Методическое пособие по микробиологии. Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов пенза 2012 Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Общая микробиология
 Скачать 446 Kb.
|
|
Обмен веществ (метаболизм) - совокупность процессов превращения веществ и энергии, направленных на сохранение и воспроизведение жизни. Уровень метаболизма микробной клетки выше, чем у других организмов. Обмен веществ объединяет два процесса: пластический обмен (анаболизм, ассимиляция) и энергетический обмен (катаболизм, диссимиляция,). Пластический обмен – это конструктивный метаболизм, при котором происходят реакции синтеза молекул клетки микроорганизма, обеспечивает усвоение веществ из окружающей среды, используемых для построения клеточных структур.Эта работа требует энергии, которую клетки получают в результате энергетического обмена. Энергетический обмен – расщепление питательных веществ (белков, углеводов, липидов и др.). Эти процессы могут происходить в аэробных или анаэробных условиях. Катаболизм и анаболизм взаимосвязаны. У микробной клетки соотношение поверхности к массе очень высоко по сравнению с другими организмами. Микробные клетки обладают огромным набором ферментов. Биохимическая идентификация. . Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции: Ферментацию – неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов. Окисление- полное расщепление субстрата до углекислого газа и воды. Утилизацию – использование субстрата для роста. Диссимиляцию субстрата. Гидролиз субстрата. Традиционный метод идентификации по биохимическим свойствам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Определение сахаролитической активности. 1. Определение биохимической активности с помощью посева на среды «пестрого ряда». Короткий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гиса с моно- и дисахаридами, глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный «пестрый ряд» кроме перечисленного входят среды с арабинозой, ксилозой, галактозой, глицерином и т. д. Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор Андреде, позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления и «поплавок» для обнаружения газа. 2. Определение биохимической активности на среде Клиглера. Среда Клиглера предназначена для определения ферментации глюкозы, лактозы, выделения сероводорода и выделения газа. Разливается в пробирки и скашивается наполовину. Незасеянная среда Клиглера имеет красный цвет. Если после инкубации скошенная часть среды меняет цвет с красного на желтый, происходит ферментация лактозы, если столбик агара меняет цвет с красного на желтый – происходит ферментация глюкозы. Если в столбике агара наблюдается почернение – выделяется сероводород и происходит ферментация глюкозы. Если в среде наблюдаются пузырьки газа, следовательно в процессе ферментации выделяется газ. Определение протеолитических свойств микроорганизмов. Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры на мясо-пептонную желатину, которую инкубируют при комнатной температуре несколько дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин. При разрушении белков может выделятся аммиак, индол или сероводород. Реакция на аммиак. Применяют полоску фильтровальной бумаги пропитанной индикатором. При положительном результате бумага синеет. Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий добавляют несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола на поверхности появляется розовое кольцо. Реакция на сероводород. Можно использовать фильтровальную бумагу с сульфатом железа. При выделении сероводорода бумага окрашивается в черный цвет. Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят 1-2 капли раствора пероксида водорода и вносят нее петлю с исследуемой культурой. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии каталазы. Определение биохимической активности микроорганизмов с использованием Системы индикаторных бумаг (СИБы) Принцип действия: диски из фильтровальной бумаги, пропитанные питательными средами (питательная среда + субстрат+индикатор) и высушенные, хранятся во флаконах. В лаборатории диски раскладываются в стерильные пробирки и заливаются суспензией исследуемой культуры в физрастворе. Учет проводят после 18-24 часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора. Определение биохимической активности микроорганизмов с использованием Панелей биохимической идентификации. Принцип действия: в лунках специальных пластиковых панелей находятся соответствующие высушенные среды (питательная основа+субстрат+индикатор). В лаборатории в лунки вносят суспензию исследуемой культуры и после инкубации (5-24 часа) учитывают результат по изменению цвета индикатора. Примеры: Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий, панель биохимической дифференцировки стафилококков. Системы автоматизированной идентификации. Принцип действия тот же, что и в предыдущем пункте. Но инкубация панелей, учет результатов и идентификация проводятся при помощи компьютера. Методические указания: Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". 