качество и безопасность продуктов питания. КАЧЕСТВО И БЕЗОПАСНОСТЬ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ (1). Учебное пособие Минск 2008 Авторы З. В. Ловкис, докт техн наук, профессор
 Скачать 7.39 Mb.
|
|
2.3.2. Определение общего белка Состав белков непостоянен. Обычно белки состоят из углерода (50–55%), кислорода (25–30%), азота (9–15%), серы (0,5–2,5%). При анализе продуктов питания часто под словом «белок» понимается количество общего азота, определенного по Кьельдалю, умноженное на соответствующий коэффициент пересчета, указанный в таблицах (в среднем – 6,25). Метод Кьельдаля – один из наиболее широко применяемых методов анализа. Он не требует специального оборудования и удобен для серийного анализа большого количества образцов. Это стандартный метод определения белкового азота в зерне, мясе и других биологических материалах. Суть метода состоит в том, что анализируемый образец окисляют горячей концентрированной серной кислотой; в процессе окисления связанный азот превращается в ион аммония. Затем раствор обрабатывают избытком сильного основания, в результате чего выделяется аммиак, который определяют различными методами. По способу определения количества выделившегося аммиака метод Кьельдаля может иметь титриметрическое или фотометрическое окончание. Важнейшей стадией в методе Кьельдаля является окисление серной кислотой. Углерод и водород, содержащиеся в образце, превращаются соответственно в углекислый газ и воду. Степень превращения азота, однако, зависит от его состояния в исходном соединении. Если он присутствует в виде амида или амина, как, например, в белковых веществах, превращение его в ион аммония происходит всегда почти количественно. Если же азот присутствует в высоких степенях окисления, например, в виде нитро-, азо- и азоксигрупп, на стадии окисления образца он превращается в молекулярный азот или оксиды азота и не удерживается серной кислотой. Это приводит к занижению результатов, и чтобы предотвратить потери, образец подвергают предварительной обработке восстановителем (салициловой кислотой или тиосульфатом натрия). При такой обработке азот переходит в соединения с более низкими степенями окисления, из которых он легче превращается в ион аммония при обработке серной кислотой. Стадия окисления является наиболее длительной в методе Кьельдаля – час и более. Для ускорения стараются повысить температуру кипения серной кислоты и, следовательно, температуру процесса окисления, путем добавления нейтральной соли, например, сульфата калия. Попытки ускорить стадию окисления введением таких сильных окислителей, как хлорная кислота, перманганат калия и перекись водорода, оказались неудачными, поскольку ион аммония частично окисляется до летучих оксидов азота. Стадию окисления катализируют многие вещества: ртуть, медь и селен – как в связанном состоянии, так и в элементном. В качестве катализаторов используют также комбинацию упомянутых веществ. Главный эффект селена состоит в том, что он сокращает время разложения до образования прозрачного раствора, хотя образование совершенно прозрачного раствора не всегда равнозначно количественному разложению вещества. Следует применять незначительное количество селенового катализатора, так как при его увеличении возрастает потеря азота. Продолжительность нагревания тоже не должна быть слишком большой. Таким образом, количество катализатора и продолжительность нагрева имеют оптимум, который необходимо учитывать. При определении общего азота в колбу Кьельдаля (длиногорлая колба, предназначенная для окисления и отгонки аммиака) помещают точно взвешенную навеску анализируемой пробы в пергаментной бумаге, приливают серную кислоту. Для удаления образующейся пены добавляют кусочек парафина. Колбу помещают на плитку и нагревают. После завершения окисления (жидкость осветлится) содержимое колбы разбавляют водой и добавляют щелочь (30% NaOH) для выделения аммиака. Аммиак отгоняют (часто с водяным паром) в колбу с раствором кислоты. Титритримеческое определения азота по Кьельдалю. Существуют два титриметрических способа определения собранного аммиака. В одном из них в приемник помещают известное количество стандартного раствора кислоты. По окончании отгонки избыток кислоты оттитровывают стандартным раствором щелочи. Другой удобный способ, требующий применения только одного стандартного раствора, состоит в том, что в приемник вводят некоторый избыток борной кислоты. HBO2 + NH3 = NH4+ + BO2– Образующийся борат, количество которого эквивалентно количеству аммиака, является достаточно сильным основанием и его можно