Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
5' 3' 5' Двухцепочечная ДНК 3' 5' 3' Цепи разделяют и получают препарат одной из них Т А Г Ц Одноцепочечная ДНК С помощью электрофореза в геле фрагменты разделяются по размеру; те из них. которые содержат радиоактивную метку, оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положению этих отпечатков можно определить, какое именно основание было разрушено при образовании каждого из радиоактивных фрагментов Радиоавтограф геля Т А Г Ц Последователь ность Т Т А Г А Ц Ц Ц Г А Т А А Г Ц Ц Ц Г Ц А Д л и н н ы е ф р аг м ен ты К о р о тк и е ф р аг м ен ты 320 образуются еще и фрагменты длинной 3 и 4 нуклеотида, но эти фраг- менты, расположенные между остатками Г, будут не меченными). Наборы меченых фрагментов, образующихся при каждой из четырёх реакций, подвергают электрофорезу в соседних дорожках полиакриламидного геля, при этом происходит разделение фрагментов ДНК в соответствии с их размерами. Затем проводят ра- диоавтографию геля. Набор полос, регистрируемых на рентгеновской плёнке, «читают», определяя, таким образом, нуклеотидную последовательность ДНК. Так в примере, представленном на рисунке стр. 164, после-довательность цепочки ДНК от меченого конца будет следующая: 5'-АЦГЦЦЦГААТАГЦЦЦАГАТТ-3'. Для анализа последовательностей ДНК широко используется также метод Сэнгера, основанный на использовании дидезокси нук- леотидов. На рис. 27 приведена радиоавтография полиакриламидного геля, полученного в результате секвенирования по методу Сэнгера небольшого фрагмента ДНК важного гена человека длиной 50 нуклеотидных пар. Исходя из электрофоретического спектра ДНК представленного на радиограмме (рис. 27) можно легко определить нуклеотидную последовательность данного фрагмента уже рассмотренным нами способом. Так, просеквенированный фрагмент ДНК важного гена человека будет иметь следующую последовательность своих 50 нуклеотидов: 5'-АТЦАГАТЦТГЦААЦТЦАТАТГАТЦГАГАГГ- ГАААТЦАТТЦТГТГААЦГ-3'. В последние годы вместо радиоактивных меток при анализе последовательностей ДНК используются флюоресцентное окрашивание. Флюоресцентные красители разного цвета применяются для каждого из четырёх нуклеотидов и четыре смеси электрофорезируются вместе. Флюоресцентный анализ позволяет определять последовательность ДНК автоматически, что даёт возможность прочитывать более 1000 нуклеотидных пар за одну операцию. Часто для анализа используется и митохондриальная ДНК. Известно, что она передаётся потомкам только с яйцеклеткой, т. е. наследуется по материнской линии. Рис. 27. Схема радиограммы сиквенса ДНК Г Т А Ц 321 Анализ нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК позволил установить истину в одной почти детективной истории. Долгие годы многие верили, что некая Анна Мэнехен является Анастасией, спасшейся от смерти дочерью русского царя Николая II и его жены Александры (рис. 28). Другие же считали Анну Мэнехен самозванкой. Однако однозначных объективных доказательств своей правоты ни та, ни другая сторона предоставить не могли. Ниже приведён фрагмент нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК ( мтДНК ) Анны Мэнехен, её племянника Карла Маучера, а также герцога Эдинбургского, который является племянником последней русской царицы Александры – матери Анастасии. Если бы Анна Мэнехен действительно была принцессой Анастасией, то её мтДНК была такой же, как у всех родственников последней русской царицы Александры, включая её племянника герцога Эдинбургского,и короткий фрагмент проанализированной мтДНК у неё был бы ТТЦЦТЦ. Но фрагмент её мтДНК имеет другой состав и полностью совпадает с мтДНК её истинного племянника Карла Маучера, все предки и родственники которого никогда не имели родственных связей с королевскими семьями Европы, в том числе с семьёй последнего русского царя Николая II. Следовательно, исходя из полученных молекулярно-генети- ческих данных по сиквенсу короткого фрагмента митохондриальной ДНК, можно однозначно утверждать, что Анна Мэнехен не являлась принцессой Анастасией. Фрагмент митохондриальн ой ДНК Анна Мэнехен Ц Ц Т Т Ц Т Карл Маучер (племянник Мэнехен) Ц Ц Т Т Ц Т герцог Эдинбургский (племянник Александры) Т Т Ц Ц Т Ц Рис. 28. Семья последнего российского императора Николая II. Царица Александра Фёдоровна вверху справа, Анастасия и Алексей сидят обнявшись. 