Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
АААЦГГАТЦЦТТГ……..-3' 3'-ТТЦГААТАЦТТАГТАЦАЦГГА…ГГАЦААААТТТТГЦЦТАГГААЦ……..-5' и легко построим первый праймер, который будет иметь последовательность 5'-ААГЦТТАТГАЦТЦАТГТГЦЦТ-3' . Что касается праймера №2, то если бы нам нужно было амплифицировать фрагмент гена без мутации, он бы выглядел следующим образом: 5'-ЦААГГАТЦЦГТТТТААААЦАГГ-3', но поскольку нам нужно заменить лизин на аспартат, то триплет ТТТ в праймере №2 изменится на ТТЦ и наш праймер примет вид 5'-ЦААГГАТ-ЦЦГТТЦТААААЦАГГ-3'. Построенные нами праймеры позволят с помощью ПЦР на первом этапе амплифицировать (размножить) фрагмент киназного гена величиной 1.2 kb от сайта HindIII до BamI. Причем в этом фрагменте произойдет полное замещение триплета ААА, кодирующего лизин, на триплет ГАА, кодирующего глютомат. Так как амплифицированный нами участок R-киназы длинной 1.2 кb будет естественно представлять собой двухцепочечную ДНК, то обработав его ферментами рестрикции HimdIII и BamI мы получим 330 молекулу с двумя липкими концами, которую можно использовать в дальнейшем клонировании. На следующем этапе надо заменить участок исходного R- киназного гена от HindIII до BamI, на полученный нами с помощью ПЦР мутантный. Для этого надо вырезать данный участок из исходного конструкта в плазмиде pUC18 (см. рис. 32), используя рестриктазы HindIII и BamI. Полученную смесь двух молекул - 1.2 кb (фрагмент гена R-киназа) и 3 кb (2.7 кb pUC18 + 0.3 кb остаток гена R-киназа) для разделения необходимо подвергнуть электрофорезу в агарозном геле. Вследствие разной величины два фрагмента в геле легко отделятся друг от друга, что хорошо видно на рисунке справа. Верхнюю более тяжелую фракцию длинной в 3 кb можно вырезать из геля и после очистки (при помощи специальных смол) получим чистый фрагмент ДНК. Причем он будет иметь липкие концы по сайтам HindIII и BamI. Далее сшиваем при помощи лигазы фрагмент длиной в 3 кb выделенный из геля, и фрагмент с мутацией длиной 1.2 кb полученный нами ранее при помощи ПЦР. В результате у нас будет новая генетическая конструкция с мутантным геном R-киназы встроенным в pUC18. В последнее время для искусственного сайтспецифического мутагенеза использутся еще один способ получения нужных точковых мутаций, который рассмотрен ниже. В кольцевуюплазмиду встроен фрагмент гена, кодирующий важный белок. Для того, чтобы заменить в этом белке одну аминокислоту на другую конструируются два комплементарных антипарралелльных праймера с точковыми мутациями, изменяющими кодон. На первом этапе проводится присоединение (отжиг) сконструиро- ванных олигонуклеотидных праймеров, содержащих требуемую 3 kb 1.2 kb 331 мутацию к соответствующим комплементарным последовательностями, встроенного в плазмиду участка ДНК. Далее, используя специальный фермент Pfu Turbo ДНК-полимераза производится достраивание кольцевой молекулы ДНК плазмиды и встроенного фрагмента. В результате на обеих материнских матрицах образуются (достроятся) новые кольцевые цепочки ДНК уже с измененной последовательностью, содержащие точковую мутацию. На втором этапе происходит разрушение только метилированной материнской ДНК с использованием эндонуклеазы DpnI. Данная эндонуклеаза избирательно разрушает метилированную ДНК, которая характерна для всех бактерий, но не затрагивает вновь синтезированную при помощи праймеров не метилированную плазмидную мутантную ДНК. Плазмидами содержащими мутацию трансформируют XL10-Gold ультрокомпетентные бактериальные клетки. На завершающем этапе культивирование бактериальных клеток позволяет получить достаточно большое количество плазмид, несущих вставку ДНК с нужной мутацией. Ключевые слова и понятия фингерпринт полимеразная цепная реакция ПЦР амплификация праймеры 15-30 нуклеотидов Tag-полимераза олигонуклеотидные затравки ДНК-матрица 3’-концы праймеров денатурация ДНК гибридизация праймеров полимеризация количество ДНК удваивается Thermus aquaticus амплификатор ПЦР-амплификации ПЦР технологии диагностика наследственных забо- леваний пренатальная стадия развития фетальные клетки фетус генетическая дактилоскопия и идентификация индивидуумов бластомеры бластула амниоцетез 