Методическое пособие по микробиологии. Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов пенза 2012 Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Общая микробиология

• Название: Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов пенза 2012 Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Общая микробиология
• Анкор: Методическое пособие по микробиологии.doc
• Дата: 26.04.2017
• Размер: 446 Kb.
• Имя файла: Методическое пособие по микробиологии.doc
• Тип: Учебно-методическое пособие; #5934
• страница: 4 из 5

Информационный материал.

Ген – структурная и функциональная единица наследственной информации, участок ДНК, контролирующий синтез определенного белка.

Геном - совокупность генов гаплоидного набора хромосом клетки.

Амплификация - увеличение числа копий генов / часто плазмид молекулярным весом / в клетке.

Элиминация - удаление генов из клетки / особенно плазмид под действием УФ, акридиловых красителей/.

Траспозоны - участки ДНК, способные к перемещению внутри молекулы и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.

Is – последовательности - нуклеотидные последовательности, не кодирующие выработку белка, а ответственные за встраивание транспозонов в молекулу ДНК.

Мутация - изменение генотипа.

Сексдуция - перенос фрагмента хромосомы F – фактора при конъюгации.

Трансдуцирующий фаг - умеренный фаг, который переносит бактериальные гены от донора к реципиенту.

Фактор компетенции - особый белок, создающий условия для трансформации в клетке.

Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей организации.

Особенности генетического аппарата бактерий:

а/ цитологические:

1. 
   Наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;
   
2. 
   В отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;
   
3. 
   В нуклеоиде нет ядрышек;
   
4. 
   В нуклеоиде одна хромосома;
   
5. 
   В бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида;
   
6. 
   Молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.
   

б/ молекулярные:

1. 
   Хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;
   
2. 
   Хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов;
   
3. 
   В ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных / минорных / азотистых оснований, или выполняют защитную функцию гистонов;
   
4. 
   ДНК бактерий содержит is – последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;
   
5. 
   Отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава:
   

Соотношение гуанина и цитозина /Г/Ц – индекс/ у бактерий имеет видовые отличия.

Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности / внехромосомная молекула ДНК, гены которой отвечают за ряд селективных свойств и способен к автономной репликации.

Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, is – последовательности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность / перенос, передачу/. Такие плазмиды называются трансмиссивными / конъюгативными/.

Основные свойства плазмид:

1. 
   Гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет;
   
2. 
   Плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу, чем хромосомная;
   
3. 
   Плазмиды способны к автономной репликации или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы;
   
4. 
   Для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации / многопийности/;
   
5. 
   Некоторые плазмиды /F, R – факторы/ способны находиться как в автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у которых F- фактор интегрирован с хромосомой, - H¦r – штаммы;
   
6. 
   Молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных;
   
7. 
   Некоторые физические /УФ, СВЧ и др./ и химические / акридиловые красители/ агенты вызывают алиминацию / удаление, потерю / плазмид;
   
8. 
   Плазмиду могут содержать tra – гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгурации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссионность /передача, перенос / плазмид может быть связан и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами;
   
9. 
   В клетке могут находится несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовместимости плазмид.
   

Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают:

1. 
   R – плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость;
   
2. 
   F – плазмиды – определяют пол бактерий;
   
3. 
   Col – плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов;
   
4. 
   Hlj - плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;
   
5. 
   Ert – плазмиды – детерминируют синтез энтеротоксина;
   
6. 
   Плазмиды биодегративные – обуславливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.
   

Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации /обмена генетической информации/ у бактерий.

У бактерий имеется 2 типа изменчивости: фенотипическая и генотипическая. Фенотипическая изменчивость (модификации)- это изменение внешних признаков, не затрагивающее генотип.

Фенотип- совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; фенотип определяется взаимодействием генотипа с условиями окружающей среды.

Генотипическая изменчивость затрагивает не только фенотип но и генотип - совокупность всех генов клетки.

Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются модификации: кратковременные / в пределах одного поколения/ и длительные/ сохраняются в поколениях/.
Отличия длительной модификации от мутации

1. 
   Отсутствие изменений в структурных генах генотипа;
   
2. 
   Приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;
   
3. 
   «Затухание» /исчезновение/ признака в ряду поколений.
   

