Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
метода эмбриокультуры, т. е. выращивания изолированного зародыша на искусственной питательной среде. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов, для клеточной селекции. Существует несколько методов клеточной селекции: 1. Прямая (позитивная) селекция, при которой выживает только заданный тип мутантных клеток. 2. Непрямая (негативная) селекция, которая ведет к гибели деля- щихся клеток дикого типа и выживанию метаболически неактивных клеток. Этот прием требует дополнительной идентификации мутационных изменений у выживших клеток. 3. Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны. 4. Визуальная селекция и неселективный отбор, когда необхо- димая вариантная линия выбирается среди прочих визуально или с помощью биохимических методов. 3 Гибридизация соматических клеток. Множество теоретических и практических задач позволяет решать использование изолированных протопластов. С их помощью можно вести селекцию на клеточном уровне, работать в малом объеме с большим числом клеток, осуществлять прямой перенос генов, изучать мембраны, выделять пластиды. Изолированный протопласт – это содержимое растительной клетки, окруженное плазмолеммой. Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует. В 1971 г. Такебе и его сотрудники, обрабатывая клетки листа табака для растворения клеточных стенок сочетанием целлюлазы и пектиназы, добились успеха в получении протопластов. Протопласты культивировали в среде, в которой они могли делиться и формировать каллюс, способный к регенерации с образованием целого растения. Эти первые эксперименты, проведенные на протопластах табака, показали, что более 90% всех протоклоннов, т.е. клонов, полученных из протопластов, удивительно сходны с родительскими линиями как по фенотипу, так и по генотипу. 278 Таким образом, протопласты табака позволили преодолеть обычную изменчивость, характерную для других способов получения клонов. Обнаруженная стабильность была подтверждена и на некоторых других видах растений. В 1974 г. Дж. Мельхерсом был введен в практику термин «соматическая гибридизация», означающий процесс слияния протопластов соматических клеток. При соматической гибридизации развиваются гибриды, объединяющие геном обеих клеток. Соматическая гибридизация имеет важные особенности. Во-первых, этому процессу доступны практически любые скрещивания, во- вторых, слияние протопластов способствует объединению цитоплазматических генов родительских клеток, чего не бывает при скрещивании половых клеток. Самопроизвольное слияние протопластов происходит достаточно редко. Механизм этого процесса до конца не выяснен. Однако известно, что протопласты имеют отрицательный поверхностный заряд, который вызывает их взаимное отталкивание. Впервые искусственное слияние протопластов с помощью индуктора слияния (фьюзогена) было осуществлено в 1970 г. Коккингом и его сотрудниками. Схема слияния протопластов представлена на рисунке 9. Первый неполовой гибрид высших растений был получен в 1972 г. при слиянии изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и Nicotiana langsdorfii. В 1978 г. было произведено успешное слияние протопластов картофеля и томатов. Полученные в результате растения «поматы» представляют не только научный, но и практический интерес, поскольку они образуют клубни и плоды. В отличие от томатов картофель принадлежит к видам, которые с большим трудом поддаются генетическому улучшению. Факторы устойчивости к болезням, скомбинированные в одном сорте томатов, при применении метода слияния протопластов могут быть перенесены в сорт картофеля в ходе одной операции. Аналогичная работа, проведенная с использованием обычных селекционных приемов, заняла бы около 20 лет. 279 Рис. 9. Схема слияния протопластов под действием полиэтиленгликоля (по Х.Борнман, 1991): 1 — изолированные протопласты; 2— слипание протопластов в результате дегидратации; 3 — образование пор в мембране протопласта; 4 — перетекание через поры внутриклеточного материала; 5 — гибридный протопласт. В настоящее время получено много межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов, значительную часть которых нельзя считать нормальными растениями. Возникающие ано- малии — результат хромосомной несбалансированности. Описаны случаи возникновения гибридов между протопластами эритроцитов крысы и дрожжевых клеток, моркови и человека и др. Любые исследования, любые манипуляции в области создания новых ге- нотипов должны быть тщательно и всесторонне продуманы, а ученые должны помнить об ответственности и научной этике. В 1964 г. Индийские исследователи Гуха и Махесвари культивировали в искусственной среде пыльники растений, пыльцевые зерна которых образовали эмбрионы, а затем и гаплоидные растения. Сангван и Сангван-Норилл в 1976 г. добились успеха в культивировании пыльцевых зерен, выделенных из пыльников растений семейства Solanacea. Пыльцевые зерна развивались несколько дней в своих пыльниках, после этого их выделяли для культивирования. Культуральная среда в опытах такого рода