Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
аутоантигенов могут использоваться также при других аутоиммунных болезнях, таких как множественный склероз, ревматический артрит, инсулинозависимый диабет и даже отторжения при трансплантации органов. Инсулинозависимый диабет является аутоиммунным заболеванием, при котором продуцирующие инсулин клетки поджелудочной железы разрушаются собственными цитотоксичными Т-лимфоцитами. Оральное профилактическое потребление значительных количеств иммуногенных белков может привести к предохранению и значительной задержке появления симптомов аутоиммунных болезней. Однако оно возможно только при наличии значительного количества аутоантигенов. Белки инсулин и панкреатическая декарбоксилаза глютаминовой кислоты рассматриваются в качестве оральных вакцин для предотвращения инсулинозависимого диабета. Недавно ученые получили трансгенные растения картофеля, синтезирующие панкреатическую декарбоксилазу глютаминовой кислоты. При скармливании предрасположенным к диабету мышам отмечено как снижение встречаемости диабета, так и величины аутоиммунного ответа. Приведенные выше результаты генно-инженерных разработок убедительно свидетельствуют о возможности создания «съедобных» вакцин на основе трансгенных растений. Работы в этом направлении активно продолжаются, а идея использования растений для производства вакцин уже запатентована в США, что свидетельствует о коммерческом интересе к этим разработкам. 360 Еще одна важная проблема, связанная с разработкой «съедобных» вакцин – уровень экспрессии гетерологичного антигена в растениях. Поскольку при пероральном введении вакцины требуются большие количества антигена, чем при парентеральном, количество синтезируемого в растениях антигена, которое сейчас составляет не более 0,3% от общего растворимого белка, должно быть увеличено. В то же время уровень экспрессии должен быть достаточно высоким для того, чтобы вызывать иммунный ответ, но быть меньше уровня, который вызывает толерантность к антигену, как это происходит с веществами, потребляемыми с обычной пищей. Как показывают эксперименты, уровень экспрессии гетерологичного антигена в растениях может быть увеличен путем использования тканеспецифичных промоторов и энхансеров, энхансеров транскрипции и трансляции, добавлением транспортирующих пептидов, а также путем изменения нуклеотидной последовательности соответствующих генов с использованием кодонов, предпочтительных для растений. Однако, вопрос о том, какие растения лучше использовать и в каком съедобном органе лучше экспрессировать антиген, требует дальнейших исследований, так как в различных растениях могут содержаться вещества, блокирующие или замедляющие иммунный ответ или просто токсичные для человека и животных, как, например, алкалоиды в клетках табака. Ключевые слова и понятия инсулин сахарный диабет β-галактозидаза С-пептид соматотропин карликовость пенициллин ген синтетазы изопенициллина N новые антибиотики актинородин эритромицин кластер генов ery β-лактоглобулин «съедобные» вакцины аутоиммунные болезни аральные вакцины тканеспецифические промоторы предпочтительные кодоны 361 ЛЕКЦИЯ 26. ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ 1 Получение трансгенных растений. 2 Применение методов генетической инженерии для улучшения хозяйственных свойств растений. 3 Повышение устойчивости растений к болезням и вредителям. 4 Перспективы использования трансгенных растений. Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби- нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следова- тельно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений связаны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных растений, способных к симбиотической фиксации азота и т.д. В клетках растений возможна экспрессия генов, перенесенных не только от других растений, но и от микроорганизмов и даже от животных. Получение растений с новыми свойствами из отдельных трансформированных клеток возможно благодаря их свойству то- типотентности, т.е. способности развиваться в целое растение. Однако возможности генной инженерии растений ограничи- ваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выделение 362 искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. 1 Получение трансгенных растений. Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки живот- ных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуще- ствляются главным образом благодаря специфическим структурам — векторам. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей — корончатых галлов. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды — это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев. В бактериальных клетках Ti-плазмиды реплицируются автономно. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов — специфических аминокислот, которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Обычно встречаются плазмиды, кодирующие два типа опинов: либо октопин (октопиновая плазмида), либо нопалин (нопалиновая плазмида). После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраивает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставляет ее таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, необходимые для бактерий. Именно это свойство A. tumefaciens и послужило поводом для создания на основе Ti-плазмиды вектора, доставляющего необходимые гены в клетку. Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах раститель- ных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клетках растений. Т-область включает примерно 10% Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки (гормоннезависимый рост клеток). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом — в области вирулентности — vir-области. Т-области ограничены прямыми повторяющимися последова- тельностями, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-область и перенесена в растительную клетку. Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, 363 находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений независимо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой культиви- руются данные клетки. В связи с этим очень трудно регенерировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостаток — большие размеры Ti-плазмиды, из-за которых затруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционными методами невозможно. В настоящее время конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области, а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений. Существуют и другие бактерии (A. rhiwgenes), вызывающие уси- ленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri- плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат ес- тественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri- плазмиды в данный момент рассматриваются как более перс- пективные векторы. В настоящее времяна основе Ti-плазмид конструируются и другие типы векторов (например, промежуточный и бинарный векторы). Благодаря появлению специфического объекта — изолированных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки, возникли методы прямого переноса генов в растение. К таким методам можно отнести: трансформация растительных протопластов. Осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК -вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК); культуру протопластов на начальной стадии ее роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов; микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток — 10-20 % независимо от типа вектора. Трансформация не 364 видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение; электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране; упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами; метод биологической баллистики. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью баллистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений. 2 Применение методов генетической инженерии для улучшения хозяйственных свойств растений. В большинстве случаев запасные белки растений имеют несбалансированный для питания человека и животных аминокислотный состав. Так, запасные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и треонином, что снижает их питательную и кормовую ценность. Улучшение аминокислотного состава белка путем традиционной селекции не дает желательных результатов, поскольку необходимые гены часто сцеплены с нежелательными признаками и наследуются вместе. Например, у мутантов кукурузы и ячменя повышение содержания лизина коррели- ровало с уменьшением синтеза запасных белков и с уменьшением урожайности. Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов: 1) клонирование генов запасных белков; 2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и выявление последовательностей ДНК, определяющих данный механизм; 3) целенаправленное изменение последовательностей генов запасных белков для улучшения аминокислотного состава; 4) создание векторных конструкций, содержащих измененный ген; 5) введение модифицированных генов в растения. В настоящее время клонированы 10 генов гордеинов ячменя, гены α- и β-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, 365 легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. Имеются практические результаты трансформации растений. Так, введение в геном пшеницы модифицированного гена проламина привело к активному синтезу модифицированного белка, а также повлияло на состав и уровень соответствующих запасных белков. В итоге улуч- шилось хлебопекарное качество пшеничной муки. Томаты, после того как достигают стадии зрелости, постепенно теряют упругость, становятся мягкими и загнивают. Это происходит из-за того, что находящийся у них в межклеточном пространстве пектин расщепляется под действием фермента полигалактуроназа. В ходе создания трансгенного сорта томатов генетики использовали так называемый феномен «замолкания», который происходит в результате введения в растения дополнительной копии структурного гена. В случае с томатами была произведена вставка антисмысловой (перевернутой) конструкции гена полигалактуроназы. В результате у полученного сорта Flavr Savr фермент полигалактуроназа образуется в пониженном количестве. Вследствие этого пектин разрушается значительно медленнее и зрелые томаты продолжительное время сохраняются в хорошем состоянии. Сходным способом были созданы и трансгенные сорта картофеля с повышенным качеством крахмала. Чем меньше в крахмале полисахарида амилозы и больше амилопектина, тем выше качества крахмала. После успешного введения в картофель дополнительной копии гена амилозы (также в антисмысловой форме) этот менее ценный полисахарид в крахмале полученных трансгенных растений практически исчез. В последние годы проведены работы по получению трансгенных масличных растений с измененным содержанием жирных кислот. Так в сою встроили ген, кодирущий антисмысловую конструкцию фермента омега-3 десатуразы, катализирующий синтез линоленовой кислоты из линолевой. Трансгенные растения характеризовались пониженным содержанием линолевой и повышенным – ценной олеиновой кислоты. 3 Повышение устойчивости растений к болезням и вредителям. Устойчивость растений к фитопатогенам . Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные патогены. В растении существуют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Начинается синтез соединений, вызывающих гибель 366 патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и β-1,3-глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Применение методов генетической инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансгенные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. Так, были получены трансгенные растения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам. Перспективны клонирование и перенос генов, кодирующих специфические белки (small antibiotic-like proteins), содержащиеся в семенах многих растений. Эти белки защищают семена в период покоя и во время прорастания от грибных и бактериальных инфекций. Успешно закончились эксперименты по повышению устойчивости табака к фитофторе (Phytophtora parasitica) путем встройке гена, кодирующего белок бета-криптогенин под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (один из самых эффективных промоторов). Трансгенные растения показали повышенную устойчивость к ряду рас данного гриба. Другой подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у растений табака, трансформированных геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ). Устойчивость растений к гербицидам . В настоящее время в сельском хозяйстве широко используют гербициды — химические соединения, применяемые для уничтожения сорной растительности. Гербициды широкого спектра действия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рост культурных растений. В связи с этим возникает необходимость в создании растений, устойчивых к этим веществам. Существует два подхода к решению этой проблемы: прямая селекция устойчивых к гербицидам мутантных форм растений, или мутантных клеточных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод, который состоит во введении в растения генов гербицид-резистентности растительного или бактериального 367 происхождения. Благодаря использованию методов генетической инженерии были созданы новые, устойчивые к различным гербицидам сельскохо- зяйственные культуры. В геном этих культур вводились мутантные гены, кодирующие синтез ферментов, на которые гербициды (атразин, биалофос, бромоксилин, имидазол) не оказывают негативного действия. Например, растения лядвенца рогатого (Lotus comiculatus) были трансформированы с помощью штамма А281/рСВЕ21. Эта бактерия содержит плазмиду со встроенным геном bar, кодирующим фермент, придающий устойчивость к гербициду биалофосу (фосфинотрицин). Трансгенные растения содержат ген bar и невосприимчивы к гербициду. Однако в тканях таких растений наблюдается накопление гербицидов, и