Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
3 Перспективы использования клонального микроразмножения растений. Микроразмножение растений получило широкое распространение во второй половине ХХ века, а в последние десятилетия оформилось как мощное промышленное производство, быстро реагирующее на запросы рынка. К примеру, только за период с 1985 по 1990 год число растений, размножаемых in vitro, возросло с 130 млн. до 513 млн. Мировыми лидерами в этой области являются Нидерланды, США, Индия, Израиль, Италия, Польша и другие 287 страны. В основном эта перспективная технология связана с ориентацией на производство декоративных, плодовых, лесных и овощных культур. Использование микроразмножения дает возможность быстро перейти на высокопродуктивные сорта. В Беларуси клональным микроразмножением растений занимаются около 30 лабораторий (крупнейшая - в БГСХА). Главная культура, размножаемая in vitro в республике - картофель, что связано с традиционным производством этой культуры в личном и общественном секторе. Налаживается производство оздоровленного посадочного материала земляники, голубики высокой, декоративных растений (розы, фикус и др.). Научные исследования по клональному микроразмножению растений проводятся в НИИ картофелеводства, НИИ плодоводства, БГСХА, Институте генетики и цитологии НАН Беларуси, Центральном ботаническом саду НАН Беларуси. Микроразмножение является весьма эффективным приемом быстрого распространения и оздоровления от инфекции новых сортов и гибридов картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лесных растений. Методы микроразмножения широко используются селекционерами для ускоренной репродукции ценного материала. Размножение растений in vitro может стать важным инструментом поддержания существующего биоразнообразия редких и исчезающих видов, занесенных в Красную книгу Беларуси. 4 Криосохранение. Сохранение разнообразия форм жизни — важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г.Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнооб- разия — единственный механизм стабильности жизни на Земле. Кроме того, для обеспечения питанием растущего населения на- шей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с расширением городов, сельскохозяйственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить. Существует несколько способов сохранения генофонда высших растений: заповедники, национальные парки, банки семян. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, 288 депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т.е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196°С). Криосохранение имеет су- щественные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико- химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Сохраняется генотип, а следовательно, все свойства замороженного объекта. Единственный негативный фактор, которого не удается избежать, — это фоновая ионизирующая радиация. Однако, по мнению М.Ашвуд-Смита, потребуется примерно 32000 лет для накопления 10% летальных хромосомных повреждений. Следовательно, криогенный метод дает возможность неограниченно долго хранить растительный материал без существенных изменений: сохраняются жизнеспособность клеток, их свойства, а также способность к морфогенезу и регенерации целых растений. Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использовании криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны два метода криосохранения: программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замораживания началась сравнительно недавно, однако считается, что именно этот метод со временем станет наиболее перспективным. Трудности криосохранения растений связаны со спецификой растительных клеток. Клетки растений имеют большие размеры (в культуре тканей они изменяются от 15 до 1000 мкм), прочную целлюлозную стенку и вакуоли. Причем именно степень вакуоли- зации играет основную роль в устойчивости клеток к действию низких температур. В зрелой клетке центральная вакуоль занимает до 90 % общего объема клетки, т.е. клетка представляет собой как бы резервуар с водой, которая необходима для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому основные факторы, способные привести клетку к гибели при замораживании, — это образование льда и дегидратация. Обычно кристаллы льда сначала образуются во внешнем растворе вокруг клеток. Максимальная скорость их роста в зависимости от состава раствора находится в пределах температур от -20 до -60°С. При температуре –140 °С рост кристаллов льда 289 совершенно прекращается. Следовательно, и при замораживании, и при оттаивании клеткам очень важно с оптимальной скоростью «проскочить» температуру образования льда. Кристаллы внеклеточного льда могут механически разрушать клетки. Кроме того, они играют водоотнимающую роль, что приводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее гибели от ос- мотического стресса. При очень быстром замораживании лед может образовываться и внутри клеток, что ведет к разрушению в ней многочисленных мембран. Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т. е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрификацию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации. Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсульфоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы: проникающие и непроникающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин — первое вещество, определенное как криопротектор, может про- никать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре 0 °С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Поэтому обычно используют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого. Жизнеспособность клеток после замораживания зависит не только от предупреждения образования льда, но и от их состояния. Крупные вакуолизированные клетки погибают гораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапе подготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях, способствующих образованию мелких клеток и синхронизации их деления. Кроме того, концентрирование клеток в культуре, т.е. увеличение ее плотности, способствует повышению выживаемости клеток после замораживания. 290 Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспе- чивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода под- тверждается возобновлением после хранения в жидком азоте суспензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника; каллусных — тополя, маршанции, сахарного тростника; андрогенных эмбриоидов — беладонны, табака и др. Из вос- становленных после замораживания культур моркови и табака удалось регенерировать целые растения. После быстрого замора- живания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбору условий, обеспечивающих выживание клеток и, следовательно, возможность последующей регенерации из них целых растений. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологические особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия оттаивания. Ключевые слова и понятия антиоксиданты витрификация воды криопротекторы криосохранение микроклональное размножениие тотипотентность фитогормоны экспланты 291 ЛЕКЦИЯ 16. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ 1 Структура наследственного материала. 2 Реализация генетической информации. 3 Свойства генетического кода. 1 Структура наследственного материала. Молекулярная генетика исследует процессы, связанные с наследственностью на молекулярном уровне. Единицей генетической или наследственной информации является ген. Ген – это участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), несущей информацию об одной полипептидной цепи. Особенности того или иного организма определяются специфичностью его белков. Именно они влияют на обмен веществ, жизнедеятельность и отдельные функции организма, такие, как развитие, восприятие внешних сигналов, движение и т.п. С молекулярной точки зрения белки реализуют все разнообразие генетической информации, именно они и наследуются. Белки состоят из аминокислот, которые соединены между собой пептидной связью. В состав белков входит 20 различных аминокислот. Информация о структуре каждого белка записана и хранится в молекуле ДНК. Молекула ДНК – полимер, состоящий из двух цепочек нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, моносахарида дезоксиорибозы (рис.10) и остатка фосфорной кислоты. Азотистые основания в ДНК бывают четырёх типов: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Вдоль нити ДНК азотистые основания прочно связаны между собой через моносахарид и остаток фосфорной кислоты фосфодиэфирной связью (рис. 11), между цепочками – через водородные связи. В общей схеме ДНК напоминает лестницу. Рис. 10. Формула дезоксирибозы 292 Рис. 11. Строение одной цепочки ДНК ЦГ ГЦ ГЦ ГЦ ЦГ ТА АТ ТА ТА ТА 5’ 3’ 5’ 3’ Рис. 12. Модель двухцепочечной структуры ДНК по Уотсону и Крику Вся «лестница» ДНК закручена в спираль (рис. 12). Между двумя цепочками азотистые основания располагаются закономерно: аденин всегда против тимина, гуанин – против цитозина. Иными словами, аденин комплементарен тимину, гуанин – цитозину. 293 направление транскрипции Молекулы ДНК обладают способностью к удвоению ( репликации). В основе процесса удвоения лежит принцип комплементарности Количественное соотношение нуклеотидов в молекуле ДНК известны в виде правил Чаргаффа: 1. ΣА = ΣТ или ΣА / ΣТ = 1 2. ΣГ = ΣЦ или ΣГ / ΣЦ = 1 3. Σ(А + Г) = Σ(Т + Ц) или Σ(А + Г) / Σ(Т + Ц) = 1 4. Количество комплементарных оснований А + Т и Г + Ц у разных видов живых организмов различно. Отношение Σ(Г + Ц) / Σ(А + Т) является важнейшей характеристикой ДНК, как показатель специфичности её нуклеотидного состава. Коэффициент специфичности у ДНК варьирует от 0,45 до 2,57 у микроорганизмов, от 0,58 до 0,94 у высших растений и от 0,54 до 0,81 у животных. 