Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
Плазмида pUC18 — один из серии относительно мелких Е. coli плазмидных векторов клонирования (см.), содержащий PvuII / EcoR-фрагмент из pBR322(см.) с amp r геном, кодирующим ампинициллин-устойчивость, ориджи- ном репликации ori (см.) и последовательностями, кодирующими α-пептид lac- Z-гена ( -галактозидазы) с полилинкером (см.). Инсерция чужеродной ДНК в полилинкер приводит к нарушению -галактозидазного гена. В этом случае хозяйская бактериальная клетка образует бесцветные колонии, если она растет на среде с ампициллином и субстратом X-gal, который должен расщепляться при помощи -галактозидазы.Штаммы, трансформированные плазмидой pUC18 без вставки чужеродной ДНК на той же среде с X-gal, образуют колонии окрашенные в синий цвет. Т. обр., можно легко отбирать рекомбинантные (т. е. с чужеродной ДНК) колонии. Повторяющаяся нуклеотидная последовательность (ДНК) (repetitious DNA) — последовательность нуклеотидов, содержащаяся в хромосомной ДНК в виде идентичных копий; различают высокоповторяющиеся нуклеотидные 431 последовательности (млн. копий на геном), а также умеренно повторяющиеся последовательности (десятки и сотни копий на геном). Поли(А), полиаденилат (poly(A) or polyadenylate) —гомополимер, содержащий остатки адениновых нуклеотидов. Практически все мРНК эукариот на своих 3’-концах содержат последовательность поли(А) или поли(А) хвост. Полилинкер, сайт множественного клонирования (polylinker or multiple cloning site) — синтетический двунитчатый олигонуктлеотид, содержащий много сайтов рестрикции (см.). П. вводят в векторы, чтобы расширить их возможности для клонирования чужеродных ДНК в любом из этих сайтов. Полимеризация —третья стадия цикла ПЦР в ходе которой при увеличении температуры в реакционной смеси in vitro с 50С до 72С Tag- полимераза удлиняет оба праймера с их 3’-концов до размеров матричной нити ДНК. Этот процесс протекает в течении 90 секунд. В результате количество ДНК удваивается. Фермент Tag-полимераза был выделен из термофильных бактерий Thermus aquaticus, и отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70С гибрид праймер-ДНК не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью. Полимеразная ценная реакция, ПЦР (polymerase chain reaction, PCR)— процесс амплификации (см.) in vitro, при котором фрагмент ДНК длиной до 15 кб может быть амплифицирован (размножен) до 10 8 раз (копий). Для этого синтезируются два олигонуклеотида размером в 10-30 нуклеотидов, комплементарных последовательностям на двух концах исследуемой ДНК. Из- быточное количество этих двух олигонуклеотидных праймеров (см.) смешивается с геномной ДНК, смесь нагревается для денатурации дуплексов ДНК. При последующем снижении температуры праймеры присоединяются к их геномным гомологам и могут с помощью ДНК-полимеразы удлиниться, т. е. на ДНК-матрице синтезируется вторая цепь. Последовательный процесс (цикл процессов) денатурации, отжига праймера и его удлинения повторяется 20-40 раз. В результате происходит экспоненциальное увеличение копий изучаемой ДНК. За 25 амплификационных циклов количество целевых последователь- ностей ДНК увеличивается приблизительно в 10 6 раз. Для синтеза новых цепей ДНК используются термостабильные ДНК-полимеразы (Taq-пoлимераза, Vent™- ДНК-полимераза). В н. вр. ПЦР нашла широкое распространение в молекулярной биологии и на ее основе разработано множество методов анализа геномов. Имеет место также инвертированная полимеразная цепная реакция, т. е, модификация обычной ПЦР, позволяющая амплифицировать неизвестные последовательности ДНК, прилежащие ккоровой области известной последовательности. Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами (arbitrarily primed роlymerase chain reaction, AP-PCR) —модификация стандартного метода ПЦР, позволяющая осуществлять амплификацию (см.) целевых последовательностей ДНК с помощью произвольно взятых праймеров (см.), без предварительного знания нуклеотидных последовательностей данного генома. Метод позволяет выявлять полиморфизм между штаммами бактерий и грибов, различными сортами растений. Полисахариды —линейные или разветвленные полимеры, состоящие более чем из 10 моносахаридов, связанных гликозидными связями. Полицистронная мРНК (polycistronic message) — молекула мРНК, 432 кодирующая последовательности более чем одного белка; образуется при транскрипции двух или нескольких соседствующих генов, входящих в состав одного оперона. Поллютант — вещество, загрязняющее окружающую среду и вызывающее нарушения в функционировании организмов, популяций, экосистем. Последовательность узнавания — см. Сайт узнавания. Правило Чаргаффа — правило, гласящее, что в любой двунитчатой молекуле ДНК число адениновых оснований всегда равно числу тиминовых (А = Т), а число гуаниновых — числу цитозиновых (Г = Ц) оснований. Согласно П. Ч. количество пиримидинов (Т + Ц)равно сумме пуринов (А + Г).