содержит до 10000 пыльцевых зерен на 1 мл, но даже при самом тщательном соблюдении необходимых условий лишь очень немногие из них дают начало развитию андрогенных растений (в опытах около 9%). Культура пыльцевых зерен стала основным источником гаплоидных растений у декоративных, овощных, зерновых и кормовых видов. Пыльцевые зерна могут оказаться более удобными, 280 чем протопласты, для экспериментов по генетической трансформации, предназначенных для получения растений с заданными свойствами. Растения, полученные в результате размножения вегетативным путем (клоны), обычно похожи на родительское растение, но не все клоны генетически одинаковы. Иногда возникают клоны, которые существенно отличаются от исходной формы. Их называют соматическими вариантами, сомаклонами или «спортами», и появляются они в результате генетических изменений в клетках меристемы, которые дают начало всему новому растению или его части. Сомаклональная изменчивость – прекрасный источник генетического разнообразия, которое может использоваться при создании генетически измененных организмов с новыми свойствами. Отмечены случаи появления сомаклональных вариантов, сочетающих признаки, которые невозможно или трудно соединить в одном генотипе традиционным селекционным путем. Так, из сомаклональных вариантов, возникших в каллусной культуре риса, были выделены растения, сочетавшие скороспелость и длиннозерность. На их основе за короткий срок был создан новый сорт риса. В ряде случаев размножение спортов привело к созданию новых сортов. Например, апельсины «Навель», персики-нектарины. Таким образом, изменчивость протоклонов, наблюдающаяся в отсутствие мутагенов, весьма важна для селекции: благодаря ней селекционеры получают богатый исходный материал. Ключевые слова и понятия биотрансформация вторичные метаболиты клоны клональное микроразмножение протопласты пыльцевые зерна соматические варианты соматическая гибридизация 281 ЛЕКЦИЯ 15. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ РАСТЕНИЙ 1 Технология микроклонального размножения. 2 Оздоровление посадочного материала. 3 Перспективы использования клонального микроразмножения растений. 4 Криосохранение. Клональным микроразмножением называют неполовое размножение растений с помощью метода культуры тканей, позволяющее получать растения идентичные исходному. В основе получения таких растений лежит способность соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития, т.е. свойство тотипотентности. Метод клонального микроразмножения получает все более широкое распространение во всем мире. В большинстве стран эта технология приобрела коммерческий характер. В России первые работы по клональному микроразмножению были проведены в 60-х годахXX в. в лабораториях Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева. В настоявшее время созданы и развиваются лаборатории клонального микроразмножения, связанные с нуждами селекции, размножением декоративных, лекарственных и других растений. Кроме того, технология используется для размножения лучших экземпляров взрослых лесных деревьев, особенно хвойных, для сохранения редких и исчезающих видов растений. Свое название эта технология размножения получила от термина «клон» (от греч. clon — отпрыск), который предложил Веббер в 1903 г. Клональное микроразмножение имеет существенные преимущества перед традиционными способами размножения: 1. Высокий коэффициент размножения. Одно растение герберы за год при микроклональном размножении дает до 1 млн новых растений, тогда как при обычных способах размножения — только 50—100 растений. Большинство культивируемых в настоящее время сортов лилий размножается только вегетативно. Луковички (возникают на материнских луковицах или на побеге в небольших количествах. Технология микроклонального размножения позволяет получить из одной чешуи луковицы за 6 месяцев до 10 5 новых растений (сорт Red Carpet). 2. Получение генетически однородного посадочного материала. 3. Возможность оздоровления растений, освобождения их от вирусов благодаря клонированию меристематических тканей. 282 4. Возможность размножения растений, которые в естественных условиях репродуцируются с большим трудом. 5. Воспроизведение посадочного материала круглый год, что значительно экономит площади, занимаемые маточными и раз- множаемыми растениями. 6. Сокращение продолжительности селекционного периода, ус- корение перехода растений от ювенильной фазы развития к реп- родуктивной. 1 Технология микроклонального размножения. Обязательное условие клонального микроразмножения — использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требованию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения, т. е. меристематические ткани. Их устойчивость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также с негативной селекцией измененных клеток. Процесс клонального микроразмножения можно подразделить на 3 этапа: 1. Получение хорошо растущей стерильной культуры. На этом этапе необходимо правильно выбрать растение-донор, получить свободную от инфекции культуру, добиться ее выживания и быстрого роста на питательной среде. 