использовать эти растения можно только в технических целях. Вместе с тем показано, что введение генов, кодирующих другие ферменты, позволяет проводить детоксикацию гербицидов, создавая, таким образом, растения, пригодные в пищу. Изучая механизмы действия гербицидов, генетики выяснили, что чаще всего они действуют на какой либо один важный для растения фермент, прикрепляются к нему и тем самым ослабляют его работу. Это приводит к нарушению роста и развития растений, и они погибают. Установлено, что толерантность к гербицидам обусловлена мутацией одного гена. Основной механизм устойчивости связан с изменением последовательности аминокислот в той части молекулы фермента, в которой происходит его связывание с гербицидом. В результате гербицид не узнает свою «мишень» в структуре фермента, последний сохраняет свою функциональную активность, а организм становится толерантным к действию гербицида. Описанный механизм получил название «мутация мишени» и характерен для устойчивости к таким гербицидам, как Раундап (глифосат), сульфанилтиомочевина и др. Гербицид глифосат относится к гербицидам общего действия. Его мишенью в растении является фермент EPSPS (енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза), который играет важную роль в синтезе ароматических аминокислот. Под действием глифосата неустойчивые к нему растения из-за недостатка ароматических аминокислот погибают в течение двух недель. Необходимо подчеркнуть, что глифосат не несет опасности для животных и человека, так как его «мишень» EPSPS имеется только у растений, грибов и бактерий. В результате генетических исследований были обнаружены 368 бактерии, у которых из-за точковой мутации произошла замена одной аминокислоты в области фермента EPSPS, где происходит его связывание с гербицидом глифосатом. Поэтому гербицид не может дезактивировать такой мутантный фермент, и бактерии устойчивы к его действию. В настоящее время выделены гены EPSPS с мутацией мишени от бактерий рода Agrobacterium (ген cp4), Salmonella (ген sm1) и др. Например, в более чем 1000 полученных трансгенных сортах сои, устойчивых к глифосату, встроен мутантный ген cp4 от почвенной бактерии Agrobacterium tumefascens. Для доставки гена EPSPS к хлоропластам (месту синтеза ароматических аминокислот) к нему присоединен фрагмент ДНК от петунии, кодирующий небольшой транзитный пептид. Таким образом, генетически модифицированные сорта сои отличаются от обычных тем, что у них фермент EPSPS, привнесенный от гена бактерии, не связывается с гербицидом, что делает эти сорта устойчивыми к глифосату. Хлоропластный транзитный пептид от петунии быстро разрушается в процессе переваривания и также не несет опасности для организма животных и человека. Устойчивость растений к насекомым. Еще в 30е годы ХХ века было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтезируют специфический белок — так называемый Bt-протеин (Bt-токсин, дельта-эндотоксин) высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщепляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Необходимо отметить, что Bt-протеин, выделенный из одного определенного штамма бактерии, способен убивать только определенный тип насекомых, например, жуков, и не действует на пчел, бабочек и др. Поэтому препараты, широко используемые в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с различными насекомыми-вредителями в соответствии со спектром действия носят названия колептерин, лепидоцид, дендролин и др. Еще одним важным достоинством этих препаратов является их полная безопасность для здоровья как теплокровных и человека (пищеварительная система у них устроена иначе, чем у насекомых), так и для окружающей среды (высокая специфичность действия, быстро разрушаются под действием ультрафиолета, не способны накапливаться в растениях и почве, легко смываются с листьев). Однако, Bt-препараты способны защищать растения только очень короткое время и поэтому слабоэффективны. Эта проблема была решена с помощью получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям. 369 Ген, кодирующий синтез Bt-протеина, был выделен из генома В. thurengiensis и в ряде случаев существенно модифицирован. Затем соединен с необходимыми регуляторными элементами и с помощью векторов встроен в различные виды сельскохозяйственных растений. Чаще всего используют выделенные из разных штаммов В. thurengiensis Bt-гены cryIA(b) для кукурузы, cryIIIA для картофеля, cryIA(с) для хлопчатника. При создании устойчивых к насекомым- вредителям сельскохозяйственных сортов генетики использовали не вирусные, а растительные промоторы. Так, в Bt-кукурузе использован промотор гена