332 Ключевые слова и понятия фингерпринт полимеразная цепная реакция ПЦР амплификация праймеры 15-30 нуклеотидов Tag-полимераза олигонуклеотидные затравки ДНК-матрица 3’-концы праймеров денатурация ДНК гибридизация праймеров полимеризация количество ДНК удваивается Thermus aquaticus амплификатор ПЦР-амплификация ПЦР технологии диагностика наследственных забо- леваний пренатальная стадия развития фетальные клетки фетус генетическая дактилоскопия и идентификация индивидуумов бластомеры бластула амниоцетез 333 ЛЕКЦИЯ 23. ГЕНЫ И ГЕНОМЫ 1 Определение нуклеотидных последовательностей в геномах 2 Аннотация расшифрованной последовательности. 3 Характеристика геномов прокариот. 4 Характеристика геномов эукариот. 5 Минимальный геном необходимый для жизни. С начала 20 века основные силы генетиков были сосредоточены на идентификации и картировании генов различных организмов. Для этого проводили поиск спонтанных мутаций или мутаций, возникших в результате физических или химических воздействий. Однако процесс получения мутаций довольно долгий и трудоемкий. Кроме того, возникшие мутации часто приводят к гибели организма, и это делает невозможным картирование мутантного гена. В последние десятилетия генетика сделала мощный рывок, перейдя от классических подходов мутагенеза и картирования к методам рекомбинантных ДНК. Для этого были созданы коллекции генных клонов – геномные библиотеки. Анализируя перекрывающиеся области последовательностей ДНК из различных клонов, генетики начали определять последовательность всех генов в геномах некоторых видов. Это направление получило название геномики. Анализ геномов представляет собой крупномасштабное исследование, требующее координированной работы многих лабораторий. Самый большой и широкоизвестный проект «Геном человека» (The Human Genome Project) был инициирован в 1988 году Национальным Институтом Здоровья, США. В ходе запланированных работ проанализированы геномы человека (H. sapiens), бактерий (E. coli), дрожжей (S. cerevisiae), круглых червей (S. elegans), плодовой мушки (D. melanogaster) и мыши (M. musculus). 1 Определение нуклеотидных последовательностей в геномах. Первым разработанным методом определения нуклеотидных последовательностей в генах, составляющих геном был метод «клон за клоном». На первом этапе создаются геномные (хромосомные) библиотеки фрагментов, которые покрывают всю геномную ДНК организма (геномные клоны). Извлеченные из библиотек клоны анализируют, чтобы создать генетические и физические карты на 334 основе наследования генетических маркеров (RFLPs, STSs) в гетерозиготных семьях. После этого в клонах ищут перекрывающиеся друг с другом последовательности. Таким образом, перекрывают всю хромосому. На последнем этапе определяют нуклеотидную последовательность каждого клона, и, связывая их вместе, составляют последовательность ДНК всей хромосомы (генома). Основные этапы определения нуклеотидных последовательностей генома методом «клон за клоном» представлены на рис. 33. При использовании второго метода, названного методом дробовика или «шот-ган» (shotgun) клоны из геномных библиотек отбираются случайным образом. В отобранных клонах проводят определение последовательности нуклеотидов на основе секвенирования ДНК фрагментов с обоих концов. Аналогичным Рис. 33. Этапы анализа перекрывающихся клонов, создание протяженной физической карты молекулярных маркеров по длине хромосомы и последующее секвенирование клонов для составления 335 образом поступают до тех пор, пока все клоны библиотеки не будут проанализированы. Специально разработанные компьютерные программы позволяют проанализировать перекрывающиеся ДНК- последовательности клонов и связать их вместе. Таким образом, удается получить информацию о последовательности генома (хромосомы) в целом. Этот метод, разработанный К. Вентором в Институте исследования генома, был использован для определения последовательности генома Haemophilus influenzae в 1995 г. После усовершенствования метода Вентор организовал компанию Celera, чтобы определять последовательности геномов эукариот, включая человека. Следует подчеркнуть, что для исключения ошибок в нуклеотидной последовательности, составляющей геном, работы по секвенированию ДНК проводятся многократно. Так применяя метод дробовика при исследовании генома бактерии Pseudomonas aeriginoza (6,3х10 6 н.