1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда". 2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше. 3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; 4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. 5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом». Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью среды Клиглера 1. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей на среду Клиглера 2. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч. 3. В том случае, если бактерии ферментируют лактозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области скошенной части. 4. В том случае, если бактерии ферментируют глюкозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области «столбика». 5. В том случае, если бактерии выделяют сероводород, наблюдается изменение цвета среды с красного на черный в области «столбика». 6. При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа в толще среды. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Контрольные вопросы: 1.Для чего проводится идентификация микроорганизмов? 2. Какие методы идентификации наиболее часто применяются в современных бактериологических лабораториях? 3. Для чего применяется «пестрый ряд» и каков его состав? 4. Что такое протеолитические свойства? Каким образом можно их определить? 5. Что такое СИБы? Для идентификации каких бактерий их применяют? Список литературы: Обязательная:
Дополнительная:
Занятие № 6 Физиология микроорганизмов. Дыхание микроорганизмов. Анаэробы. Методы культивирования. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Дезинфекция. Стерилизация. Цель: Изучить принципы создания сред для анаэробов и методы их культивирования, основные методы стерилизации и дезинфекции и оборудование, применяемое для этого. Знать: Особенности дыхания микроорганизмов, основные методы выделения чистых культур анаэробов, состав питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, способы контроля дезинфекции и стерилизации. Уметь: Описывать культуральные свойства анаэробных бактерий и уметь выбрать способ дезинфекции и стерилизации в зависимости от свойств объекта. Обоснование темы: Анаэробы являются возбудителями многих заболеваний, для их диагностики требуются специфические методы культивирования. Вопросы для самоподготовки: 1.Дыхательные цепи микроорганизмов. 2.Классификация микроорганизмов по типу дыхания. 3.Особенности питательных сред для анаэробов. 4. Создание условий для культивирования анаэробов. 5. Методы выделения чистой культуры анаэробов. 6. Стерилизация и дезинфекция. 7. Контроль качества дезинфекции и стерилизации. ПЛАН Программа: 1. Изучение питательных сред для анаэробов: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера, молоко по Тукаеву. 2. Описание культуральных свойств анаэробов. 3. Изучение способов создания анаэробных условий. 4. Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации. 5. Методы дезинфекции. 6. Методы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции. Демонстрация: 1. Питательные среды – среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера. 2.Варианты роста анаэробов на этих питательных средах. 3. Эксикатор, анаэростат. 4. Аппаратура, применяемая для стерилизации. Задание студентам: 1. Зарисовать и записать состав и назначение питательных сред: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, молоко по Тукаеву, агар Цейсслера. 2. Описать особенности роста анаэробов на питательных средах. 3. Учесть результаты опытов, поставленных с целью контроля стерилизации. Сделать заключение. Заполнить таблицу: Методы контроля режима стерилизации. 4. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-излучения на стафилококки. 5. Заполнить таблицу: Основные методы дезинфекции и контроля качества дезинфекции. 6. Оценить результаты посева материала на скошенный МПА. Информационный материал. Питательные среды для выращивания анаэробов: Среда Вильсон-Блер (железосульфитный агар) готовиться из питательного агара, к которому добавляется глюкоза, сульфит натрия, хлорид железа (2). Анаэробные клостридии на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия в сульфид, который, соединяясь с хлоридом железа, дает черный осадок. Среда Китта-Тароцци. Состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла. Тиогликолевый бульон с гемином (элективная среда для культивирования неспорообразующих анаэробов). Состоит из гемина, гидролизата казеина, глюкозы, цистеина, сульфата натрия, хлорида натрия, тиогликолата натрия. Сахарно-кровяной агар Цейсслера. Состоит из питательного агара, 1-2 % глюкозы, дефибринированной крови. Среда Вейнберга. Состоит из питательного агара, печени, фосфата натрия, 0,5 % глюкозы, хлористоводородной кислоты. Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»—бесплодный)– полное уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование, прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы стерилизации 1. Физические методы. Существуют различные способы стерилизации при помощи высокой температуры 1. Прокаливание на огне - фламбирование (спиртовка) — применяется для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, предметных стекол, пинцетов. 2. Кипячение применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40 минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы. 3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера. Сегодня для этой цели применяются сухожаровые шкафы различных марок. Простейшая печь Пастера состоит из металлической емкости с двойными стенками, оборудованной термометром для контроля температуры и нагревательным элементом. Приготовленный соответствующим образом материал ставят в печь и стерилизуют в течение 45 минут при температуре 165—170°. Пробирки, колбы, флаконы закрывают ватными пробками. 4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100—120°. Различают: 1) стерилизация паром под давлением, 2) стерилизация текучим паром. Стерилизация паром под давлением — основана на том, что образующийся пар не выходит наружу, а скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. Соответственно давлению повышается и температура кипения воды; при повышении давления на 1 атм. температура кипения будет равна 120°, при повышении давления на 2 атм.— 134,18° и т. д. При такой температуре микроорганизмы и их споры погибают очень быстро (при 120° в течение 15—20 минут). Этим способом стерилизации пользуются для обеспложивания питательных сред, лабораторной посуды, металлических и стеклянных инструментов, для обеззараживания инфекционного материала . Стерилизация паром под давлением производится в автоклавах. На сегодняшний день это самый распространенный способ стерилизации в бактериологической практике Автоклав представляет, собой металлическую цилиндрическую емкость с толстыми двойными стенками и с герметически закрывающейся массивной крышкой. Автоклав оборудован манометром и термометром для контроля давления и температуры. Под дном автоклава находятся нагревательные элементы. Стерилизуемые предметы помещают внутрь емкости и герметично закрывают крышку, начинается повышение давления и температуры. Стерилизация текучим паром производится в аппарате Коха (рис. 38), представляющем собой высокий металлический цилиндр, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно аппарата наливают воду, подогреваемую снизу до кипения. Образующийся пар выделяется через края неплотно закрытой крышки. Стерилизацию производят в течение 30—40 минут с момента выделения пара. Стерилизацию текучим паром можно производить также и в автоклаве; в таком случае крышка автоклава остается незавинченной, а выпускной кран открытым. Текучим паром стерилизуют предметы, портящиеся от действия высокой температуры (питательные среды). Однократная обработка текучим паром не обеспечивает полной стерилизации, так как при температуре в 100° гибнут вегетативные формы, но не споры бактерий. Полное обеспложивание при помощи текучего пара достигается при повторной (дробной) стерилизации. Дробная стерилизация. Дробной стерилизации подвергаются материалы, не переносящие температуры выше 100° (желатина, молоко, питательные среды с углеводами). При температуре в 100°погибают вегетативные формы бактерий, затем дают оставшимся спорам прорасти в вегетативные формы и через сутки снова стерилизуют материал при 100°. Оставшимся спорам снова дают прорасти и через сутки снова стерилизуют материал при 100°, добиваясь таким образом 100% стерилизации Тиндализация представляет собой дробную стерилизацию при низкой температуре, предложенную Тиндалем для объектов, не переносящих температуры в 100°. Их подвергают нагреванию в течение 5—6 дней подряд при более низкой температуре ( 56—60°) по 1 часу ежедневно. Тиндализация производится или на водяной бане, или в специальных приборах с терморегуляторами. Пастеризация. Метод предложен Пастером для частичной стерилизации жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры), используется при температурной обработке продуктов питания(соки, молоко, вино ). Способ основан на том, что при нагревании жидкости до 50—60° в течение 15—30 минут или до 70—80° в течение 5—10 минут погибает большинство бесспоровых микробов, а споры остаются жизнеспособными. Поэтому необходимым условием является упаковка и охлаждение пастеризованного продукта. В бактериологической практике пастеризация при 90° применяется для разделения споровых и бесспоровых видов бактерий. 