте плазмиды расположены копии гена Ms? 9. Фрагмент ДНК мыши величиной 4 кб, имеющий на концах сайты рестрикции для EcoRI, содержит ген М. Этот фрагмент был 1400 нп 800 нп 2800 нп Н Н Н 2 3 1 Рис. 1. Рестрикционная карта кольцевой плазмиды с указанием сайтов рестрикций для фермента Hind III. 406 9 kb 8 kb 4 kb 2 kb 1 kb S m aI H in d II I С м ес ь Рис. 4. Электрофореграмма фрагментов ДНК. 3 kb встроен в плазмиду pBR322 по EcoRI сайту. Полученная рекомбинантная плазмида была разрезана двумя рестриктазами, электрофоретический спектр полученных рестрикционных фрагментов, окрашенных этидиум бромидом, представлен на рисунке 2. Для фракций на геле, полученных после разрезания сразу двумя ферментами, была проведена Саузерн-блот гибридизация с использованием в качестве зонда меченого фрагмента плазмиды pBR322. С какими фракциями ДНК произойдет гибридизация меченого зонда? 10. Ген для белка β-тубулина был получен из грибка Neurospora, вставлен в кольцевую плазмиду и клонирован в бактерии E.coli. Опишите шаг за шагом последовательность действий, необходимых для того, чтобы клонировать этот ген от родственного грибка Podospora, используя в качестве вектора кольцевую плазмиду pBR, представленную на рисунке 3, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам канамицину (kan) и тетрациклину (tet). 11. Фрагмент человеческой ДНК величиной 6 кб был встроен в плазмиду pBR 322 по EcoRI сайту. После этого, рекомбинантная плазмида была разрезана двумя рестриктазами, а полученные образцы подвергнуты электрофорезу в агарозном геле, как и в задаче 9. Электрофоретический спектр полученных фрагментов представлен на рисунке 4. Для фракций, полученных после разрезания сразу двумя ферментами, была проведена Саузерн-блот гибридизация с меченым зондом из плазмиды pBR322. С какими фракциями ДНК в этом случае произойдет гибридизация меченого зонда? 12. Исследователи для клонирования важного фрагмента человеческой ДНК величиной 1кб использовали плазмиду pUC18. Трансформированные гибридной плазмидой клетки E. coli были помещены на питательную среду, содержащую X-Gal. После культивирования в чашках Петри появились колонии синего и белого Рис. 3. Кольцевая плазмида pBR, несущая два гена устойчивости к антибиотикам. Сайты рестрикции указаны 407 цвета. Удалось ли встроить нужный фрагмент человеческой ДНК в плазмиду pUC18? 13. Интересный фрагмент человеческой ДНК величиной 1 кб был встроен в плазмиду pUC18 по Hind III сайту и клонирован в E. coli. Если выделить гибридную плазмиду и разрезать рестриктазой Hind III то как будет выглядеть спектр фрагментов после электрофореза в агарозном геле в случае когда человеческая ДНК успешно встроилась в pUC18 и когда этого не произошло? 14. Изменится ли электрофоретический спектр фрагментов после электрофореза в агарозном геле, если выделенную по условиям задачи 13 гибридную плазмиду pUC18 разрезать сразудвумя рестриктазамиHind III и EcoR1? 15. Какой из ниже приведённых фрагментов двухцепочечной ДНК можно клонировать в бактериофаге λ? 5`-ЦЦГААТТЦАГАТГТААГГЦААТАГТГТГААТТЦАЦА-3` 3`-ГГЦТТААГТЦТАЦАТТЦЦГТТАТЦАЦАЦТТААГТГТ-5` 5`-ЦЦТТААГЦТТАГГЦТААГГЦААТАГААГЦТТЦАЦАТГ-3` 3`-ГГААТТЦГААТЦЦГАТТЦЦГТТАТЦ ТТЦГААГТГТАЦ-5` 16. Из семнадцатой хромосомы человека удалось выделить интересный ген, расположенный во фрагменте ДНК величиной около 8 кб. На флангах этого фрагмента имеются сайты рестрикции для фермента EcoR1. Можно ли успешно клонировать этот фрагмент человеческой ДНК в бактериофаге λ? 17. В геноме эукариотического организма имеется сложный тандемно дуплецированный ген. Величина ДНК одной копии этого гена составляет чуть больше 20 кб. Сумеют ли генные инженера в своём арсенале найти подходящий вектор для клонирования тандемной копии данного гена? 18. Получен интересный фрагмент двухцепочечной человеческой ДНК с тупыми концами величиной около 200 нуклеотидных пар. Причем, в этом фрагменте не оказалось сайтов рестрикции для удобных рестриктаз, расщепляющих ДНК с образованием липких концов. Удастся ли успешно клонировать этот фрагмент человеческой ДНК в известных вам плазмидах? 19. Поскольку рестриктаза EcoRI узнаёт последовательность ДНК, состоящую из шести нуклеотидов, то она будет разрезать молекулу двухцепочечной ДНК в среднем один раз на 4096 нуклеотидных пар. 408 Можно ли клонировать какие либо фрагменты ДНК дрожжевого грибка Saccharomyces cerevisiae в фаге λ, если они были разрезаны ферментом EcoRI (геном дрожжевого грибка Saccharomyces cerevisiae, состоящий из одной хромосомы, содержит около 13,5 ×10 6 нуклеотидных пар ДНК)? |