титровать стандартным раствором HCl: BO2– + H3O+ = HBO2 + H2O. Титрование проводится потенциометрически или с использованием индикаторов. Как уже говорилось, метод Кьельдаля позволяет выделять азот в виде аммиака только из аминов и их производных. Некоторые азотсодержащие соединения (нитро-, нитрозо-, азо-соединения и др.) в этих условиях образуют на ряду с аммиаком молекулярный азот, что приводит к получению заниженных данных. Однако, несмотря на это, метод Кьельдаля нашел широкое применения в биохимии и анализе пищевых продуктов. Метод относительно прост, легко поддается автоматизации и хорошо воспроизводим. В настоящее время процедура определения белка по Кьельдалю стандартизирована в международном масштабе и выпускается оборудование, позволяющее быстро и точно определять содержание общего азота. Такое оборудование включает блок разложения и систему дистилляции. Блоки разложения проб позволяют одновременно разлагать до 12 проб различного объема. Разложение идет под действием серной кислоты с использованием ИК-лучей и максимальная температура процесса может достигать 750ºС. Система дистилляции дает возможность отгонять аммиак с паром и титриметрически (с использованием стеклянного электрода) определять его количество. Следует отметить, что существуют такие системы, в которых и дистилляция, и титрование проводятся в автоматическом режиме и работа, как системы дистилляции, так и блока разложения контролируется микропроцессором, а результаты анализа могут регистрироваться с помощью персонального компьютера. Фотометрическое определение азота по Кьельдалю. Для ускорения определения аммиака используется его фотометрическое определение. Фотометрически аммиак может быть определен либо по реакции с реактивом Несслера, либо по реакции образования индофенола. При определении первым способом, к раствору, содержащему ионы аммония, добавляют реактив Несслера, представляющий собой щелочной раствор K2[HgI4]. Продукт реакции окрашен в красно-коричневый цвет ( = 106). Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 436 нм. Концентрацию аммиака находят по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам сульфата аммония.  Красно-коричневый 436 нм е = 106 Определение, основанное на образовании индофенола, заключается в совместном окислении фенола и аммиака. NH3 + NaOCl = NH2Cl + NaOH C6H5OH + NH2Cl + NaOH = H2NC6H4OH + NaCl H2NC6H4OH + C6H5OH + NH2Cl = HOC6H4NHC6H4OH + NH4Cl  Полученный индофенол окрашивает раствор в интенсивно синий цвет ( = 620 нм, = 4,5·104) по оптической плотности которого и определяют содержание аммиака. В качестве окислителей используют NaClO, хлорную или бромную вода, перекись водорода. Завершая рассмотрения метода Кьельдаля, следует отметить, что этим методом определяют не чистый белок, а так называемый «сырой протеин», так как вместе с азотом белка одновременно определяется азот и других соединений: аминоксилоты, амиды, алкалоиды (кофеин и др.), неорганические азотсодержащие соединения. Содержание небелковых веществ может достигать 10%. Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко. Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля, как уже говорилось, является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты. Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота. В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа I3N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техникон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеряется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции взаимодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерализации образца, со щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все описанные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими. Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля. Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протеканием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах. 2.3.3. Определение аминокислот В данном разделе будут рассмотрены методы определения аминокислот, применяющиеся не только при анализе продуктов, но в биохимии и фармацевтическом анализе. Общее количество аминокислот может быть проведено фотометрическим методом, основанным на определении аммиака, полученного из аминокислот по методу Кьельдаля. Реакция с 1-нафтолом. Для определения аргинина, гистидина, тирозина предложена реакция с 1-нафтолом. В присутствии гипохлорита натрия (NaOCl) раствор окрашивается в красный цвет. Пробу раствора в 50% этаноле, содержащую аминокислоту, охлаждают льдом и добавляют 10% раствор NaOCl и раствор нафтола. Продукт реакции окрашен в красный цвет (max = 550 нм). По интенсивности окраски полученного раствора определяют содержание аминокислот.  