П. Ч. открыто в 1950 г. и лежит в основе классической модели ДНК Уотсона—Крика. Праймер, затравка (primer) — короткий олигонуклеотид ДНК или РНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК или РНК. К его З'-ОН- концу ДНК-полимераза (см.) может добавлять нуклеотиды в растущую цепь ДНК в 5'—3'-направлении. У прокариот РНК-полимераза (см.) катализирует синтез таких РНК-праймеров для репликации ДНК. П. также нужны для РНК- зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы, см). In vitro (см.) используются синтетические П. размером до 10 п. о. для реакции полимеризации ДНК с помощью ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы, П. нужны для синтеза кДНК, ДНК секвенирования по Сэнгеру (см.), полимеразной цепной реакции, ПЦР (см.) и др. Пренатальная стадия развития —стадия развития зародыша (плода) живородящих животных в период перед рождением. Этим термином обычно обозначают поздние стадии развития зародыша млекопитающих. Принцип комплементарности — пространственная взаимодополняемость (взаимное соответствие) поверхностей взаимодействующих молекул или их частей, приводящая, как правило, к образованию вторичных (Ван-дер-Вальсовых, водородных, ионных) связей между ними. Уникальность и прочность комплементарных структур определяется высокой избирательностью, большой площадью взаимодействия на уровне атомных группировок или зарядов по принципу «ключ - замок» (комплексы антиген – антитело и фермент – субстрат, четвертичная структура белков, вторичная и третичная структура нуклеиновых кислот). Наиб. ярко К. проявилась в структуре двуспиральных ДНК и РНК, где две полинуклеотидные цепи образуют в результате комплементарного взаимодействия пар пуриновых и пиримидиновых оснований (А-Т, Г-Ц) двуспиральную молекулу. Уникальная вторичная и третичная структура одноцепочечных полинуклеотидов (тРНК, рРНК) также определяется комплементарным спариванием оснований с образованием «петель» и «шпилек» вдоль по цепи. К. лежит в основе мн. явлений биол. специфичности, связанных с «узнаванием» на молекулярном уровне. Пролиферация — новообразование клеток и тканей путем размножения. Промотор (promoter) — участок молекулы ДНК длиной 80-120 п. н., к которому присоединяются молекулы РНК-полимеразы, что сопровождается инициацией транскрипции соответствующих генов; каждый ген (или оперон) имеет свой П., контролирующий его транскрипцию; существование П. впервые было показано Ф. Жакобом и Ж. Моно при анализе lac-оперона E. coli. Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью 433 ферментативного разрушения или механическим способом. Психрофильные организмы — холодолюбивые организмы, достигающие максимальной скорости роста при температурах ниже 20°. Широко встречаются в почвах и воде зон умеренного климата; вызывают порчу продуктов в холодильниках. ПЦР (PCR)—cм. Полимеразная ценная реакция. ПЦР-амплификации —см. полимеразная ценная реакция (ПЦР), амплификация генов. ПЦР технологии —различные методы размножения (амплификация) ДНК с помощью ПЦР. Р Радиоактивно меченный ДНКовый зонд —см. ДНКовый зонд. Разделение рестрикционных фрагментов ДНК — см. Электрофорез в агарозном геле. Распознаваемые участки —см. Сайты распознавания. Репликация — процесс точного самовоспроизведения молекул нуклеиновых кислот, сопровождающийся передачей точных копий генетической информации в ряду поколений. Термин Р. в основном используется для определения процесса синтеза новой нити ДНК на матричной нити ДНК с целью точного копирования информации, содержащейся в геноме. Р. ДНК является полуконсервативной. Основные стадии этого процесса включают разделение нитей ДНК с образованием репликативной вилки, связывание ДНК-полимеразы и добавление