Главная страница

Методическое пособие по микробиологии. Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов пенза 2012 Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Общая микробиология


Скачать 446 Kb.
НазваниеУчебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов пенза 2012 Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Общая микробиология
АнкорМетодическое пособие по микробиологии.doc
Дата26.04.2017
Размер446 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файлаМетодическое пособие по микробиологии.doc
ТипУчебно-методическое пособие
#5934
страница4 из 5
1   2   3   4   5
Информационный материал.

Ген – структурная и функциональная единица наследственной информации, участок ДНК, контролирующий синтез определенного белка.

Геном - совокупность генов гаплоидного набора хромосом клетки.

Амплификация - увеличение числа копий генов / часто плазмид молекулярным весом / в клетке.

Элиминация - удаление генов из клетки / особенно плазмид под действием УФ, акридиловых красителей/.

Траспозоны - участки ДНК, способные к перемещению внутри молекулы и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.

Is – последовательности - нуклеотидные последовательности, не кодирующие выработку белка, а ответственные за встраивание транспозонов в молекулу ДНК.

Мутация - изменение генотипа.

Сексдуция - перенос фрагмента хромосомы F – фактора при конъюгации.

Трансдуцирующий фаг - умеренный фаг, который переносит бактериальные гены от донора к реципиенту.

Фактор компетенции - особый белок, создающий условия для трансформации в клетке.

Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей организации.

Особенности генетического аппарата бактерий:

а/ цитологические:

  1. Наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;

  2. В отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;

  3. В нуклеоиде нет ядрышек;

  4. В нуклеоиде одна хромосома;

  5. В бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида;

  6. Молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.

б/ молекулярные:

  1. Хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;

  2. Хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов;

  3. В ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных / минорных / азотистых оснований, или выполняют защитную функцию гистонов;

  4. ДНК бактерий содержит is – последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;

  5. Отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава:

Соотношение гуанина и цитозина /Г/Ц – индекс/ у бактерий имеет видовые отличия.

Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности / внехромосомная молекула ДНК, гены которой отвечают за ряд селективных свойств и способен к автономной репликации.

Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, is – последовательности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность / перенос, передачу/. Такие плазмиды называются трансмиссивными / конъюгативными/.

Основные свойства плазмид:

  1. Гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет;

  2. Плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу, чем хромосомная;

  3. Плазмиды способны к автономной репликации или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы;

  4. Для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации / многопийности/;

  5. Некоторые плазмиды /F, R – факторы/ способны находиться как в автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у которых F- фактор интегрирован с хромосомой, - H¦r – штаммы;

  6. Молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных;

  7. Некоторые физические /УФ, СВЧ и др./ и химические / акридиловые красители/ агенты вызывают алиминацию / удаление, потерю / плазмид;

  8. Плазмиду могут содержать tra – гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгурации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссионность /передача, перенос / плазмид может быть связан и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами;

  9. В клетке могут находится несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовместимости плазмид.

Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают:

  1. R – плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость;

  2. F – плазмиды – определяют пол бактерий;

  3. Col – плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов;

  4. Hlj - плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;

  5. Ert – плазмиды – детерминируют синтез энтеротоксина;

  6. Плазмиды биодегративные – обуславливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.

Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации /обмена генетической информации/ у бактерий.

У бактерий имеется 2 типа изменчивости: фенотипическая и генотипическая. Фенотипическая изменчивость (модификации)- это изменение внешних признаков, не затрагивающее генотип.

Фенотип- совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; фенотип определяется взаимодействием генотипа с условиями окружающей среды.

Генотипическая изменчивость затрагивает не только фенотип но и генотип - совокупность всех генов клетки.

Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются модификации: кратковременные / в пределах одного поколения/ и длительные/ сохраняются в поколениях/.
Отличия длительной модификации от мутации

  1. Отсутствие изменений в структурных генах генотипа;

  2. Приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;

  3. «Затухание» /исчезновение/ признака в ряду поколений.