322 Таким образом, в последние годы, разработанные технологии и методы генной дактилоскопии и секвенирования нуклеотидных последовательностей ДНК, рассмотренные выше, становятся широко доступными и с успехом применяются не только в молекулярной генетике и других биологических науках, но и в таких практических областях как криминалистика, медицина, санитарная эпидемиология. Ключевые слова и понятия минисателлитная ДНК повторяющаяся последова- методы секвенирования фрагмен- тов ДНК тельность минисателлитная цепочка тандемно повторяющиеся по- следовательности генная дактилоскопия гипервариабельные миниса- теллиты фингерпринт ДНК участки минисателлитной ДНК отличающиеся по длине метод определения последовательности ДНК элонгация ДНК ДНК-полимеразы секвенирование ДНК по Мак- самому-Гилберту препарат меченой ДНК набор меченых фрагментов «чтение» нуклеотидной последова- тельности ДНК 323 ЛЕКЦИЯ 22. АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) 1 Характеристика метода ПЦР и его основные стадии. 2 Использование ПЦР в диагностике наследственных заболеваний. 3 ПЦР и направленный сайт-специфический мутагенез. 1 Характеристика метода ПЦР и его основные стадии. Несмотря на то, что методы исследования наследственного материала (нуклеиновых кислот) все время совершенствовались, тем не менее, для анализа структуры ДНК требовалось определенное количество клеточного материала. Например, даже при использовании такого чувствительного метода, как фингерпринт, требуется наличие капли крови или другого эквивалентного количества образца животной или растительной ткани, содержащих в клетках достаточное для анализа количество копий ДНК. Ситуация радикально изменилась благодаря появлению метода, который был разработан Кэри Мюллисом. Этот метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР) и стал неотъемлемой процедурой, освоенной во всех генно-инженерных лабораториях мира. Использование ПЦР методики позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или её фрагмент in vitro увеличивая количество копий в миллионы раз за несколько часов. ПЦР осуществляют в пробирке с помощью специального термостабильного фермента ДНК-полимераза (Tag-полимеразы), набора всех четырех нуклеотидов А, Т, Г и Ц и коротких олигонуклеотидных затравок – праймеров. Праймеры – это короткие, длиной в 20-30 нуклеотидов, одноцепочечные фрагменты ДНК, комплементарные 3’-концевым последовательностям 324 копируемой ДНК-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент ДНК, который будет скопирован Tag-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3’-концам праймеров и достраивающие их до заданной длины. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) протекает в три стадии (рис. 29). 1. Денатурация. Инкубационную смесь, в которой содержится образец нужной ДНК, нагревают до температуры 90 С. При этом, в течении 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы образуется две одноцепочечные. 2. Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50 С. При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами. Эта стадия обычно протекает 30 секунд. 3. Полимеризация. Инкубационную смесь нагревают до температуры 70С. При этой температуре Tag-полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Этот процесс протекает в течении 90 секунд. В результате количество ДНК удваивается. Фермент Tag-полимераза была выделена из термофильных бактерий Thermus aquaticus, и отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70С гибрид праймер-ДНК не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью. За 20 циклов амплификации количество копий ДНК достигает величины 10 6 В последние годы удалось создать специальный прибор– Рис. 29. Последовательные стадии одного цикла амплификации (размножения) фрагмента ДНК с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Денатурация Гибридизация Полимеризация 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 90 o С 50 o С 70 o С 5’ 3’ t=15c. t=30c. t=90c. 325 амплификатор, с помощью которого все три стадии размножения ДНК производятся автоматически, что превратило процесс ПЦР- амплификации конкретной