Примером фенотипической изменчивости бактерий является диссоциация - расщепление признака при изменении условий культивирования: переход форм с гладкими колониями в Р – формы с шероховатыми колониями, потеря пигмента, появление неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т.д.

Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и рекомбинациями. /см. словарь основных терминов/.

Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуцированные известным мутагеном. По локализации различают: а/ генные – затрагивают один ген; б/ хромосомные – затрагивают группу генов; в/ плазмидные – затрагивают гены плазмид.

Механизм мутаций Вам известен. Это: а/ делеция – потеря гена или участка ДНК; б/ дупликация – удвоение генетического фрагмента; в/ транспозиция – изменение положения гена; г/ инверсия – переворот участка ДНК на 180°; д/ вставка нового гена.

Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признака – прямая мутация или к его восстановлению – обратная мутация. Так как у бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.

Вторым механизмом генотипической изменчивости у бактерий являются рекомбинации. - перераспределение генетического материала родителей в потомстве / обмен генетического материала, приводящий к появлению новых сочетаний генов/.
Особенности рекомбинации у бактерии:

1. 
   Однонаправленность переноса генетической информации /от донора к рецепиенту/;
   
2. 
   Неодинаковое долевое участие генома и реципиента в образовании рекомбинанта /реципиентный геном полностью переходит к рекомбинанту, а от донора только отдельные гены, плазмиды/;
   
3. 
   В результате рекомбинации образуется мерозигота /частичная зигота/;
   
4. 
   Наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация, трасформация, трансдукция, слияние протопластов.
   

Механизмы рекомбинации:

1. 
   Конъюгация – перенос генетической информации при непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового процесса у бактерий. Поло у бактерий определяет F – плазмиды: в «мужских» клетках /F⁺/ она есть, в «женских» /F^-/ - отсутствует.
   

Отличия f⁺ b f^- клеток

1. 
   У F⁺ клеток есть дополнительная генетическая информация /F – фактор/;
   
2. 
   F⁺ клетки имеют на поверхности специальные ¦ - пили, обеспечивающие контакт при конъюгации;
   
3. 
   F⁺ клетки имеют дополнительный ¦i – антиген / белок ¦ - пилей/;
   
4. 
   F⁺ и F^- клетки отличаются поверхностным зарядом;
   
5. 
   F⁺ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не адсорбируются на F- клетках;
   
6. 
   F⁺ клетки обладают свойствами донора/отдают генетическую информацию/, а F^- клетки – свойствами реципиента /воспринимают генетическую информацию/. Как уже указывалось, рецепиентные клетки участвуют в образовании рекомбинанта всем своим геномом, а донор передает свою генетическую информацию лишь частично. Чаще это конъюгативные плазмиды, но H¦r – штаммы /см. словарь основных терминов/ передают с высокой частотой хромосомные гены при коньюгации.
   

II. Трансдукция – перенос генетической информации от донора к рецепиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трандуцирующий фаг – это умеренный фаг, при который при индукции дизогенной культуры захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них эти гены.

При строгой специфичности локуса интеграция умеренного фага с хромосомой лизогенной клетки /например, для фага l - рядов с lас – опероном, для фага Р – рядов с trp – опероном и т.д./ при индукции захватываются и переносятся всегда строго определенные гены – это специфическая трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом – общая трансдукция. Захват случайных бактериальных геновы может происходить при сборке фагов или в том случае, каогда профаг не имеет строго определенного локуса в геноме бактерий.

Изменение свойств бактерий, инфицированных умеренным фагом, может происходить и под действием генов самого фага – явление фаговой, или лизогенной конверсии.

Отличия трансдукции от фаговой конверсии:

1. 
   Приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фага.
   
2. 
   Частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой конверсии.
   

3. 
   Трансформация – передача генетической информации при культивировании реципиента на среде с ДНК донора.
   

Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдельные фрагменты. Реципиенты клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой воспринять генетическую информацию, обнаруживается особый белок – фактор компетентности. Его действие связывают: а/ с повышением проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, б/ с ингибированием ДНК-аз, в/ с активированием синтеза и рестриктаз. Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Когда она активно строит свою ДНК, то в этот момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются условия для трансформации. In vitro эти условия создают искусственно.
Молекулярно-биологические методы идентификации

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода:

Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при которой происходит лизис клеток с выходом ДНК. Часть материала переносится в пробирку, содержащую смесь мононуклеотидов, ДНК-полимеразу и праймер – уникальную последовательность нуклеотидов, присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры ( 30 циклов) позволяет осуществить репликацию определенного возбудителя. Этот процесс называется амплификацией, в результате которого количество специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК могут быть выявлены с помощью электрофореза в агаровом геле. Преимуществами метода ПЦР являются:

1. 
   Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека.
   
2. 
   Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. Для повышения специфичности возможно определятьнесколько разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma urealyticum можно выявлять как ген 16S-RNA, так и ген уреазы. А для идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной ДНК и ДНК криптической плазмиды сталовозможным выявлять рибосомальную РНК (NASBA). Это значительно повышает достоверность исследования.
   
3. 
   Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования.
   

4. 
   Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.
   
5. 
   Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.
   

Недостатки метода ПЦР

1. 
   Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПНР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.
   
2. 
   Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно-патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR).
   

3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей

ДНК зондирование.

Принцип метода: Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов – фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку ( радионуклид, фермент или флюорохром ) . Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими.

Сазернблоттгшг (гибридизация по Сазену) - выявление участка ДНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на мембране фрагментов искомой ДНК с мечеными комплементарными ДНК-зондами. Сначала с помощью гель-электрофореза разделяют фрагменты ДНК. После электрофореза гель переносят в щелочной раствор для получения из двунитевой ДНК однонитевых фрагментов. Затем фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны и гибридизируют со специфической меченой пробой ДНК (комплементарным олигонуклеотидным зондом, меченным радионуклидом или флюо-рохромом). Неспецифически связанные молекулы зонда отмывают­ся, а меченые участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография), на которой проявляются полосы меченого зонда ДНК. Зонды, меченные флюорохромом, вы­являют при помощи люминесцентной микроскопии. Нозернблоттинг применяют для выявления и гибридизации РНК (фрагментов РНК). В этом методе размер и количество специфических молекул и РНК определяются после обработки общей РНК или поли(А)РНК. Молекулы РНК выделяют гель-электрофорезом и переносят на иммобилизованную мембрану. Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой пробой.

ДНК- ДНК -гибридизация

ДНК-ДНК-гибридизация основана на денатурации, т.е. разделении двунитевой ДНК на отдельные нити в щелочной среде при температуре около 90 °С и последующем восстановлении (отжиге) двунитевой структуры с комплементарной меченой нитью ДНК (молекулярным зондом) при понижении температуры до 10-37 °С. Гибридизацию часто проводят на фильтрах (блот-гибридизация), или insitu. Молекулярный зонд с присоединенным биотином гиб-ридизируется на ДНК-мишени. После отжига и промывки на обра­зец наносят антибиотиновый конъюгат (стрептавидин, соединенный с щелочной фосфатазой) и проводят специфическое окрашивание клеток. Стрептавидин можно метить, кроме щелочной фосфатазы, флюорохромами. Стрептавидин с меткой избирательно связывается биотином, что выявляется при микроскопии. Так выявляют локали­зацию микробов в ткани, хромосомные аномалии в клетках и т.д.

Риботипирование

Риботипирование - выявление количественных различий по рибосомным оперонам и нуклеотидным последовательностям. Про­водят гидролиз ДНК, которую разделяют в агарознок; геле и затем гибридизируют с ДНК-зондами на один или более генов, кодирую­щих 16S-, 23S-, 58-рибосомные РНК. Бактерии можно типировать по серотипу, фаготипу и по риботипу. Методически сходно с рибо-типированием IS-типирование: проводят сравнительный анализ числа копий IS-элементов и рестрикционного разнообразия нуклеотидных последовательностей различных штаммов микробов.