5. Обработка материалов рентгеновскими, ультрафиолетовыми, γ-лучами Радиационный метод стерилизации используется для стерилизации изделий медицинского назначения одноразового применения (одноразовые чашки Петри) Стерилизация ультрафиолетовым облучением используется для стерилизации воздуха помещений медицинского назначения, сложных изделий медицинского назначения (искусственный клапан сердца и т.д.) 2. Механические методы стерилизации. Стерилизация фильтрованием. Применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию (сыворотки, белковые лекарственные вещества и т. д.). Для этой цели применяются фильтры тонкой очистки из мелкопористых веществ. Они готовятся в виде цилиндрических свечей (фильтр Шамберлана, Берке-Фельда) или асбестовых пластинок (фильтр Зeйтца). Фильтрование производится под повышенным давлением, вследствие чего жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник, или же создается разрежение в приемнике и тогда жидкость всасывается в него через фильтр. Поэтому к фильтрующему прибору присоединяется или нагнетающий, или разрежающий насос. Наиболее простым способом является фильтрование с помощью водоструйного насоса: в приемнике создается отрицательное давление и жидкость всасывается через фильтр. Стерильность профильтрованной жидкости проверяется путем ее посева на питательную среду - посев остается стерильным. 3. Химические методы. Методы основаны на обработке оборудования химическими веществами, обладающими бактерицидными свойствами. Применяются при стерилизации приборов и материалов, чувствительным к высоким температурам. Дезинфекция – мероприятия, направленные на уничтожение или снижение численности микроорганизмов. Для дезинфекции применяют физические и химические методы. Механические методы – влажная уборка. Физические методы: кипячение, сжигание трупов. Химические методы: методы с использованием веществ, обладающих антисептическими свойствами (дезинфектантов) Классификация дезинфектантов 1. галогенсодержащие дезинфектанты (имеют в своем составе галогены) — препараты йода (спиртовой раствор йода, раствор Люголя, йодоформ, йодинол, йодопирин), хлора (хлорамины, хлориты); 2. перекисные соединения - перекись водорода, пергидроль (30% водный раствор перекиси водорода) дезоксон-1 и др. 3. кислоты и их соли - борная, салициловая, тетраборат натрия, калия перманганат, щелочи - аммиак и его соли, бура; 4. спирты - 70°—80° этанол и др.; 5. альдегиды - формальдегид, гексаметилен-тетрамин, бетапропиолактон; 6. детергенты - декамин, хлоргексидин, этоний и др. 7. поверхностно-активные вещества, относящиеся к четвертичным аммониевым соединениям и амфолитам (ниртан, амфолан и др.) 8. производные 8-оксихинолина - хинозол, интестопан, нитроксолин, 4-хинолона - оксолиновая кислота, хиноксалина - хиноксилин, диоксидин; 9. производные нитрофурана - фурацилин, фурагин, фуразолидон; 10. производные фенола - трикрезол, фенилрезорцин, фенилсалицилат; 11. дегти - деготь березовый, ихтиол и др.; 12. красители - бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, этакридина лактат; 13. соединения тяжелых металлов - дихлорид ртути, нитрат серебра, колларгол, протаргол, сульфат цинка. 14. газовая смесь из оксида этилена с метилбромидом Методические указания: 1. Схема описания культуральных свойств микроорганизмов: 1.Форма колонии 2.Размер колонии 3.Цвет 4.Характер края 5.Характер поверхности 6. Консистенция 2.Окраска по методу Грама:
6. Промыть водой. 7. Высушить с помощью полоски фильтровальной бумаги 3. Таблица. Основные методы дезинфекции и контроля качества дезинфекции.
4.Таблица. Методы контроля режима стерилизации.
Контрольные вопросы: 1.Для чего проводится стерилизация? 2. Какие методы дезинфекции наиболее часто применяются в современных условиях? 3. Для чего питательные среды для анаэробов заливают сверху вазелиновым маслом? 4. Какие биологические методы создания анаэробных условий Вам известны? 5. Как проводится контроль стерильности? Список литературы: Обязательная:
Дополнительная:
Занятие № 7 Антагонизм микробов и антибиотики. Цель: Научиться проводить качественную и количественную оценку чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Познакомиться с принципами рациональной химио- и антибиотикотерапии. Знать: Определение понятия «антибиотики», их классификация, механизм действия, применение, получение, основные методы определения антибиотикорезистентности. Уметь: осуществлять постановку диффузионного теста на антибиотикорезистентность и учитывать его результаты. Обоснование темы: Уничтожение патогенных для человека микробов является одной из важнейших проблем в профилактике и лечении различных заболеваний. Для борьбы с микробами используют методы антимикробной терапии. Каждый метод имеет свои особые цели и условия применения. Вопросы для самоподготовки: 1.Антибиотики, их классификация. 2.Антимиробный спектр и методы его определения. 3Практическое применение антибиотиков. Понятие о химиотерапии 4. Принципы рациональной антибиотикотерапии. 5. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, механизмы ее формирования. 