Примером фенотипической изменчивости бактерий является диссоциация - расщепление признака при изменении условий культивирования: переход форм с гладкими колониями в Р – формы с шероховатыми колониями, потеря пигмента, появление неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т.д.

Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и рекомбинациями. /см. словарь основных терминов/.

Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуцированные известным мутагеном. По локализации различают: а/ генные – затрагивают один ген; б/ хромосомные – затрагивают группу генов; в/ плазмидные – затрагивают гены плазмид.

Механизм мутаций Вам известен. Это: а/ делеция потеря гена или участка ДНК; б/ дупликация – удвоение генетического фрагмента; в/ транспозиция – изменение положения гена; г/ инверсия – переворот участка ДНК на 180°; д/ вставка нового гена.

Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признакапрямая мутация или к его восстановлениюобратная мутация. Так как у бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.

Вторым механизмом генотипической изменчивости у бактерий являются рекомбинации. - перераспределение генетического материала родителей в потомстве / обмен генетического материала, приводящий к появлению новых сочетаний генов/.
Особенности рекомбинации у бактерии:

  1. Однонаправленность переноса генетической информации /от донора к рецепиенту/;

  2. Неодинаковое долевое участие генома и реципиента в образовании рекомбинанта /реципиентный геном полностью переходит к рекомбинанту, а от донора только отдельные гены, плазмиды/;

  3. В результате рекомбинации образуется мерозигота /частичная зигота/;

  4. Наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация, трасформация, трансдукция, слияние протопластов.


Механизмы рекомбинации:

  1. Конъюгация – перенос генетической информации при непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового процесса у бактерий. Поло у бактерий определяет F – плазмиды: в «мужских» клетках /F+/ она есть, в «женских» /F-/ - отсутствует.

Отличия f+ b f- клеток

  1. У F+ клеток есть дополнительная генетическая информация /F – фактор/;

  2. F+ клетки имеют на поверхности специальные ¦ - пили, обеспечивающие контакт при конъюгации;

  3. F+ клетки имеют дополнительный ¦i – антиген / белок ¦ - пилей/;

  4. F+ и F- клетки отличаются поверхностным зарядом;

  5. F+ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не адсорбируются на F- клетках;

  6. F+ клетки обладают свойствами донора/отдают генетическую информацию/, а F- клетки – свойствами реципиента /воспринимают генетическую информацию/. Как уже указывалось, рецепиентные клетки участвуют в образовании рекомбинанта всем своим геномом, а донор передает свою генетическую информацию лишь частично. Чаще это конъюгативные плазмиды, но H¦r – штаммы /см. словарь основных терминов/ передают с высокой частотой хромосомные гены при коньюгации.


II. Трансдукция – перенос генетической информации от донора к рецепиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трандуцирующий фагэто умеренный фаг, при который при индукции дизогенной культуры захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них эти гены.

При строгой специфичности локуса интеграция умеренного фага с хромосомой лизогенной клетки /например, для фага l - рядов с lас – опероном, для фага Р – рядов с trp – опероном и т.д./ при индукции захватываются и переносятся всегда строго определенные гены – это специфическая трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом – общая трансдукция. Захват случайных бактериальных геновы может происходить при сборке фагов или в том случае, каогда профаг не имеет строго определенного локуса в геноме бактерий.

Изменение свойств бактерий, инфицированных умеренным фагом, может происходить и под действием генов самого фага – явление фаговой, или лизогенной конверсии.

Отличия трансдукции от фаговой конверсии:

  1. Приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фага.

  2. Частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой конверсии.




  1. Трансформация – передача генетической информации при культивировании реципиента на среде с ДНК донора.

Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдельные фрагменты. Реципиенты клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой воспринять генетическую информацию, обнаруживается особый белок – фактор компетентности. Его действие связывают: а/ с повышением проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, б/ с ингибированием ДНК-аз, в/ с активированием синтеза и рестриктаз. Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Когда она активно строит свою ДНК, то в этот момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются условия для трансформации. In vitro эти условия создают искусственно.
Молекулярно-биологические методы идентификации

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода:

Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при которой происходит лизис клеток с выходом ДНК. Часть материала переносится в пробирку, содержащую смесь мононуклеотидов, ДНК-полимеразу и праймер – уникальную последовательность нуклеотидов, присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры ( 30 циклов) позволяет осуществить репликацию определенного возбудителя. Этот процесс называется амплификацией, в результате которого количество специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК могут быть выявлены с помощью электрофореза в агаровом геле. Преимуществами метода ПЦР являются:

  1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека.

  2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. Для повышения специфичности возможно определятьнесколько разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma urealyticum можно выявлять как ген 16S-RNA, так и ген уреазы. А для идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной ДНК и ДНК криптической плазмиды сталовозможным выявлять рибосомальную РНК (NASBA). Это значительно повышает достоверность исследования.

  3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования.

  1. Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.

  2. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.

Недостатки метода ПЦР

  1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПНР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.

  2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно-патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR).

3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей

ДНК зондирование.

Принцип метода: Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов – фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку ( радионуклид, фермент или флюорохром ) . Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими.

Сазернблоттгшг (гибридизация по Сазену) - выявление участка ДНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на мембране фрагментов искомой ДНК с мечеными комплементарными ДНК-зондами. Сначала с помощью гель-электрофореза разделяют фрагменты ДНК. После электрофореза гель переносят в щелочной раствор для получения из двунитевой ДНК однонитевых фрагментов. Затем фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны и гибридизируют со специфической меченой пробой ДНК (комплементарным олигонуклеотидным зондом, меченным радионуклидом или флюо-рохромом). Неспецифически связанные молекулы зонда отмывают­ся, а меченые участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография), на которой проявляются полосы меченого зонда ДНК. Зонды, меченные флюорохромом, вы­являют при помощи люминесцентной микроскопии. Нозернблоттинг применяют для выявления и гибридизации РНК (фрагментов РНК). В этом методе размер и количество специфических молекул и РНК определяются после обработки общей РНК или поли(А)РНК. Молекулы РНК выделяют гель-электрофорезом и переносят на иммобилизованную мембрану. Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой пробой.

ДНК- ДНК -гибридизация

ДНК-ДНК-гибридизация основана на денатурации, т.е. разделении двунитевой ДНК на отдельные нити в щелочной среде при температуре около 90 °С и последующем восстановлении (отжиге) двунитевой структуры с комплементарной меченой нитью ДНК (молекулярным зондом) при понижении температуры до 10-37 °С. Гибридизацию часто проводят на фильтрах (блот-гибридизация), или insitu. Молекулярный зонд с присоединенным биотином гиб-ридизируется на ДНК-мишени. После отжига и промывки на обра­зец наносят антибиотиновый конъюгат (стрептавидин, соединенный с щелочной фосфатазой) и проводят специфическое окрашивание клеток. Стрептавидин можно метить, кроме щелочной фосфатазы, флюорохромами. Стрептавидин с меткой избирательно связывается биотином, что выявляется при микроскопии. Так выявляют локали­зацию микробов в ткани, хромосомные аномалии в клетках и т.д.

Риботипирование

Риботипирование - выявление количественных различий по рибосомным оперонам и нуклеотидным последовательностям. Про­водят гидролиз ДНК, которую разделяют в агарознок; геле и затем гибридизируют с ДНК-зондами на один или более генов, кодирую­щих 16S-, 23S-, 58-рибосомные РНК. Бактерии можно типировать по серотипу, фаготипу и по риботипу. Методически сходно с рибо-типированием IS-типирование: проводят сравнительный анализ числа копий IS-элементов и рестрикционного разнообразия нуклеотидных последовательностей различных штаммов микробов.

1   2   3   4   5


написать администратору сайта