п.) ученые определяли последовательность нуклеотидов 7 раз. Но даже после этого в результате компьютерной обработки данных было выявлено 1604 участка ДНК, для которых были нужны дополнительные исследования. На заключительном этапе полученные методом «шот-ган» данные по двум участкам генома длиной 82 тыс. н.п. сравнили с данными, полученными стандартным методом и результаты полностью совпали. В частном проекте компании Celera Genomics для определения последовательности ДНК человека (3,2 х10 9 н.п.), используя метод дробовика, последовательность генома была перекрыта 35 раз. И хотя в черновом варианте расшифровка генома человека завершена, необходимо еще провести коррекцию ошибок, заполнение пробелов размером 150 Mb, а также расшифровку 15% генома гетерохроматиновых районов. 2 Аннотация расшифрованной последовательности. После определения нуклеотидной последовательности встает следующая задача по ее аннотации, которая заключается в идентификации всех генов и кодируемых белков, мобильных элементов и семейств повторов, которые могут присутствовать в геноме. Гены, кодирующие белки, обнаруживаются при анализе нуклеотидной последовательности самим исследователем или при помощи компьютерных программ. Гены, кодирующие белки, содержат так называемую открытую рамку считывания, которая начинается с инициирующего кодона АТГ и заканчивается одним из трех терминирующих кодонов - ТАА, ТАГ или ТГА. Сканирование 336 последовательности ДНК для обнаружения открытой рамки считывания, ограниченной АТГ с одной стороны и стоп-кодоном с другой, является одной из стратегий поиска генов. Однако этот метод высоко эффективен только для аннотации бактериальных геномов. В случае же геномов эукариот продуктивность метода резко снижается, поскольку большинство эукариотических генов состоят из экзонов (кодирующих участков гена)и интронов (некодирующих участков гена), и программа часто интерпретирует экзоны, как отдельные гены, т. к. стоп-кодоны часто встречаются в интронах. Следует отметить, что последние версии программ настроены на поиск специфических черт открытых рамок: интрон-экзонных сочленений, 3'полиА-сигналов и преимущественных кодонов. Например, аланин может кодироваться четырьмя кодонами, но в геноме человека кодон ГЦЦ встречается в 41% аланиновых кодонов, а ГЦГ только в 11%. Наиболее часто встречающиеся кодоны присутствуют в экзонах, но не встречаются в интронах и пространствах между генами. После обнаружения предполагаемых открытых рамок считывания для определения гена проводят поиск гомологичных последовательностей среди расшифрованных генов других организмов в базах данных (например, в Genbank). 3 Характеристика геномов прокариот. На сегодняшний день завершена расшифровка последовательностей нескольких десятков геномов прокариот и эукариот. Поскольку прокариоты имеют маленький геном, подходящий для клонирования генов методом дробовика, то для более 50 видов геномы уже расшифрованы и анализ более 200 находится в стадии завершения. Размеры геномов и количество генов у некоторых прокариот приведены ниже в таблице 4. Таблица 4. Размер генома и количество генов у некоторых прокариот. Виды Размеры генома (Mb) Количество генов Escherichia coli 4,64 4397 Bacillus subtilis 4,21 4212 Haemophilus influenza 1,83 1791 Ricketsia provaseki 1,11 834 Micoplasma pneumoniae 0,82 710 Micoplasma gentialum 0,58 503 На основе полученных результатов установлено, что размеры геномов простейших относительно малы (в основном менее 5 337 мегабаз), но широко варьируют от больших геномов бактерий (30 мегабаз у Bacillus megaterum ) до маленьких геномов эукариот (12 мегабаз у дрожжей). Большинство исследованных геномов прокариот организованы в кольцевые молекулы ДНК. Однако, Borrelia burdoferi – возбудитель болезни Лайма у человека и некоторые виды Streptomyces имеют геномы в виде линейной ДНК. Еще одной характерной чертой геномов бактерий оказалась очень высокая плотность генов, которая составила в среднем 1 на 1000 пар оснований (табл. 