Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
гене дистрофина разделены интронами. Мутации в этом гене вызывают развитие мышечной дистрофии. В ряде генов человека обнаружено 30, 40 и даже 50 интронов. В целом доля ДНК, кодирующая белки в геноме человека составляет только Рис. 36. РНК сплайсинг на примере человеческого гена дистрофина. Несмотря на то, что размер гена составляет 2500 килобаз, после процесса сплайсинга размер мРНК изменяется до 14 килобаз, так как более чем 80 интронов удаляются из 340 5%. По крайней мере 50% генома приходится на транспозон подобные области ДНК представленные семейством Alu и L1- повторов. 5 Минимальный геном необходимый для жизни. Какое минимальное количество генов необходимо для того, чтобы организм был жизнеспособным? Абсолютно точно на этот вопрос ответить пока нельзя, так как еще не все функции генов, обнаруженных в геномах, известны. Тем не менее, основываясь на информации, полученной для генов с известной функцией, можно предположить, какое минимальное число генов необходимо для выполнения основных клеточных функций. Очевидно, что клетки должны содержать гены, кодирующие продукты, необходимые для репликации и репарации ДНК, для транскрипции и трансляции, транспорта белков и выполнения общих клеточных процессов, включая деление клеток и секрецию, а также для множества биохимических реакций, вовлеченных в клеточный метаболизм. В таблице 6 приведена итоговая информация о функциях генов трех видов бактерий. Если сравнить число необходимых для жизнедеятельности генов у различных бактерий, то видно, что E. coli имеет 131 ген для метаболизма аминокислот, H. influenza – 68, а M. gentialum – только 1. Несмотря на то, что общее количество генов у H. influenza почти в 4 раза больше, чем у M. gentialum, физиологические способности у этих ви- Таблица 6. Функциональные классы генов в трех видах бактерий. Функциональный класс E. coli H. influenza M. gentialum Гены, кодирующие белки 4288 1727 470 Репликация и репарация ДНК 115 87 32 Транскрипция 55 27 12 Трансляция 182 141 101 Регуляторные белки 178 64 7 Биосинтез аминокислот 131 68 1 Биосинтез нуклеиновых кислот 58 53 19 Обмен липидов 48 25 6 Энергетический обмен 243 112 31 Распознавание, транспорт белков 427 343 123 дов очень сходны. Большая часть генов H. influenza входит в категорию необходимых для биосинтеза. Эта более сложная бактерия имеет 68 генов, необходимых для биосинтеза аминокислот, в то время 341 как микоплазма – только 1 такой ген. Обладая очень низкой способностью к биосинтезу аминокислот, микоплазмы должны использовать ряд метаболических продуктов клеток хозяина. В целом результаты проведенного сравнительного анализа двух микоплазм - M. gentialum и M. pneumoniae и некоторые эксперименты по мутагенезу у M. gentialum указывают на то, что необходимых для жизнедеятельности организма генов должно быть не менее 250-350. Ключевые слова и понятия геномные библиотеки геномика преимущественный кодон плотность генов метод «клон за клоном» метод дробовика генетические карты гетерохроматиновые районы размер генома человека открытая рамка считывания интрон экзон инициирующий кодон терминирующий кодон транспозон размеры геномов прокариот полицистронная транскипционная единица промотор регулятор оперон ДНК-повторы ген дистрофина минимальный геном 342 ЛЕКЦИЯ 24. УСПЕХИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА ЖИВОТНЫХ 1 Основные этапы получения трансгенных животных. 2 Получение трансгенных животных с необходимыми признаками. 3 Генная терапия. Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и другие. Организмы, несущие в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, — трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества. 1 Основные этапы получения трансгенных животных. Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов: приготовление фрагмента ДНК, содержащего конкретный ген, для микроинъекции; получение оплодотворенных яйцеклеток (эмбрионов) млекопитающих; микроинъекция ДНК с помощью микропипетки в ядро (пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки млекопитающего (см. рис. 37, представленный ниже); пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку суррогатной матери; анализ экспрессии трансгена на уровне транскрипции и 343 трансляции у родившихся потомков. Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, которые помимо клеток, содержащих трансген, имеют еще и нетрансгенные клетки. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50%. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. Этапы получения трансгенных мышей от введения фрагмента ДНК , содержащего несколько копий нужного гена ( SRY ) в пронуклеус 344 оплодотворенной яйцеклетки мыши с помощью микропипетки до получения взрослых особей, несущих чужеродную ДНК в каждом клеточном ядре представлены на рис. 37. В результате проведения этого эксперимента было показано, что именно ген SRY кодирует у мышей тестес детерминирующий фактор (TDF). У всех трансгенных самок с кариотипом ХХ половые органы под действием тестес детерминирующего фактора были мужского типа, включая четко выраженный пенис. Наличие гена SRY у трансгенных самок, Рис. 37. Этапы получения трансгенных млекопитающих от введения фрагмента ДНК, содержащего нужный ген (SRY) в пронуклеус зиготы мыши с помощью микропипетки до получения взрослых особей, несущих чужеродную ДНК в 345 полученных в данном эксперименте, было подтверждено Саузерн- блот анализом. Метод микроинъекции ДНК в оплодотворенные яйцеклетки с 82-го года до настоящего времени остается наиболее популярным у исследователей, занятых получением трансгенных животных, несмотря на то, что он требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования. И это понятно, поскольку быстрота и надежность данного метода окупают все его недостатки. В последние годы при создании трансгенных животных используют также эмбриональные стволовые клетки (ЕС-клетки), взятые из бластоцисты. ЕС-клетки можно культивировать in vitro, вводить в них с помощью трансдукции или ретровирусных векторов целевые трансгены и после трансформации инъецировать их в бластоцисту. Практическое достоинство этого методического подхода состоит в том, что он дает возможность проводить селекцию Рис. 38. Получение трансгенных мышей при помощи технологии эмбриональных стволовых клеток. (а) Эмбриональные клетки (ES) выделенные ранее из эмбриона и культивируемые in vitro. Трансген вставленный в ES клетки во время роста на селективной среде. (б) ES клетки, содержащие трансген инъецируют к ES клеткам другого эмбриона, которые объединятся в клеточную массу. Полученный эмбрион имплантируется в суррогатную мать и химерная трансгенная мышь получена. (в) В результате скрещивания химерной и нормальной мыши некоторая часть потомства будет гетерозиготной трансгенной. (г) При скрещивании химерных особей 346 трансформированных ЕС-клеток по конкретному параметру. Это может быть число копий трансгена, его хромосомная локализация или характер экспрессии. Все полученные данным методом трансгенные животные – мозаики. Поэтому для получения чистых трансгенных мышей нужны дальнейшие скрещивания и отбор. Главные стадии получения трансгенных мышей при помощи технологии эмбриональных стволовых клеток представлены на рис. 38. 2 Получение трансгенных животных с необходимыми признаками. Одна из важнейших задач сельскохозяйственной биотехнологии — выведение трансгенных животных с улучшенной продуктивностью и более высоким качеством продукции, резистентностью к болезням, а также создание так называемых животных-биореакторов — продуцентов ценных биологически активных веществ. С генети- ческой точки зрения особый интерес представляют гены, коди- рующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг-фактор гормона роста (РФ) и инсулинподобный фактор ГР (ИФГР). В конце 70-х годов XX в. ген гормона роста крупного рогатого скота был интегрирован в геном E. сoli. Было показано, что ГР, выделенный из E. сoli, оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животных, как и гипофизарный ГР. Гормон роста, полученный с помощью методов генетической инженерии, при крупномасштабном применении вызывал увеличение удоев на 23- 31% при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увеличить суточные привесы на 20-30% при значительном сокращении расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьшалось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопродуктов. Первые трансгенные мыши со встроенным геном ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Получены также впечатляющие результаты на европейском лососе. Особи лосося (Salmo salmo) со встроенным геном ГР достигают товарного веса в 2 раза быстрее, чем обычные. Основные этапы получения трансгенных лососей представлены на рис. 39. Рассматривается возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания животных, у которых присутствует специфический 347 промотор, соединенный с геном фермента β-галактозидазы, катализирующего распад лактозы. Молоко таких животных, не содержащее лактозы, могут использовать люди, у которых не синтезируется β-галактозидаза. Ведутся работы по созданию трансгенных животных, способных вырабатывать антитела, предотвращающие маститы. Довольно часто для производства трансгенных медицинских препаратов используют культуру клеток животных. На этой основе разработано производство так называемого фактора свертываемости VIII в крови человека. Это позволило успешно решить проблему лечения больных гемофилией. Ранее белок фактор VIII выделяли только из крови доноров, что было связано с риском заражения пациентов вирусным гепатитом. Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами и клеточными системами. Они легко Рис. 39. Схема получения трансгенных лососей со встроенным геном гормона роста. Трансгенные особи на 20% крупнее обычных и в 2 раза быстрее достигают товарной массы. 