последовательности ДНК в простую задачу. За разработку метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1993г. Кэри Мюллис (K. Mullis) был удостоен звания лауреата Нобелевской премии. ПЦР технологии позволили ученым без огромных временных и материальных затрат получать точные данные по структуре генов и фрагментов ДНК при наличии самого минимального количества биологического материала. Одним из важнейших применений ПЦР стала диагностика наследственных заболеваний человека, особенно на пренатальных стадиях развития при наличии малого количества ДНК из фетальных клеток. Вторым, не менее важным применением ПЦР технологий стала дактилоскопия и идентификация индивидуумов, используя материал ДНК, полученный из нескольких сперматозоидов, или одного волоса и, в некоторых случаях, даже из одного бластомера, выделенного из зародыша (пре-эмбриона) на стадии восьми зародышевых клеток. 2 Использование ПЦР в диагностике наследственных заболеваний. Наследственная болезнь Тея-Сакса является аутосомно-рецессив- ным заболеванием, которое характеризуется недостаточностью лизо- сомального фермента гексозаминидазы-А. В результате чего в нейро- нах накапливается ганглиозид G M2 . Симптомы заболевания начинают проявляться в возрасте 5 месяцев. В терминальной стадии болезни, которая развивается к 3-4 годам, наступает полная обездвиженность, глухота, слепота, трофические нарушения, декортикация и наступает смерть. В молодой американской семье первый ребенок (девочка) оказался с заболеванием Тея-Сакса и умер в возрасте 4 лет. Супруги естественно хотели бы иметь здорового ребенка. Проведение молекулярно-генетической диагностики заболевания на эмбриональной стадии путем амниоцитоза для этой семьи не приемлемо по религиозным причинам. Поскольку, если эмбрион окажется вновь с мутантными аллелями, несущими заболевание, супруги не смогут пойти на прерывание беременности, следуя религиозным канонам. 326 Рис. 30. Фотография процесса извлечения одного бластомера из восьмиклеточного эмбриона Не смотря на все вышеизложенное благодаря достижениям современной генетики, выход был найден. Для этого на первом этапе необходимо у жены взять несколько яйцеклеток и оплодотворить спермой мужа. На стадии развития восьми бластомеров из каждого пре- эмбриона можно безболез- ненно изъять для анализа по одному бластомеру. Фотография процесса из- влечения одного бластомера (клетки) из восьмиклеточного эмбриона представлена на рисунке 30. После изъятия из каждого бластомера, на основе метода ПЦР необходимо получить достаточное для анализа количество ДНК и провести Саузерн-блот анализ полученной ДНК с использованием специального ДНК-зонда. По электрофоретическим спектрам ДНК после Саузерн-блот ана- лиза легко установить, имеется ли дефектный ген заболевания Тея- Сакса в гомозиготном и гетерозиготном состоянии в конкретном восьмиклеточном эмбрионе, или этот эмбрион является нормальной гомозиготой. Такие не несущие мутантных алелей эмбрионы и необ- ходимо в первую очередь оставлять для имплантации и дальнейшего эмбрионального развития. В тоже время половина эмбрионов ока- жутся гетерозиготными, и у них также заболевание Тея-Сакса будет отсутствовать и в случае необходимости их можно использовать для имплантации. Выше названная религиозная американская семья, оба супруга в которой являются гетерозиготными носителями заболевания Тея- Сакса успешно прошли все этапы от зачатия в пробирке in vitro и молекулярно-генетического теста до рождения здорового ребенка. Сейчас их дочери Бритни 8 лет и родители счастливы. Миотоническая дистрофия (МD) характеризуется прогресси- рующей дегенерацией мышц на взрослых стадиях и наследуется по доминантно-аутосомному типу. Этот ген содержит район так назы- ваемых расширяющихся (expansed) тринуклеотидных повторов ЦТГ. Нормальные аллели гена МD содержат от 5 до 30 копий ЦТГ, тогда как мутантные от 50 до 2000 копий. Поскольку в настоящее время известна вся последовательность гена миотонической дистрофии (МD) то можно синтезировать олиго- 327 нуклеотидные праймеры, комплементарные обеим цепочкам фраг- мента ДНК в гене МD и размножить этот фрагмент методом ПЦР. Праймер 1 должен быть комплементарным району нижней (3'-5') це- почки, несущей