6. Методы определения антибиотикорезистентности. ПЛАН Программа: 1. Методы выявления антагонизма у бактерий. 2. Методы постановки тестов на антибиотикорезистентность. 3. Диффузионный тест, особенности его постановки 4. Учет результатов диффузионного теста. 5. Принципы рациональной антибиотикотерапии. Демонстрация: 1. Результат постановки диффузионного теста. 2. Опыт по бактериоцинотипированию. 3. Аптимикробные препараты. 4. Тест с ТТХ. 5. Тест с использованием метода серийных разведений. Задание студентам: 1.Учесть результаты опыта по бактериоцинотипированию. 2.Заполнить таблицу: 3. Описать постановку диффузионного теста на антибиотикорезистентность, осуществить постановку теста и учесть результаты. Заполнить таблицу:
4. Отметить достоинства и недостатки данного метода 5. Учесть результаты теста на антибиотикорезистентность методом серийных разведений. Информационный материал В природных условиях различные виды микроорганизмов живут в ассоциациях, оказывая взаимное влияние друг на друга, зависящее свойств микробов и от окружающих условий. Одной из форм взаимодействия микробов является антагонизм. Антагонизм - взаимоотношения между микроорганизмами, которые проявляются в бактериостатическом или бактериоцидном действии друг на друга (задержка развития и гибели микроорганизмов, на которых микроб-антагонист оказывает свое действие) Явление антагонизма в мире микробов известно давно (Мечников); антагонизм наблюдается среди многочисленных групп микробов и в настоящее время широко используется в медицинской практике в виде применения антибиотиков для лечения и профилактики инфекционных болезней. Антагонисты обнаруживаются в почве, воздухе, воде. При посеве исследуемого материала или смесей микробов присутствие микробов-антагонистов обнаруживается по светлым зонам, окружающим их колонии; эти зоны свидетельствуют о подавлении роста угнетаемого микроба, причем величина зоны угнетения определяет ту или иную степень активности антагониста. 1. Чашку с мясо-пептонным агаром равномерно засевают шпателем суточной бульонной культурой угнетаемого микроба (например, стафилококка). Затем из чашки с агаром, предварительно засеянной антагонистом (например, актиномицетом), вырезают вместе с агаром колонию антагониста и накладывают на первую засеянную чашку (колонией кверху). Эту чашку ставят в термостат при 37°. Результат учитывают через сутки — образуется стерильная зона. 2. На чашку с мясо-пептонным агаром посредине широкой полосой засевают суточную бульонную культуру антагониста (например, В. coli M-17). Через сутки перпендикулярно к посеву вплотную подсевают суточную бульонную культуру угнетаемого микроба (стафилококк, шигелла). Результат учитывают через сутки пребывания в термостате — рост угнетаемого микроба отступает от полосы, засеянной антагонистом. Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности микроорганизмов, обладающие активностью по отношению к определенным организмам – бактериям, грибам, актиномицетам. Антибиотики задерживают либо подавляют их рост. Существует несколько классификаций, основанных на разных признаках и свойствах антибиотических препаратов. Основные классификации следующие: По происхождению; по химической структуре; по механизму действия; по спектру действия; по конечному эффекту. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют различными методами. Наиболее распространены следующие. Метод серийных разведений. Готовят основной раствор препарата, содержащий определенное количество единиц. Затем в ряд пробирок наливают 1 мл. МПБ. В первую пробирку последовательно переносят по1 мл. основного раствора препарата, затем во 2-ю, 3-ю и т.д.при этом каждое следующее разведение содержит вдвое меньше антибиотика, чем в предыдущем разведении. Затем в каждую пробирку вносят одинаковое количество испытуемой культуры. Контролем являются 2 пробирки. В одной из них МПБ и микроорганизм, в другой МПБ и антибиотик. Посевы инкубируют 18-24 ч. в термостате. Минимальная концентрация антибиотика, при которой не проявляется размножение бактерий, называется бактериостатической дозой. Метод дисков. На поверхность питательной среды (АГВ) в чашки Петри засевают «газоном» исследуемую культуру микроорганизмов. Посев проводят, затем на поверхность посева на расстоянии друг от друга накладывают бумажные диски одинакового диаметра, пропитанные различными антибиотиками. Посевы выдерживают в термостате в течение суток. Вокруг дисков образуется зоны задержки роста. Ее измеряют и делают вывод об антиботической активности препарата. Если диаметр зоны задержки роста до11мм, микроорганизм устойчив к действию данного антибиотика, если составляет от 11 до 15 мм, микроорганизм считается умеренно устойчивым, от 15 до 25мм – чувствителен, и свыше 25 – высоко чувствителен. Методические указания: Таблица:Принципы классификации микроорганизмов.