348 размножаются, содержание их сравнительно дешево, что делает таких животных хорошими продуцентами разнообразных белков с низкой стоимостью. Важно, что новые белки, получаемые в линиях клеток трансгенных животных, могут быть модифицированы. Для молочного производства представляет большой интерес получение целенаправленной экспрессии трансгенов в эпителиальных клетках молочной железы с целью выхода новых белков с молоком. Один из ключевых моментов получения трансгенных животных, продуцирующих трансгенный белок с молоком — модификация промотора, направляющего экспрессию структурных генов в секреторный эпителий молочной железы. На рис. 40 приведены основные этапы получения трансгенных коз методом инъекции генных конструкций в зиготу. Еще в начале 90-х годов американскими учеными разработан метод микроинъекции ДНК, позволяющий встраивать ген β-лакто- глобулина, который способен экспрессироваться только в молочных железах животных. В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном α-1-антитрипсина человека и β- Рис. 40. Этапы получения трансгенных животных методом инъекции генных конструкций в зиготу: 1 – получение зигот для инъецирования (используется индуцированная гормональными инъекциями суперовуляция или оплодотворение ооцитов в культуре in vitro); 2 – введение генной конструкции (микроинъекция в пронуклеус); 3 – пересадка эмбрионов самкам-реципиентам (реципиентами выбираются животные другой породы, отличающиеся по окраске шерсти и другим породным признакам); 4 – животные, рожденные из инъецированных эмбрионов: только часть из них содержат трансген. Кроме того, эти животные, как правило, являются гетерозиготами (трансген содержится только в одной из гомологичных хромосом) и мозаиками (трансген содержится не во всех клетках и тканях животного); 5 – проведение молекулярно-генетического анализа для подтверждения присутствия вводимого гена в составе генома животного; 6 – отбор животных, продуцирующих трансгенные гаметы (скрещивание трансгенных животных с животными другой породы, отличающиеся по окраске шерсти и другим породным признакам, и анализ их потомства). Селекция трансгенных гомозигот: скрещивание трансгенных животных для получения гомозиготных по введенному гену потомков; 7 – получение стада тансгенных животных; 8 – выделение лекарственного белка из молока и его очистка 349 глобулиновым промотором. α-1-антитрипсин используется при лечении эмфиземы легких у человека. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. В России группой ученых получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200-300 мг химозина — основного компонента для производства сыра. Стоимость его будет в несколько раз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычугов молочных телят и ягнят. Из 3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточное количество химозина для производства 1 т сыра из коровьего молока. В последние годы успешно начат совместный Белорусско- российский генно-инженерный проект по производству двух лекарственных препаратов лактоферина и проурокиназы на основе использования молока трансгенных коз. Лактоферин – вырабатывается молочными железами и служит в женском молоке в качестве основного антибактериального и противовоспалительного компонента. Стоимость этого препарата на рынке превышает 3 тыс. долларов за 1г. Применение лактоферина в качестве пищевой добавки позволяет в 10 раз снизить заболеваемость гастроэнтеритами у грудных детей. Проурокиназа – тромболитический фермент, применение которого сразу после инфаркта в 5 раз снижает смертность. Несмотря на мощный лечебный эффект, этот препарат малодоступен для населения, поскольку стоимость одного курса лечения превышает 1 тыс. долларов. В то же время только в Беларуси и России в таком лечении нуждается почти полмиллиона кардиологических больных. В целом годовая потребность в лактоферине и проурокиназе даже в развитых странах превышает 5 млрд. долларов. Поэтому использование полученных трансгенных животных снизит стоимость этих препаратов в 10-20 раз, что позволит перевести данные лекарства из разряда супердорогих в число общедоступных. 3 Генная терапия. Быстрому развитию генной терапии, способствовали результаты, полученные в ходе выполнения международного проекта «Геном человека». Ожидается, что в ближайшие годы исследователи определят все функции генов и будут успешно использовать полученные данные в генно-терапевтических работах для лечения и предупреждения наследственных болезней. 350 Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в США четырехлетней девочке Ашанти Де-Сильва, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1:100000), были пересажены ее собственные Т-лим-фоциты, предварительно трансформированные вне организма геном ADA при помощи ретровирусного вектора. Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев За три года терапии в общей сложности проведены 23 внутривенные трансфузии ADA-трансформи-рованных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. После лечения Ашанти в 25-30% ее Т- лимфацитах уровень фермента аденозиндезаминазы стал нормальным и сейчас она совершенно здорова. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием. В настоящее время генная терапия этого заболевания проводится в Италии, Франции, Великобритании и Японии. Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки чужеродного |