Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
гена в клетки- мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Для введения терапевтического гена в клетки пациента используют специальные векторы. Проблема доставки гена значительно усложняется в тех случаях, когда необходимо перенести большой ген (векторы имеют ограниченную емкость), особенно в клеточное ядро. Правильное внесение гена обеспечивает его функционирование в течение всей жизни человека и полное излечение пациента от соответствующего заболевания. В качестве клеток-мишеней чаще всего используются лимфоциты, клетки костного мозга, солидных опухолей, печени, легких, сердца, скелетных мышц и др. Прямая инъекция генетического материала – самый простой метод доставки трансгена в клетки in vivo, при котором ДНК вводится непосредственно в ткань путем инъекции. Область использования данного метода ограничена такими тканями, как кожа, тимус и поперечно-полосатые мышцы, некоторыми так называемыми 351 солидными опухолями. Американскими исследователями успешно осуществлено введение векторной конструкции, несущей ген фактора свертываемости крови больным гемофилией А. Результаты клинических исследований свидетельствуют, что такое «генное» лечение предупреждает возникновение кровотечений и пациенты с гемофилией А более года не испытывают необходимости в инъекциях фактора. Сейчас на проведение курсов заместительной терапии для одного больного гемофилией А затрачивается 100000 $ в год. Считается, что новый метод позволит пациентам обходиться без дорогостоящих инъекций 5-10 лет. Введение генетического материала внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфецируемый орган, применяется в первую очередь для лечения болезней печени, почек и мочевыводящих путей. Аэрозольное введение генетического материала в дыхательные пути используется при заболевании легких. Разрабатывают также методы коррекции дефектных генов (при мутациях, изменяющих небольшой участок ДНК), замены дефектного гена нормальным, методы усиления экспрессии нормального гена, восстановления экспрессии блокированного гена или методы блокады экспрессии болезнетворного гена. С точки зрения генной терапии самыми простыми заболеваниями являются моногенные, которые требуют работы с одним геном. Например, серповидноклеточная анемия, гемофилия, мышечная дистрофия Дюшена. Имеются данные о разработке экспериментальных подходов и проведения клинических испытаний методов генной терапии почти 30 моногенных заболеваний человека. Более сложными являются исследования в направлении ряда приобретенных заболеваний, развитие которых обусловлено комплексным взаимодействием генов с факторами окружающей среды— диабета, остеопороза, ревматоидного артрита, рака. Результаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнадеживающими, в особенности при лечении нейродегенеративных и онкологических заболеваний нервной системы. В настоящее время наибольшее распространение получила генная терапия опухолевых заболеваний, по-видимому, из-за огромного множества раковых заболеваний в мире. С другой стороны в отношении тяжелых, часто безнадежных раковых больных утрачивает своё значение отдаленный риск генетических повреждений. 352 Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась генотерапия, не только предлагает пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем. Ключевые слова и понятия суррогатная мать ген β-лактоглобулина трансген трансгенные организмы метод микроинъекции ДНК пронуклеус эмбриональные стволовые клетки бластоциста клетки-мишени животные-биореакторы лактоферин модификация промотора ген α-1-антитрипсина эмфизема легких ген химозина генная терапия аденозиндезаминаза (ADA) Т-лимфоциы гемофилия А проурокиназа моногенный признак моногенные заболевания 353 ЛЕКЦИЯ 25. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ПРОИЗВОДСТВЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ПРЕПАРАТОВ 1 Производство гормонов человека генно-инженерными методами. 2 Получение антибиотиков на основе генно-инженерных технологий. 3 Получение новых вакцин. 1 Производство гормонов человека генно-инженерными методами. Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечнососудистых заболеваний и рака. Инсулин — небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепо- чечного предшественника — препроинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С- пептида образуется инсулин. Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжелая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибе- лью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удается справляться с помощью соответствующих диет и режима. Работы по генно-инженерному получению инсулина начались более 20 лет назад. В 1978г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. coli (рис. 41). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3'-концу гена фермента β- галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. 354 coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента β-галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. Рис. 41. Схема синтеза инсулина, с помощью трансформированной бактерии E. coli. В 1981г. синтезирован ген-аналог проинсулина — мини-С-про- инсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из шести аминокислот: арг-арг-гли-сер-лиз-арг и показана его экспрессия в Е. coli. В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли β-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обрат- ной транскриптазы получили с нее кДНК. Полученную кДНК встрои- ли в плазмиду pBR322 Е. coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре про- инсулина. В результате трансляции мРНК в клетках синтезировался 355 гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который выщепляли из такого белка трипсином. Соматотропин (гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию — карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Ранее его получали из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. В настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках Е. coli, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на H 2 N-концe молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979г. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, с фен до лей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATГ-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г. после серьезных клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина. Огромный интерес представляют выделение и синтез полипептида, обладающего полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток сома- тотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клет- ках, очень важно для успешного лечения заболеваний, обусловленных недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др. 2 Получение антибиотиков на основе генно-инженерных технологий. Продуктивность пенициллина у первого лабораторного штамма Penicillium chrisogenum составляла только 2 мг препарата на 1 л культуры и была явно недостаточной для промышленного 356 производства антибиотика. Направленными воздействиями мутагенами, в сочетании с отбором наилучших продуцентов, удалось увеличить продуктивность гриба в 10 000 раз и довести концентрацию пенициллина в культуре до 2%. Путь повышения эффективности штаммов-продуцен-тов антибиотиков, основанный на получении мутаций, несмотря на колоссальные затраты труда, используется до настоящего времени. Кроме того, получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только 1-2%, которые имеют терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. В этом отношении большие надежды возлагаются на технологии рекомбинантных ДНК. Во-первых, с их помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы с минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генно-инженер-ные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства. Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из десятков ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза – задача не из легких. Однако, с помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из P. chrysogenum гена синтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию 5 -( L-а- аминоадипил)- L - цистеинил- D -валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов. Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генно-инженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Одна из плазмид Streptomyces, pIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетатаантибиотика актинородина. Эту плазмиду вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезирующий родственный антибиотик медермицин, либо в штаммы В1140 или Tu22 S. violaceoruber, синтезирующие также родственные антибиотики гранатицин и 357 дигидрогранатицин. Каждый из 4-х антибиотиков формирует разный рН и соответнно цвет культуральной среды. Появление характерной окраски после трансформации штаммов АМ-7161, B1140 и Тu22 плазмидой, несущей гены, кодирующие ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе в данных штаммах этого антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S. violaceoruber, содержащие плазмиду рIJ2ЗОЗ , синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и своей хромосомной ДНК. Однако, при трансформации штамма Тu22 S. violaceoruber плазмидой pIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик – дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. плазмидой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик – медерродин А. Эти новые антибиотики вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути. Детально изучив генетические и биохимические составляющие биосинтеза поликетидного (образуюшихся в результате ферментативной конденсации карбоновых кислот)антибиотика эритромицина в клетках Saccharopolyspora erythraea, удалось внести специфические изменения в гены, ассоциированные с биосинтезом этого антибиотика, и синтезировать производныеэритромицина с другими свойствами. Вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК S. erythraea длиной 56 т.п.н., содержащего кластер генов ery. Затем двумя разными способами модифицирована эритромицинполикетидсинтаза. Для этого либо удаляли участок ДНК, кодирующий бета-кеторедуктазу, либо вносили изменение в участок ДНК, кодирующий еноилредуктазу. Эти эксперименты показывают, что если идентифицировать и охарактеризовать кластер генов, кодирующих ферменты биосинтеза определенного поликетидного антибиотика, то, внося в них специфические изменения, можно будет направленно изменять его структуру. Кроме того, вырезая и соединяя те или иные участки ДНК, можно перемещать домены поликетидсинтазы и получать новые поликетидные антибиотики. С помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces sp. часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости 358 кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется, и выход антибиотика снижается. Используя методы генной инженерии, можно создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla sp. синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген «гемоглобина» Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1% всех клеточных белков S. coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки S. coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода, синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. 3 Получение новых вакцин. Развитие в последние десятилетия генно-инженерных технологий совершило революцию и в деле разработки и производства новых вакцин. При помощи методов молекулярной биологии и генети- ческой инженерии были идентифицированы антигенные детерми- нанты многих инфекционных агентов, клонированы гены, кодиру- ющие соответствующие белки и, в ряде случаев, налажено произ- водство вакцин на основе белковых субъединиц этих антигенов. Классическим примером рекомбинантной вакцины, полученной с помощью микроорганизмов, служит производство поверхностного антигена гепатита В. Вирусный ген HBsAg был встроен в дрожжевую плазмиду, в результате чего в дрожжах в больших количествах стал синтезироваться вирусный белок, который после очистки используется для инъекций в качестве эффективной вакцины против гепатита. Десять лет назад выдвинута концепция использования трансгенных растений для производства так называемых «съедобных» вакцин (edible vaccines). Действительно, если какой- либо съедобный орган растения будет синтезировать белок-антиген, обладающий сильными оральными иммуногенными свойствами, то при употреблении этих растений в пищу параллельно будет усваиваться и белок-антиген с выработкой соответствующих антител. 359 Получены растения табака, несущие ген, кодирующий антиген оболочки вируса гепатита В под растительным промотором. Наличиеантигена в листьях трансгенных растений подтверждено иммуноферментным анализом. Показано сходство физико- химического строения и иммунологических свойств образующегося рекомбинантного антигена и антигена сыворотки человека. Идентификация антител, продуцируемых в растениях, показала возможность сборки двух рекомбинантных генных продуктов в одну белковую молекулу, что невозможно в прокариотических клетках. Сборка антител происходила, когда обе цепи были синтезированы с сигнальной последовательностью. При этом, наряду с возможностью введения двух генов в одно растение, возможно также соединение индивидуальных полипептидных цепей, синтезируемых в разных трансгенных растениях, в полноценный белок при гибридизации этих двух растений. Возможно введение нескольких генов на одной плазмиде. Трансгенные растения-продуценты |