фосфоенолпируваткарбоксилазы самой же кукурузы, который обеспечивает экспрессию Bt-генов исключительно в зеленых тканях растений (листьях, стеблях). Именно благодаря этому Bt- протеина нет в зрелом зерне и силосе. Для создания Bt-картофеля использован промотор фермента рибулозо-1-5- бифосфаткарбоксилазы из растения арабидопсиса. Bt-ген, регулируемый этим фоточувствительным промотором, работает на свету в тысячу раз сильнее, чем в темноте, поэтому в клубнях Bt- протеина образуется в 100 раз меньше, чем в листьях. Эти данные свидетельствуют, что созданные трансгенные сорта картофеля и кукурузы не содержат в своем урожае продуктов привнесенного бактериального гена и соответственно, безопасны для человека и животных. 4 Перспективы использования трансгенных растений. Скорость, с которой генно-инженерная биотехнология осваивает новые рубежи, потрясает. Ученые настроены чрезвычайно оптимистично. Вдохновенно обсуждают и реализуют планы применения генной инженерии для получения чудо-растений. В настоящее время уже получены трансгенные формы томатов (более 260), сои (более 200), хлопчатника (более 150), тыквенных растений (более 80), табака (более 80), а также пшеницы, риса, подсолнечника, огурцов, салата, яблонь и других (более 70). Большинство созданных трансгенных растений (или растений первого поколения) содержат гены устойчивости к насекомым-вредителям и гербицидам. В последнее время разрабатывается проект введения в зерновые культуры группы генов nif из бактерий, способных усваивать атмосферный азот. Это позволит избавиться от необходимости вносить в почву азотные удобрения. Однако, встраивать в зерновые необходимо целый комплекс по-крайней мере из 17 бактериальных генов. Кроме того, нужно заставить «работать» все эти гены в чужеродном для них геноме (например, пшеницы), что существенно усложняет задачу. 370 Одним из перспективных направлений генной инженерии является создание растений-биореакторов, способных продуцировать белки, необходимые в медицине, фармакологии и др. К достоинствам растений-биореакторов относится отсутствие необходимости в кормлении и содержании, относительная простота создания и размножения, высокая продуктивность. Кроме того, чужеродные белки не вызывают иммунных реакций у растений, чего трудно добиться у животных. Получение лактоферрина из молока крупного рогатого скота, вследствие его низкого содержания, приводит к высокой стоимости препарата. При введении кДНК гена лактоферрина в клетки табака получен ряд каллусных тканей, синтезирующих укороченный лактоферрин, антибактериальные свойства которого были значительно сильнее антибактериальных свойств нативного лактоферрина. Концентрация этого укороченного лактоферрина в клетках табака составляла 0,6-2,5%. Одним из новейших направлений, в котором успешно используются трансгенные растения, является фиторемедиация – очистка почв и грунтовых вод от тяжелых металлов, радионуклидов и других загрязнителей. Собственно фиторемедиация перспективна в основном для очистки почвы и воды от тяжелых металлов, но различные вредные органические соединения разлагают в основном не растения, а микроорганизмы, обитающие в их ризосфере. Разложение органических соединений у бактерий чаще всего контролируют D-плазмиды или плазмиды деградации. Они разлагают такие соединения, как салицилат, нафталин, камфора, октан, толуол, ксилол, бифенил и т.д. D-плазмиды могут контролировать как начальные этапы разрушения органического соединения, так и полное его разложение. Устойчивые к ртути бактерии экспрессируют ген mer A, кодирующий белок переноса и детоксикации ртути. Модифицированную конструкцию гена mer А использовали для трансформации табака, рапса, тополя, арабидопсиса. В гидропонной культуре растения с этим геном извлекали из водной среды до 80% ионов ртути. При этом рост и метаболизм трансгенных растений не подавлялись. Устойчивость к ртути передавалась в семенных поколениях. При интродукции трех модифицированных конструкций гена mer А в тюльпанное дерево (Liriodendron tulipifera) растения одной из полученных линий характеризовались быстрым темпом роста в присутствии опасных для контрольных растений концентраций 371 хлорида ртути. Растения этой линии поглощали и превращали ртуть в менее токсичную элементарную форму и испаряли до 10 раз больше ионной ртути, чем контрольные. В ходе проведенных исследований было показано, что небольшие белки млекопитающих – металлотионины, способные связывать тяжелые металлы, хорошо функционируют в растениях. Исследователи получили трансгенные растения с встроенными генами металлотионинов (hMTI) и установили, что эти растения были