комплементарных нуклеотидов начиная с 3'-конца. Нить, непрерывно реплицирующаяся (ведущая нить, лидерная нить), должна отделяться от др. (запаздывающей) нити, которая реплицируется прерывисто, короткими кусками (фрагменты Оказаки). После синтеза фрагменты Оказаки лигируются (с участием ДНК-лигазы), образуя целую запаздывающую нить. Репортерный ген (reporter gene) —ген, хорошо изученный генетически и биохимически, который легко может быть сшит с регуляторной областью др. генов. Его активность в норме не обнаруживается в организме, в который этот ген переносится. Активность большинства Р. г. можно легко протестировать достаточно простыми методами (напр., определением ферментативной активности белкового продукта для галактозидазы, -глюкуронидазы, хлорамфениколацетилтрансферазы, люциферазы, неомицин фосфотрансферазы, нопалинсинтазы и др.). Рестриктазы — ферменты рестрикции, разрезающие ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым сайтами рестрикции (см.). Р. могут кодироваться не только геномом бактерий, но также плазмидами и бактериофагами. Являются одним из главных инструментов генной инженерии, широко используются для получения рекомбинантных ДНК(см.). Синоним – рестрикционные эндонуклеазы. Рестрикционные карты — диаграмма расположения на молекуле ДНК сайтов узнавания (см.) рестриктазами. Самыми полными являются Р. к., построенные для небольших молекул ДНК (напр., хромосом прокариот). Первую полную физическую карту расположения участков 14 рестриктаз составил Д. Натанс для ДНК вируса sv-40. Реципиентный организм, реципиент —1. Любая клетка или организм, 434 получающий: а) новую генетическую информацию в форме чужеродной ДНК или РНК; б) к.-л. биологический материал от др. организма-донора. 2. Клетка, принимающая генетический материал при трансдукции и конъюгации. Ровные (тупые) концы —термин, относящийся к двухцепочечным фрагментам ДНК у которых ни одна нить на концевых участках не выступает за другую в отличие от липких концов (см.). Р.к. образуются в результате действия рестриктаз (рестрикционных эндонуклеаз) Alu I, Ecor V, Нра I, Nac I, Pvu II, Sma I и др., а также путем удаления однонитчатых концов с помощью S1-нуклеазы или достройки их с помощью ДНК-полимеразы I. Рибонуклеиновая кислота (РНК) —чаще всего однонитчатый полинуклеотид, характеризующийся наличием в нем сахара рибозы и урацила (вместо дезоксирибозы и тимина в ДНК). Обеспечивает передачу генетической информации (информационная иРНК и транспортная тРНК), служит в качестве структурного каркаса для рибосом (рибосомная рРНК) и выполняет ферментативные функции (рибозимы). Около 90% всей клеточной РНК составляет рРНК, около 8% составляет тРНК, а на долю иРНК приходится менее 2%. У эукариот молекулы РНК, как правило, транскрибируются в виде больших молекул (предшественников про-РНК), а затем путем сплайсинга и др. посттранскрипционных модификаций преобразуются в активные (зрелые) формы, имеющие меньшие (иногда существенно) размеры. У про- и эукариот функции РНК сильно различаются. У многих вирусов вся генетическая информация вместо ДНК содержится в одно- и двунитчатых РНК. Рибосома — органоид клетки, с помощью которого осуществляется биосинтез белка. Р.представляет собой асимметричную рибонуклеопротеидную частицу диаметром 10—20 μm, которая состоит из двух субъединиц и обладающая каталитической функцией, ответственной за образование пептидных связей, т. е. за полимеризацию аминокислотных остатков в полипептидную цепь белка. При связывании Р. с информационной РНК начинается синтез полипептидов. Малая субъединица содержит единственную цепь рРНК (16S — у прокариот, хлоропластов и растений, 18S рРНК — у животных), ассоциированную с рибосомным белком (S -белки), которая связывается с иРНК. Крупная субъединица является комплексом единственной большой цепи рРНК (23S рРНК — у прокариот, 25S — у растений и митохондрий, 28S — у животных), одной или двух малых рРНК (5S— у прокариот, 5S и 5,8S— у эукариот) и рибосомных L-белков. Этот комплекс несет сайт для присоединения 2—3 молекул транспортной РНК. С Сайт клонирования — место (сайт) расщепления ДНК определенной рестриктазой в векторе клонирования, которое локализовано в пределах одного из генов устойчивости. Это позволяет обнаруживать инсерцированную чужеродную ДНК по исчезновению устойчивости