Методика посева методом бактериального «газона»: 1.Приготовить 2 мл. взвеси исследуемой культуры. 2. Вылить 1 мл. взвеси на поверхность питательной среды при помощи пипетки. 3. «Прокачать» чашку Петри для равномерного распределения материала по поверхности среды. 4. Убрать избыток жидкости с поверхности среды при помощи пипетки. 5. Пипетку с оставшейся взвесью поместить в дезраствор. Оценка действия на бактерии антимикробных препаратов методом дисков. 1.Исследуемую культуру засевают газоном на чашку Петри с плотной питательной средой (чаще всего на МПА). 2.На засеянную поверхность среды сразу же раскладывают (не более 6 на чашку) стандартные бумажные диски, содержащие антибиотики (30 мкг). Каждый диск маркирован тремя буквами от названия соответствующего антибиотика. 3.Засеянные чашки помещают в термостат. 4.Через 24 часа учитывают результат, измеряя диаметр зоны задержки роста. Чувствительность культуры к антибиотику определяют по таблице, но ориентировочно можно считать: до 12 мм - устойчив, до 20 – умеренно устойчив, более 20 - чувствителен. Контрольные вопросы: 1.Что такое антибиотики? Какова история их открытия? 2. На чем основан механизм действия пенициллинов? 3. Дайте характеристику диффузионному методу постановки теста на антибиотикорезистентность. Назовите его достоинства и недостатки. 4. Каковы требования к антимикробным препаратам? 5. Какие осложнения могут вызывать антибиотики? Список литературы: Обязательная:
Дополнительная:
Занятие №8 Бактериофагия. Цель: Изучить методы выделения, идентификации и титрования бактериофагов. Познакомиться с принципами применения препаратов бактериофагов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Знать: Строение бактериофагов, их классификацию, их основные свойства. Определение понятий фагопрофилактика, фаготипирование, фаготерапия, фагодифференцировка. Уметь: осуществлять постановку опыта по фаготипированию, фагодифференцировке, учитывать их результаты. Обоснование темы: Фаготипирование является одним из методов идентификации микроорганизмов. Бактериофаги нашли широкое применение для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Вопросы для самоподготовки: 1.Строение бактериофага, его морфологические группы. 2.Свойства бактериофагов. 3. Этапы взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой. 4. Феномен роста бактериофага на плотной и жидкой питательной среде. 5. Качественные пробы на бактериофаг. 6.Способы титрования бактериофагов. 7 Применение бактериофагов в медицине. ПЛАН Программа: 1.Методы выделения бактериофага из окружающей среды и их идентификация. 2.Метод титрования бактериофага по Грациа 3. Метод определения лизогенных бактерий. 4.Метод фаготипирования стафилококков. 5.Качественный проба на бактериофаг по Отто. Демонстрация: 1. Методы выделения фага из внешней среды. 2. Фаготипирование микроорганизмов. Задание студентам: 1.Учесть результаты опыта по фаготипированию. 2. Описать постановку качественной пробы на бактериофаг по Отто, поставить его и учесть результаты. 3.Учесть результаты количественного теста на определение бактериофаг. Информационный материал. Культивирование вирусов
В настоящее время лабораторные животные применяются сравнительно редко для выделения вирусов из инфекционного материала. Этот метод почти полностью заменен выделением вирусов в культурах клеток и развивающихся куриных эмбрионах, поскольку это более экономично, менее трудоемко и позволяет быстро учитывать результаты исследования. Лабораторных животных используют главным образом для выделения вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах, а именно: для вирусов Коксаки А, возбудителей трансмиссивных инфекций и лимфоцитарного хориоменингита. Для выделения указанных вирусов применяют белых мышей. Методы заражения животных, учет результатов исследования и применяемые методы серологической идентификации выделенных вирусов описаны в раз делах «Энтеровирусные инфекции», «Энцефалиты», «Лимфоцитар ный хориоменингит». 2. Работа с развивающимися куриными эмбрионами Для вирусологических исследований используют оплодотворенные яйца 7—12-дневного возраста, которые обычно получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обыкновенном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37— 38°С, а влажность воздуха — 60—65%. Отбирают крупные чистые (но немытые) оплодотворенные яйца, предпочтительно от белых кур, хранившиеся не более 10 дней при 5—10°С. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка. В термостате яйца содержат на специальных деревянных или металлических подставках, имеющих несколько рядов круглых отверстий размером 3,5—4 см. В процессе инкубации яйца следует ежедневно выносить из термостата на 20—30 мин для проветривания и периодически просматривать в затемненной комнате над овоскопом с целью контроля за развитием эмбриона. Овоскоп представляет собой деревянную или металлическую коробку без дна с поверхностью 12X12 см и высотой 10 см. Сверху делают отверстие диаметром 3,5 см для яйца, а в боковой стенке внизу — небольшую выемку для шнура от электрической лампочки, которую помещают внутрь. При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения куриных эмбрионов, но наибольшее практическое применение получило нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость . 3. Работа с культурами клеток Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе, так как используемые питательные среды служат питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых изделий, применяемым при культивировании клеток. Для выделения вирусов от больных могут быть использованы разные методы культивирования тканей вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично трипсинизированных и стабильных линий клеток. Преимуществом однослойных культур клеток является относительная простота методики приготовления клеточного слоя и легкость учета вызываемых вирусами морфологических изменений в нем. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах — матрацах — вместимостью 1 л, 250 и 100 мл и в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом . Трипсинизированные культуры клеток Сущность метода заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания монослоя на поверхности стекла. Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов, забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции. Используются нормальные и злокачественно перерожденные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивируются вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных. Наибольшей потенцией роста среди тканей эмбриона обладают клетки соединительной ткани, а от взрослых животных — эпителиальные клетки. Наиболее широкое применение в вирусологической практике нашли культуры из трипсинизированных эмбриональных клеток человека, кур, коров, овец, свиней, кроликов, морских свинок, белых мышей и почечных клеток взрослых обезьян. Выбор ткани зависит от чувствительности ее клеток in vitro к тому или иному вирусу. Строгого параллелизма между восприимчивостью животных in vivo и чувствительностью клеток их тканей in vitro к вирусам не наблюдается. Получение и обработка тканей перед трипсинизацией. Извлечение эмбрионов и анатомирование тканей производят в боксе вблизи газовой горелки в строго асептических условиях. Извлекаемые ткани не должны соприкасаться с дезинфицирующими растворами, губительно действующими на клетки. Эмбриональные ткани человека получают из родильных- домов в виде свежих соскобов полости матки при удалении 8—14-недель-ной беременности у женщин, не больных инфекционными заболеваниями. Соскоб собирают в стерильный сосуд, доставляют в лабораторию не позднее 3—4 ч после операции и разбирают на эмалированном лотке, обеззараженном спиртом и обжиганием. Так как кусочки тканей (кожа, мышцы, легкие, почки) бывают загрязнены, их отмывают в течение 30 мин тремя порциями солевого раствора, содержащего высокую концентрацию антибиотиков (500 ЕД пенициллина и 200 ЕД стрептомицина на 1 мл среды). Используют также ткани 5—6-месячных плодов после искусственного аборта и амниотическую оболочку, которую получают от рожениц с нормальными родами. Оболочку освобождают от плаценты, хориона и тщательно промывают солевым раствором с высоким содержанием антибиотиков. Перевиваемыми линиями клеток называют культуры, обладающие способностью к размножению и перевивкам вне организма. В табл. 16 представлен перечень клеток, получивших наибольшую известность и применение. При пересеве перевиваемых клеток питательную среду отсасывают пипеткой Мора и выливают. Клетки монослоя снимают с поверхности стекла при помощи диспергирования химическими веществами, в качестве которых используют 0,02% раствор версена или 0,25% раствор трипсина. Версен дает наилучшие результаты при диспергировании эпителиоподобных клеток, а трипсин — при диспергировании фибробластоподобных клеток. В матрацы вместимостью 1000, 250 и 100 мл диспергирующий раствор добавляют соответственно по 30, 15 и 10 мл. Культуры клеток, залитые раствором, инкубируют в термостате до отделения клеток от поверхности стекла при легком покачивании сосуда (с раствором вергена — обычно 10 мин, с раствором трипсина — 5 мин). Взвесь клеток разливают в пробирки и осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин. При диспергировании клеток трипсином осадок отмывают солевым раствором; при использовании версена отмывания не требуется, так как при добавлении питательной среды содержащийся в ней кальций прекращает действие версена. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Взвесь клеток контролируют на стерильность, после чего подсчитывают в камере Горяева в окрашенном или неокрашенном виде. Вирусы бактерий (бактериофаги) широко распространены в природе. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему микроорганизмов. Строение бактериофагов. Типичная частица бактериофага имеет форму головастика и состоит из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45—140 нм и хвоста толщиной 10—40 и длиной 100—200 нм. В головке, окруженной белковой оболочкой — капсидом, содержится нуклеиновая кислота. Различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие бактериофаги. Хвост представляет собой белковую оболочку — продолжение белковой оболочки головки. Содержимое головки состоит дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (длина её нити во много раз превышает размер головки и достигает 60—70 мкм, эта нить плотно скручена в головке) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) и около 3% белка и некоторых других веществ. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда бактериофагов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из белков. Общее количество белка в частице фага 50—60% , нуклеиновых кислот — 40—50% . В оболочку фаговой частицы и отростка входит белок, состоящий из полиаминов: спермин, путресцин, кислоторастворимый пептид. Другие бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие — нитевидны, размером 8x800 нм. 1.Классификация бактериофагов по морфологическому строению: Различные формы бактериофагов (А-Г) и геометрические формы головок фагов (Д, Е). А. Нитевидная форма (колифаг fd). Б. Головка (гексагональный контур) с отростком и сократимым чехлом (например, колифаги Т2, Т4 и Т6). В. Головка с длинным, гибким несократимым отростком (например, колифаги Т1 и Т5). Г. Головка с коротким отростком (например, колифаги ТЗ и Т7, фаг сальмонеллы Р22). Д. Октаэдр. Е. Икосаэдр. (Bradley D. E., Bacteriol. Rev., 31 [1967], 230.) Каждый бактериофаг обладает специфическими антигенными свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов. Имеются антигены, общие для ряда фагов (особенно содержащих РНК). Бактериофаги подобно другим вирусам являются абсолютными внутриклеточными паразитами. 2.Классификация бактериофагов по характеру взаимодействия с микробной клеткой. По характеру взаимодействия с микробной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию, заканчивающуюся образованием новых фаговых частиц и лизисом бактериальных клеток. Умеренные фаги вызывают интегративную инфекцию, не приводящую к лизису клеток. ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении по наследству. Такой тип взаимодействия фага с бактериальной клеткой называют лизогенией. А бактерии, несущие в своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными. Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной культуры сопровождается лизисом бактерий и просветлением среды. Выделение фага из объектов окружающей среды. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют. После лизиса культуры оставшиеся бактерии удаляют центрифугированием или фильтрацией. Методические указания: Качественный метод определения фагов (метод Отто). Чашку Петри с питательным агаром засевают бульонной культурой газоном. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашки, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага. Фаготипирование бактерий. Исследуемую бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, делят на квадраты, на которые наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают те квадраты, в которых имеется лизис бактерий. Фагопип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис. Практическое использование бактериофагов.
Контрольные вопросы: 1.Каково строение бактериофага? 2. Назовите основные этапы взаимодействия фага с бактериальной клеткой? 3. Что такое профаг? 4.Какие качественные методы идентификации фагов Вам известны? 5. Какова методика титрования фагов в жидкой среде по Аппельману? 6. Назовите основные сферы применения бактериофагов в медицине. Список литературы: Обязательная:
Дополнительная:
Занятие № 9 Генетика микроорганизмов. Цель: Ознакомиться с особенностями наследственности, видами изменчивости микроорганизмов, теоретическим и практическим значением генетики микроорганизмов, с современными методами генетических исследований и использованием их в медицинской практике. Знать: Строение генома бактерий, виды изменчивости микроорганизмов, практическое применение методов генетики в народном хозяйстве, медицине. Уметь: осуществлять постановку экспериментов по выявлению различных видов изменчивости. Обоснование темы: для идентификации микроорганизмов применяют многие молекулярно-генетические методы, что значительно ускоряет постановку правильного диагноза. Вопросы для самоподготовки: 1.Материальная основа наследственности. 2.Понятие о генотипе и фенотипе бактерий. 3.Виды изменчивости. 4. Классификация мутаций. 5. Репарации поврежденной ДНК. 6. Генетические рекомбинации у бактерий, механизмы и значение. 7. Классификация и роль плазмид. 8. ПЦР и ДНК-зонды, их применение. ПЛАН Программа: 1. Модификационная изменчивость. Пигментообразование при разных температурах. О и Н- формы при росте на МПА и среде Плоскирева. 2. Мутационная изменчивость. 3. Рекомбинантная изменчивость. Постановка опытов по трансформации, трансдукции и конъюгации. 4. Применение методов генетики в медицине. Демонстрация: 1. Опыт по пигментообразованию. 2. Рост протея на МПА и среде Плоскирева. 3. Диссоциация энтеробактерий на различные формы колоний. 4. Эксперимент по различным видам рекомбинаций. Задание студентам: 1.Заполнить таблицу: Классификация и функции плазмид. 2. Заполнить таблицу: Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики. 3. Описать различные виды колоний энтеробактерий при диссоциациях. 4.Учесть результаты опытов, поставленных с целью выявления трансдукции, трансформации и коньюгации. Сделать заключение. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||