более устойчивыми к кадмию, чем контрольные. Трансгенные растения с hМТII геном млекопитающих имели на 60-70% ниже концентрацию кадмия в стеблях по сравнению с контролем. В другом успешном эксперименте симбиотическому азотфиксатору люцерны Rhizobium meliloti был встроен ряд генов, осуществляющих разложение бензина, толуина и ксилена. Следует подчеркнуть, что глубокая корневая система люцерны позволяет очищать почву, загрязненную нефтепродуктами, на глубину до 2-2.5 метров. По данным Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР), потенциальный рынок биоремедиации составляет более 75 млрд долл. Ускоренное внедрение биотехнологий для защиты окружающей среды вызвано, в частности, тем, что они гораздо дешевле других технологий очистки. Ключевые слова и понятия тотипотентность Agrobacteria tumefaciens Ti-плазмиды Т-область vir-область антисмысловая конструкция ген амилозы омега-десатураза фитопатогены хитиназы, глюконазы опины Ri-плазмиды электропорация упаковка в липосомы биологическая баллистика проламины, глиадины, гордеины, зеины, легумины полигалактуруназа феномен «замолкания» промотор 35S мутация мишени фермент EPSPS транзитный пептид Bt-протеин гены cry гены nif фиторемедиация металлотионины 372 ЛЕКЦИЯ 27. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ Одной из проблем, с которой столкнулась генетическая инженерия, является настороженное, а иногда и негативное отношение значительной части населения к трансгенным организмам 373 и продуктам из них. Этому способствует появление в средствах массовой информации публикаций, в которых утверждается, что трансгенная продукция вредна для человека, поскольку она может быть токсичной или содержать аллергены, а сами трансгенные растения несут угрозу для экологии и т. п. Потенциальный риск, связанный с выращиванием генетически модифицированных растений, может проявиться, во-первых, в экологических последствиях их выращивания и, во-вторых, в качестве трансгенных продуктов. В отношении продуктов питания, получаемых на основе трансгенных растений, вызывает беспокойство возможный повышенный уровень в них токсических веществ, изменение содержания питательных веществ в худшую сторону, появление новых аллергенов. К настоящему времени на рынок выпущено значительное количество генно-инженерных продуктов. Однако каких-либо новых неожиданных, научно доказанных рисков пока никем не установлено. Уже с появлением первых сконструированных рекомбинантных молекул ДНК ученые и общественность потребовали разработать самые жесткие меры безопасности по использованию ДНК- технологий в практических целях. Такие инструктивные материалы и законодательные акты сейчас разработаны во всех странах, где ведутся генно-инженерные исследования и создаются трансгенные сорта растений. Еще на стадии создания генетически мо- дифицированных организмов осуществляется строгий контроль за тем, чтобы вносимый ген не синтезировал заведомо какой-либо токсичный или аллергенный компонент. После создания трансгенного растения, продуцируемые им продукты также изучаются в лабораторных условиях. Разработчик должен доказать, что в новом продукте содержание ранее известного токсичного компонента не превышает прежний уровень, что в нем отсутствуют новые вредные компоненты и что питательные качества продукта не снизились. Кроме того, при выпуске на рынок генетически модифицированные продукты, так же как и любые другие полученные химическим или иным способом (фармакологические препараты, пищевые красители, консерванты, сахарозаменители. удобрения, стимуляторы роста и т. д.), проверяются специальными службами. Они испытываются на токсичность, отсутствие канцерогенных эффектов и другие показатели. Поэтому трансгенная продукция, пройдя подобные испытания, становится не более опасной, чем любая другая. Что касается вредного влияния генети- чески измененных организмов на экологию, то здесь однозначного 374 ответа пока нет, и теоретически такая проблема существует. Может быть рассмотрено несколько аспектов возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду: - перенос трансгенов от культурных растений к их диким сородичам и их дальнейшее неконтролируемое распространение в живой природе; - передача сорнякам путем гибридизации устойчивости к гербицидам, что может привести к распространению гербицидоустойчивых сорняков; - выработка трансгенными растениями веществ, которые могут стать токсичными для организмов, не являющихся их мишенями, живущих на этих растениях или питающихся ими; - создание новых паразитов или усиление вредности уже существующих; - неконтролируемое распространение генов устойчивости к антибиотикам, которые используются в векторных конструкциях и вводятся в растения в качестве селективных маркеров для отбора трансформантов. Однако результаты специальных исследований и уже более чем 10-летний опыт работы с трансгенными растениями свидетельствуют об отсутствии убедительных данных о вредном влиянии трансгенных растений на окружающую среду и здоровье человека. Риск, связанный с ДНК-технологиями, аналогичен риску, связанному с немодифицированными организмами или модифицированными другими генетическими методами (получение отдаленных гибридов, мутантных форм и т.