последовательность ГАЦ, а праймер 2 должен быть комплементарен району верхней (5'-3') цепочки ДНК, несущей ЦТГ. После амплификации размер фрагмента ДНК содержащего ЦТГ по- вторы определяется электрофорезом. Количество тринуклеотидных повторов ЦТГ легко установить включением в гель в качестве марке- ров последовательности ДНК с известным количеством повторов ЦТГ. Все этапы тестирования заболевания миотонической дистрофии по гену МD с использованием методов ПЦР и электрофореза схема- тически представлены ниже на рисунке 31 . Если менее чем 30 копий ЦТГ повтора присутствует в каждой хромосоме, это означает, что ребенок, фетус или бластомер из восьмиклеточного пре-эмбриона является гомозиготным по нормальному МD аллелю (см. Рис. 26, образец 3 на электрофореграмме) или гетерозиготным по двум нормальным аллелям (Рис. 23, образцы 2, 4). Если более чем 50 копий ЦТГ повтора несет каждая гомологичная хромосома, то ребенок, фетус или пре-эмбрион является гомозиготным по доминантному мутантному аллелю МD (образец 5) или гететозиготным по различным мутантным аллелям (образец 8). Если одна хромосома содержит менее чем 30 копий ЦТГ повтора, а другая гомологичная хромосома содержит более чем 50 копий, то новорожденный, фетус или пре-эмбрион являются гетерозиготами несущими один нормальный, а другой мутантный аллели гена МD (образцы 6, 7). 328 3 ПЦР и направленный сайт-специфический мутагенез. Киназы являются переносчиками фосфатных групп от молекулы АТФ к субстрату. В ходе изучения функциональных свойств активного центра одной из киназ понадобилось дезактивировать данный фермент. Ключевой аминокислотой входящей в субстратный карман связывания киназы с АТФ является положительно заряженная аминокислота лизин. Предполагается, что если ее заменить на другую аминокислоту, то связывание с АТФ нарушится и фермент перестанет работать. Последовате льность к-ДНК длиной в 1.5 кb кодирующая белок R-киназу была встроена в плазмиду pUC18 Рис. 31. Этапы тестирования района тринуклеотидных повторов ЦТГ в гене МD, ответственном за заболевание миотоническая дистрофия с использованием метода ПЦР и электрофореза. Образцы 1, 9 – маркеры с 20 и 50 повторами ЦТГ, образцы 2-4 – члены семьи с нормальными аллелями гена МD, 5-8 – образцы несущие мутантные аллели гена МD. ЦТГ ГАЦ n Геномная ДНК Праймер 2 Праймер 1 Амплификация тандемных повторов ЦТГ Определение числа повторов ЦТГ электрофорезом Электрофореграмм а ДНК Мутантные МD аллели 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Нормальные МD аллели 50 ЦТГ повторов 25 ЦТГ повторов 3' 3' 5' 5' pUC18 2.7 kb 1.2 kb HindIII EcoRI Bam 0.3 kb лиз Рис. 32. Схема генетического конструкта с рестриктазной картой R-киназ-ного гена в плазмиде с указанием местоположения триплета, кодирующего аминокислоту лизин, которая располагается в 5'-ААГЦТТАТГАЦТЦАТГТГЦЦТ…….ЦЦТГТТТТААААЦГГАТЦЦТТГ……..-3' 329 по сайтам рестрикции HindIII и EcoRI. Схема генетического конструкта с рестриктазной картой киназного гена в плазмиде с указанием местоположения триплета, кодирующего аминокислоту лизин, которая располагается в субстратном кармане киназы представлена на рисунке 32. Там же приведена последовательность нуклеотидов, расположенная в начале и в активном центре данного гена. Заменить одну аминокислоту на другую в белке R-киназа можно путем направленного введения точковой мутации в праймер, с последующим проведением ПЦР. Так как надо заменить положительно заряженную аминокислоту лизин, кодируемую триплетом ААА, на другую аминокислоту, то нам достаточно будет заменить один из трех А на другой нуклеотид и использовать вместо ААА триплет ААТ, что приведет к замене лизина на аспарагин или ГАА, что заменит лизин на отрицательно заряженный глютомат. Так как в нашем случае триплет лизина лежит непосредственно перед сайтом рестрикции BamI можно при помощи ПЦР амплифицировать часть гена R-киназы длинной 1.2 кb от сайта HindIII до BamI. При этом, включив при конструкции праймеров сайты рестрикции для HindIII и BamI мы сможем в дальнейшем по этим сайтам проводить клонирование амплифицированного участка гена R-киназы. Для удобства конструирования нужных праймеров достроим вторую цепочку для участка гена R-киназы 5'-ААГЦТТАТГАЦТЦАТГТГЦЦТ….ЦЦТГТТТТА |