4). Причем, такая плотность присуща и E. coli с относительно большим геномом 4,6 мегабаз (4397 генов) и М. gentialum с самым маленьким геномом 0,6 мегабаз (503 гена). Плотно расположенные гены у бактерий обуславливают высокую пропорцию ДНК, кодирующую белки (85-90 %). Интересно, что только 1% бактериальной ДНК является некодирующей и чаще всего она представлена в форме транспозонов – элементов, которые могут перемещаться по геному. Интроны в бактериальных геномах практически отсутствуют. Необходимо подчеркнуть важное свойство бактериальных геномов, связанное с тем, что большая часть генов у них локализуются совместно и являются полицистронными транскрипционными единицами, имеющими общий промотор и регулятор. Такая структура регуляции была открыта в ходе исследования метаболизма лактозы у E. coli еще в начале 60-х и получила название оперона. Упрощенная схема лактозного оперона, его структурных и регуляторных генов представлена на рисунке 34. В настоящее время установлено, что в геноме E. coli около 600 транскрипционных единиц являются оперонами. Рис. 34. Упрощенная схема lac-оперона – структурных и регуляторных генов, контролирующих метаболизм лактозы у Escherichia coli. Структурные гены lac-Z, lac-Y, lac-A транскибируются в одну полицистронную м-РНК, с которой одновременно транлируется сразу три фермента (ß-галактозидаза, пермиаза и трансацетилаза). 338 4 Характеристика геномов эукариот. Эукариоты по сравнению с прокариотами имеют низкую плотность генов. Причем, более сложные эукариоты имеют менее компактные геномы и меньший уровень плотности генов (табл. 5). Если сравнить участки длиной 50 килобаз хромосомы 3 дрожжей и хро- Таблица 5. Размер генома и количество генов у некоторых эукариот. Виды Размеры генома (Mb) Количество генов S. cerevsiae ( дрожжи ) 12 6548 P. falcioparum (плазмодий) 30 ок 6500 C. elegans (нематода) 97 > 20000 A. thaliana (арабидопсис) 120 20000 D. melanogaster (дрозофила) 170 ок 16000 O. sativa (рис) 415 ок 20000 Z. mays (кукуруза) 2500 ок 20000 H. sapiens (человек) 3200 ок 35000 H. vulgare (ячмень) 5300 ок 20000 мосомы 7 человека, то можно выявить несколько различий. Во- первых, у дрожжей на таком участке расположено 20 генов, а у человека только - 6. Кроме того, ни один из генов дрожжей не Рис. 35. Упрощенная схема β-глобинового гена человека и матричной мРНК после процесса транскрипции и сплайсинга. Этот ген состоит из более чем 2 тыс. н.п. Однако из них только около 450 н.п. несут информацию об аминокислотной последовательности β-глобина. Кроме трех кодирующих участков (экзонов), ген включает два некодирующих (интроны 1 и 2). В левой части гена располагается промотор (200 н.п.), к которому присоединяется РНК-полимераза II осуществляющая процесс транскрипции. Образующийся первичный транскрипт РНК состоит из 339 содержит интронов, тогда как почти все гены человека их содержат. В некоторых генах имеется более 100 интронов. Ниже в качестве примера представлена схема β-глобинового гена, содержащего 2 интрона (рис. 35). Во-вторых, большой размер геномов эукариот обусловлен наличием так называемых ДНК-повторов. Например, у кукурузы более 80% суммарной ДНК представляет собой ДНК- повторы, что и обуславливает очень низкую плотность генов в геноме этого растения. Хотя не вся нуклеотидная последовательность генома человека расшифрована, очевидно, что наши гены являются типичными эукариотическими. Суммарная ДНК составляет более 3 000 мегабаз длиной и распределена по 24 хромосомам, размеры которых варьируют от 55 до 250 мегабаз. Хромосома 19 имеет наибольшую плотность генов, а хромосома 13 и Y - наименьшую. Сначала предполагалось, что человеческий геном содержит от 80000 до 100000 генов. Однако, в результате проведенных исследований в рамках проекта «Геном человека» стало ясно, что число генов вряд ли превысит 35000 – 40000. Геном человека по размеру больше чем геном дрозофилы (см. табл. 5) и содержит больше интронов. Средний размер генов у человека вместе с интронами составляет 27 килобаз. Самый большой ген у человека кодирует белок дистрофин (рис. 36.). Этот ген составляет 2,5 мегабазы и превосходит геномы многих бактерий. Единицы транскрипции в |