п.). Исследования показывают, что экологический риск при выращивании трансгенных растений можно сравнить с риском испытания новых обычных селекционных сортов. Все соединения, которые появляются в трансгенных растениях, как правило, уже существуют в природе. Существует определенный риск переноса генов гербицидоустойчивости в сорную растительность в процессе случайного скрещивания их с гербицидоустойчивыми трансгенными растениями. Однако уже давно известно, что при длительном использовании гербицида такие сорняки могут появляться и в обычных условиях. В этом случае просто используют другой гербицид, к которому данный сорняк был чувствителен. Не лишены основания и доводы в отношении других возможных негативных эффектов трансгенных растений на природу. В принципе возможен обмен генов между сконструированными растениями и родственными им культурными и дикими видами, что в отдаленном будущем может 375 сказаться на стабильности сложившихся экосистем. Сегодня из-за сравнительно короткого срока использования трансгенных растений мы не можем предсказать и вероятные другие отдаленные последствия, могущие негативно повлиять на окружающую среду. Поэтому, чтобы исключить неконтролируемое использование ГИ организмов, международные организации и отдельные страны разработали ряд документов, в том числе и законодательных, направленных на предупреждение или максимальное снижение возможных неблагоприятных экологических последствий и риска для здоровья человека от использования генно-инженерных биотехнологий. Согласно Конвенции о биологическом разнообразии, принятой в 1992 году в Рио-де-Жанейро, каждая страна, подписавшая Конвенцию, должна принимать меры в области использования биологических ресурсов с тем, чтобы свести к минимуму неблагоприятное воздействие на окружающую среду. В рамках Конвенции разработан международный протокол по биобезопасности (Картахенский протокол, 2000 год). Страны Западной Европы, большинство стран Восточной Европы и стран СНГ уже разработали и приняли для исполнения соответствующие законодательные акты по биобезопасности, разрабатываются национальные системы биобезопасности. В 2002 году Республика Беларусь приняла Закон о присоединении к Картахенскому протоколу, что обязывает нашу страну придерживаться положений и рекомендаций по биобезопасности, сформулированных в Протоколе. Для осуществления координации действий с международными организациями по проблемам биобезопасности Постановлением Со- вета Министров Республики Беларусь еще в 1998 году при Институте генетики и цитологии НАН Беларуси создан Национальный координационный центр биобезопасности. Ведется работа по созданию нормативной базы по биобезопасности. Подготовлен и находится на рассмотрении в парламенте проект Закона Республики Беларусь «О безопасности генно-инженерной деятельности». В нем сформулированы основные принципы биобезопасности работы с генетически модифицированными растениями и продуктами, созданными на их основе. Определены организационно-правовые основы государственного регулирования, полномочия республиканских орга- нов государственного управления, порядок государственной экспертизы безопасности генетически модифицированных растений, 376 их регистрации, высвобождения в окружающую среду, трансграничное перемещение, осуществление контроля и другие вопросы. Все эти меры будут способствовать минимизации возможных вредных последствий от использования генно-инженерных биотехнологий, без которых человечество в 21 веке уже никак не сможет обойтись. 377 4 ТЕМАТИКА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ Занятие 1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ Цель занятия: Дать представление об объектах биотехнологии, субстратах для их культивирования, ознакомиться с методами селекции биологических объектов, рассмотреть перспективы развития биотехнологии. 1 Микроорганизмы как основные объекты биотехнологии. 2 Селекция биотехнологических объектов. 3 Субстраты для культивирования биообъектов. 4 Сырьевые материалы и перспективы биотехнологии. |