2. Собственно размножение, осуществляемое несколькими спо- собами: активизация пазушных меристем; индукция образования адвентивных почек тканями листа, стебля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем и зачатками соцветий без первоначального образования каллусной ткани; микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доми- нирование; стимуляция образования микроклубней и микролуковичек; индукция соматического эмбриогенеза. 3. Подготовка к высадке в поле или к реализации. Это очень важный этап, во время которого в теплице укорененные растения, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят закаливание растений, повышают их устойчивость к патогенным микроорганизмам и различным неблагоприятным факторам внешней среды. Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vivo. Это подбор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка 283 химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные растения лучше приживаются, если их заразить in vitro микоризообразующими грибами. Упрощенный способ адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адаптацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда дорастают до верха пробирки. Через 1,5—2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями появляются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву. Для предотвращения механических повреждений корневой системы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, что над поверхностью почвы остаются только 2 развитых листа, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к вне- шним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этап акклиматизации растений. Клональное микроразмножение растений проводят разными способами. Первый и основной способ — активизация пазушных меристем. Он состоит в снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении. Этот способ основной и в обычном вегетативном размножении. И на интактном растении, и в случае клонирования снятие апикального доминирования достигается или удалением апикальной меристемы побега, или благодаря действию цитокинина. При клонировании цитокинины (6-бензиламинопурин, 6-фурфуриламинопурин, зеатин) добавляют в питательную среду, что приводит к развитию многочисленных пазушных побегов. Эти побеги отделяют от первичного экспланта и культивируют на свежей питательной среде. Активизацию пазушных меристем широко используют в промышленном размножении овощных сельскохозяйственных культур (картофель, томаты, огурцы, сахарная свекла, топинамбур и др.), цветов (гвоздика, роза, гербера), плодовых и ягодных культур (яблоня, вишня, малина, крыжовник и др.), древесных растений (туя, можжевельник и др.). Однако бесконечно размножать таким способом растения нельзя, поскольку длительное воздействие цитокининов, входящих в состав питательных сред, вызывает аномалии в морфологии стебля, потерю способности побегов к укоренению, иногда — гибель растений. В опытах с размножением земляники было показано, что при микроклональном размножении необходимо чередовать 2—3 цикла получения побегов с их укоре- нением. Второй способ — индукция развития адвентивных почек, т. е. по- чек, возникающих из растительных клеток и тканей, которые их 284 обычно не образуют. Этот метод в значительной мере обусловлен тотипотентностью клеток. Почти любой орган или ткань растения, свободные от инфекции, могут быть использованы в качестве экспланта и в определенных условиях образуют адвентивные почки. Данный процесс вызывают внесением в питательную среду определенных концентраций цитокининов и ауксинов, причем цитокинина должно быть гораздо больше, чем ауксина. Это наиболее распространенный способ микроразмножения высших растений. Развивая адвентивные почки на апикальных и пазушных меристемах, размножают растения томата, лука, чеснока; на сегментах листовых пластинок — салат, глоксинию, фиалки; на тканях донца луковиц — лук, чеснок, гладиолусы, тюльпаны и другие луковичные растения. Третий способ — микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование. Растения-регенеранты, полученные любым другим способом, можно черенковать в стерильных условиях, высаживать на свежую питательную среду, укоренять, и адаптировать к полевым условиям либо снова подвергать микрочеренкованию для того, чтобы увеличить количество посадочного материала. Четвертый способ — размножение в биореакторах микроклуб- нями. Это один из способов ускоренного размножения оздоров- ленного материала. О. Мелик-Саркисов сконструировал гидропонную установку, позволяющую получать около 7000 микроклубней с 1 м 2 при массе одного клубня 5 г. Предусмотрена последующая механизированная посадка их в грунт. В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН создана эффективная полупромышленная замкнутая система пневмоимпульсного биореактора для получения микроклубней картофеля, в которой предусмотрена возможность воздействия на направление и скорость процессов клубнеобразования. Технологии клонального микроразмножения в биореакторах разработаны не только для сельскохозяйственных, но и для декоративных растений (лилии, гладиолусы, гиацинты, филодендроны и т.