2 Реализация генетической информации. Информация о расположении аминокислот в молекуле белка записана и хранится в ДНК в виде определённой последовательности нуклеотидов. Считывание информации с ДНК осуществляется с помощью рибонуклеиновых кислот (РНК). Процесс расшифровки начинается с синтеза информационной РНК (и-РНК). Информационная РНК – полимер, состоящий из одной цепочки нуклеотидов. В состав нуклеотидов также входят азотистые основания, моносахарид рибоза и остаток фосфорной кислоты. Азотистых оснований в РНК также четыре: аденин, урацил (У), гуанин, цитозин. Информационная РНК по принципу комплементарности снимает информацию с ДНК. Этот процесс называется транскрипцией. Важно подчеркнуть, что и-РНК транскрибируется всегда только с одной цепочки ДНК в направлении от 3’ к 5’ концу (рис 13.). ДНК 5’– Т – Г – Г – Т – А – Т –3’ 3’– А – Ц – Ц – А– Т – А –5’ и-РНК 5’– У – Г – Г – У –А – У –3’ Рис. 13. Схема строения ДНК и транскрипции и-РНК. Следующий этап расшифровки генетической информации 294 происходит на рибосомах (полисомах), где осуществляется синтез полипептидной цепи белков по матрице и-РНК. Этот процесс называется трансляцией. В нем кроме и-РНК также участвуют транспортные РНК (т-РНК), функция которых состоит в том, чтобы доставить аминокислоты к рибосомам и найти им своё место в полипептидной цепи, предусмотренное кодом. Следует отметить, что в ходе трансляции считывание генетической информации осуществляется с молекулы и-РНК в направлении от 5’ к 3’ концу цепочки. Генетический код в настоящее время расшифрован для всех 20 аминокислот и составлен по и-РНК в виде таблицы (табл. 2). В таблице 2 сокращенные названия аминокислот даны по международной терминологии. Таблица 2. Соответствие кодонов и-РНК аминокислотам Основания кодонов третье первое второе У Ц А Г У У Ц А Г Фен Сер Тир Цис Фен Сер Тир Цис Лей Сер – – Лей Сер – Три Ц У Ц А Г Лей Про Гис Арг Лей Про Гис Арг Лей Про Глн Арг Лей Про Глн Арг А У Ц А Г Иле Тре Асн Сер Иле Тре Асн Сер Иле Тре Лиз Арг Мет Тре Лиз Арг Г У Ц А Г Вал Ала Асп Гли Вал Ала Асп Гли Вал Ала Глу Гли Вал Ала Глу Гли Примечание. Обозначения аминокислот: Ала - аланин, Арг - аргинин, Асп - аспарагиновая кислота, Асн - аспарагин, Вал - валин, Гис - гистидин, Гли - глицин, Глн - глутамин, Глу - глутаминовая кислота, Иле - изолейцин, Лей - лейцин, Лиз - лизин, Мет - метионин, Про - пролин, Сер - серин, Тир - тирозин. Тре - треонин, Три - триптофан, Фен - фенилаланин, Цис -цистеин. 3 Свойства генетического кода. Генетический код триплетен, т.е. каждую аминокислоту 295 кодируют три рядом стоящие нуклеотида (кодон). Триплеты УАА, УАГ и УГА являются стоп-кодонами. Генетический код вырожден, т.е. 18 из 20 аминокислот кодируются более чем одним кодоном. Например, каждая из 5 аминокислот - пролин, треонин, валин, аланин и глицин, кодируются четырьмя различными кодонами, а лейцин, аргенин и серин – шестью (табл. 2). Ключевые слова и понятия молекулярная генетика ген дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) молекула ДНК нуклеотид репликация принцип комплементарности правила Чаргаффа рибонуклеиновая кислота (РНК) информационная РНК (и-РНК) транскрипция рибосома трансляция транспортная РНК (т-РНК) генетический код триплет кодон стоп-кодон вырожденность кода 296 ЛЕКЦИЯ 17. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ И ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДНОЙ ДНК 1 ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ И ФУНКЦИЯ РЕСТРИКТАЗ. 2 ВИДЫ РЕСТРИКТАЗ. 3 ДНК-ЛИГАЗЫ. 1 ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ И ФУНКЦИЯ РЕСТРИКТАЗ. ДЛЯ ТОГО, ЧТОБЫ ИСКУССТВЕННЫМ ПУТЕМ НАДЕЛИТЬ КАКОЙ-ЛИБО ОРГАНИЗМ НОВЫМИ НАСЛЕДСТВЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ, НУЖНО ВВЕСТИ В НЕГО ХОТЯ БЫ ОДИН ЧУЖЕРОДНЫЙ ГЕН. ПРИЧЕМ, НЕОБХОДИМО ПРИГОТОВИТЬ (СКОНСТРУИРОВАТЬ) ФРАГМЕНТ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК, СОДЕРЖАЩИЙ ЭТОТ НУЖНЫЙ ГЕН. ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ЭТА ПРОЦЕДУРА С ПОМОЩЬЮ ДВУХ ОПЕРАЦИЙ: "РАЗРЕЗАНИЯ" И "СШИВАНИЯ". РОЛЬ ПОРТНЯЖНЫХ ИНСТРУМЕНТОВ ИГРАЮТ ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКТАЗЫ И ЛИГАЗЫ. Рестриктазы (своеобразные молекулярные ножницы), действуя на двухцепочечную ДНК, "узнают" в ней определенную последовательность нуклеотидов. Причем, каждая рестриктаза узнает только свою последовательность ДНК, прикрепляется к ней и 297 разрезает ее в месте прикрепления. Рестриктазам безразлично, какую ДНК разрезать – человека или растения, бактерии или вируса, лишь бы в ней были распознаваемые участки. Это значит, что две совершенно несхожих между собой последовательности ДНК (допустим из клеток слона и лягушки) при обработке одной и той же рестриктазой легко можно сшить (слепить) друг с другом. 2 Виды рестриктаз. Обычно рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 – 6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются обрывки с ровными (тупыми) концами (рис. 14), а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются "липкими", поскольку они могут, как бы слипаться между собой в силу комплементарности. Ярким примером рестриктазы второго типа является |