к антибиотику на селективной среде в процессе клонирования (см.). Сайт рестрикции —последовательность пар оснований в молекуле ДНК, в месте расположения которой определенная рестрикционная нуклеаза разрезает (расщепляет) ее. Сайт узнавания — специфическая последовательность ДНК, с которой связываются рестрикционные эндонуклеазы, а также начинается расщепление молекулы ДНК данным ферментом. Для каждой рестриктазы имеется 435 собственная специфическая последовательность узнавания. Обычно С. у. представлен коротким палиндромом. Сos-сайты (cos-sites) — однонитчатые, комплементарные участки на обоих концах ДНК фага лямбда (см. Липкие концы), состоящие из 12 нуклеотидов. Обеспечивают фагу образование кольцевых структур путем соединения водородными связями комплементарных концов и упаковку ДНК в фаговые частицы. Cos- с. используются для конструирования космид (см.). Самостоятельная репликация — способность ряда внехромосомных генетических элементов (плазмид) к автономной репликации. Саузерн-блот анализ — анализ молекул ДНК и их фрагментов при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну. Саузерн-блот гибридизация — метод, позволяющий идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофоретического разделения. Суть метода заключается в том, что сначала фрагменты ДНК, разделенные в агарозном геле, денатурируются до одноцепочечных молекул, а затем весь электрофоретический спектр ДНК отпечатывается (blotting) за счет капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембране (пленке), после чего фиксируется при помощи высокой температуры. Далее мембрана помещается в гибридизационный буфер, содержащий специальный радиоактивно меченный ДНКовый зонд – короткую специфическую последовательность ДНК. Зонд способен гибридизоваться с определенным комплементарным фрагментом ДНК и свяжется только с одной или несколькими конкретными фракциями из всего электрофоретического спектра полученных рестрикционных фрагментов ДНК. На последнем этапе к нитроцеллюлозной мембране, содержащей весь спектр полученных фрагментов ДНК, включая фракции гибридизовавшиеся с радиоактивно меченым зондом, прикладывают рентгеновскую пленку. На пленке (авторадиограмме) после экспозиции выявляются засвеченные места, соответствующие расположению меченых фракций ДНК. Метод разработан Э. Саузерном и Р. Дейвисом в 1975 г. Селективная среда - средовые условия в культуре in vitro, обеспечивающие отбор клеток с желательными признаками. Светящиеся фракции ДНК — двунитчатые фракции ДНК в агарозном или полиакриламидном геле, окрашенные красителем этидий бромидом, в комплексе с которым приобретают малиновую окраску при УФ освещении. Секвенирование ДНК (DNA sequencing) — метод определения последовательности оснований в молекуле ДНК. Существует несколько методов секвенирования: автоматическое, химическое, прямое, секвенирование по Максаму-Гил-берту, Сэнгеру и др. Секвенирование ДНК по Максаму-Гилберту, химический метод (Махат-Gilbert sequencing or chemical s.) —один из наиболее распространенных методов определения первичной последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, Вначале ДНК режется на фрагменты размером 0,6—2,0 кб, концы фрагментов метятся радиоактивной или нерадиоактивной меткой и плавятся для получения однонитчатых молекул. Радиоактивное мечение может осуществляться изотопами серы 35 S или фосфора 32 Р, нерадиоактивное мечение — с помощью биотиновой или флуоресцентной метки. После мечения образец ДНК разделяется на 4 части, каждую из которых обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно из четырех основа- 436 ний ДНК. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую моле- кулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Когда эти повреждённые молекулы обрабатывают пиперидином, в ДНК образуется разрыв в том месте, где находилось разрушенное основание. В результате получается набор 5'- меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от раз- рушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, полученные в результате 4 типов реакции, подвергаются электрофорезу (см.) в полиакриламидном геле, и затем полосы выявляются соответствующим методом в зависимости от способа мечения. На основе результатов электрофореза определяются нуклеотиды и их последовательность в исходной ДНК. |