д.). Однако созданные установки пока носят лабораторный, модельный характер. Пятый способ размножения — образование соматических за- родышей — основан на морфогенных изменениях — соматическом эмбриогенезе. Впервые это явление было отмечено в середине 50-х годовXX в. в культуре клеток моркови. Формирование эмбриоидов в культуре осуществляется в два этапа. На первом соматические клетки дифференцируются в эмбриональные в присутствии в питательной среде ауксинов, обычно это 2,4-D. На следующей стадии развиваются эмбриоиды. Этот процесс идет только при значительном снижении 285 концентрации ауксина или полном отсутствии его в питательной среде. Соматический эмбриогенез может происходить в тканях первичного экспланта, в каллусной и суспензионной культурах. Поскольку соматические зародыши представляют собой пол- ностью сформированные растения, данный метод позволяет со- кратить затраты, связанные с подбором условий укоренения и адаптации растений-регенерантов. Кроме того, преимущество по- лучения соматических эмбриоидов состоит в том, что при исполь- зовании соответствующей техники капсулирования из них можно получать искусственные семена. Соматический эмбриогенез в настоящее время применяют для размножения пшеницы, ячменя, моркови, редиса, винограда, некоторых древесных растений (дуб, ель, эвкалипт). 2 Оздоровление посадочного материала. Оздоровление посадочного материала начинается с момента стерилизации экспланта в асептических условиях бокса, с обработки ткани антибиотиками. Однако таким образом удается освободиться главным образом от бактерий, грибных инфекций, нематод. Вирусы, вироиды, микоплазмы остаются в тканях инфицированных растений. Именно из-за вирусных болезней погибает от 10 до 50% урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативно. Некоторые бобовые растения (соя) могут передавать вирусы даже при семенном размножении. В 1949 г. было выяснено, что клетки меристематических тканей растений обычно не содержат вирусов. В 1952 г. Дж. Морель и Г. Мартин предложили, используя культивирование меристем, получать здоровые, избавленные от вирусной инфекции растения. Они об- наружили, что при выращивании верхушки побега, состоящей из конуса нарастания и 2—3 листовых зачатков, на ней образуются сферические образования — протокормы. Протокормы можно делить, и каждую часть культивировать до образования корней и листовых примордиев, получая в большом количестве генетически однородные безвирусные растения. В настоящий момент культивирование меристем побега — наиболее эффективный способ оздоровления растительного материала от вирусов, вироидов и микоплазм. Однако при этом способе требуется соблюдать определенные правила. Как уже говорилось, чем меньше размер меристематического экспланта, тем труднее вызвать в нем морфогенез. Чем больше размер экспланта, тем легче идет морфогенез, в результате которого получается целое растение, но тем больше вероятность присутствия вирусов в экспланте. У многих видов и сортов-растений зона, свободная от 286 вирусных частиц, различна. Так, при клонировании апикальной меристемы картофеля размером 0,2 мм (конус нарастания с одним листовым зачатком) 70% полученных растений были свободны от Y- вируса картофеля, но только 10% — от Х-вируса. В некоторых случаях не удается найти оптимальное соотношение между размером меристематического экспланта и морфогенезом в нем, и при этом избавиться от вирусной инфекции. Приходится дополнять метод культуры меристем термо- или(и) химиотерапией. Так, предварительная термотерапия исходных растений позволяет получать свободные от вирусов растения-регенеранты из меристемных эксплантов размером от 0,3 мм до 0,8 мм. Вместе с тем этот прием может вызвать отставание растений в росте, деформацию органов, увеличение латентных (скрытых) инфекций. Хорошие результаты дает совместное применение метода куль- туры тканей и химиотерапии. При внесении в питательную среду препарата «Вирозол» (1-рибофуранозил-1,2,4-триазолкарбоксамид) количество безвирусных растений увеличивается до 80—100 %. В настоящее время для диагностики вирусных растений ис- пользуют иммуноферментную технику, моноклональные антитела, метод молекулярной гибридизации меченых фрагментов РНК- и ДНК-вироидов и вирусов с вирусами тестируемого объекта. Эти методы очень чувствительны, но трудоемки и дорогостоящи. После оздоровления с помощью вышеперечисленных технологий нормальные растения-регенеранты размножают обычными методами клонального микроразмножения. Для некоторых растений, например цитрусовых, получить морфогенез из меристем малого размера не удается, поэтому требуется разработка оригинальных методов. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножают, используя прививки меристем размером 0,14— 0,18 мм на пробирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого подхода состоит и в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенильных признаков, при этом цветение и плодоношение ускоряются. |