Аргинин Красное соединение 550 нм Биуретовая реакция. Одной из важнейших реакций, используемых для определения аминокислот, является биуретовая реакция. Реакция осуществляется прибавлением к щелочному раствору биурета разбавленного водного раствора соли меди (II). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет благодаря образованию комплексного соединения.   Амид аминокислоты В биуретовую реакцию вступают соединения, содержащие не менее 2-х амидных группировок или аминогидроксиэтиленовую группу, а также амиды и имиды аминокислот. Эту реакцию дают белки и концентрированные растворы аминокислот и амидов. Разбавленные растворы аминокислот не дают биуретовой реакции и поэтому реакцию можно использовать для установления конца гидролиза белка. Реакцию применяют также для качественного и количественного определения белка. На биуретовой реакции основаны используемые в клинико-диагностических лабораториях методики определения белка в крови и других биологических жидкостях. Нингидриновая реакция. Второй важнейшей реакцией, используемой для определения аминокислот, является нингидриновая реакция – цветная реакция на -аминокислоты, которую осуществляют нагреванием последних в щелочном растворе избытка нингидрина.  Нингидрин осуществляет окислительное декарбоксилирование -аминокислот с образованием аммиака, углекислого газа и альдегида, содержащего на один атом углерода меньше, чем исходная аминокислота. Восстановленный нингидрин далее реагирует с высвободившимся аммиаком и второй молекулой нингидрина, образуя с аммиаком окрашенный продукт конденсации.  Фиолетовый Руэмана Образующееся соединение (пигмент) имеет фиолетово-голубую окраску (мах = 570 нм). Образование этого окрашенного соединения используется в количественном тесте на -аминокислоты, с помощью которого можно обнаружить аминокислоты, даже их количество не превышает 1 мкг. Пролин и гидроксипролин, у которых нет -аминогруппы, в реакции с нингидрином образуют производные желтого цвета (мах = 440 нм). Реакция не специфична, т.к. окрашенный продукт с нингидрином дают также аммиак и соединения, содержащие аминогруппу (амины, белки, пептиды). Однако с этими соединениями не выделяется CO2. Выделение углекислого газа характерно только для -аминокислот. Реакция используется для колориметрического количественного определения -аминокислот, в том числе в автоматических аминокислотных анализаторах (измерение объема СО2). Нингидриновая реакция используется для определения глицина, изолейцина, лейцина; менее интенсивную окраску дают серин, фенилаланин, цистеин, тирозин, триптофан и др. Образующиеся продукты характеризуются достаточно интенсивной окраской ( = 1,8–3,3·104), но окрашенные продукты нестабильны. Интенсивность окраски быстро уменьшается. Для стабилизации добавляют CdCl2. Он образует устойчивые комплексы с образующимися соединениями. Хлорид кадмия также ускоряет реакцию. Аминокислоты и некоторые другие соединения, содержащие аминогруппу, конденсируются в щелочной среде с 1,2-нафтохинон – 4-сульфоксилотой с образованием окрашенных в красный, желтый, оранжевый цвет производных 1,2-нафтохинонмоноимина. Окраска зависит от рН раствора.  Имин Реакция используется для определения -аминоксилот (валин, изолейцин, лейцин, и др.). Для определения триптофана может быть использована реакция с 4-диметиламинобензальдегидом. Продукт реакции окрашен в фиолетовый цвет и по интенсивности окраски определяют содержание триптофана в анализируемом растворе. Следует отметить, однако, что данная реакция в анализе пищевых продуктов используется редко.  4-Диметилбензальдегид Фиолетовый 590 нм Для количественного определения аминокислот, содержащих серу, используется броматометрический метод, основанный на следующей реакции:  Цистеин Цистеиновая кислота Раствор цистеина в 1% растворе NaOH вливают в колбу с притертой пробкой, добавляют 0,1 н. раствор бромата калия, сухой бромид калия и подкисляют 10%-ной HCl. BrO3– + 5Br– + 6H+ 3Br2 + 3H2O Образующийся в результате реакции бром, количество которого эквивалентно количеству бромата калия, реагирует с аминокислотой. Через 10 мин прибавляют йодид калия, который вступает в реакцию с непрореагировавшим бромом, и титруют выделившийся йод 0,1 н. раствором тиосульфата натрия с крахмалом в качестве индикатора. 2I– + Br2 Br- + I2 Количество тиосульфата, пошедшего на титрование, эквивалентно количеству брома, не вступившего в реакцию с аминокислотой. По разнице между количеством добавленного бромата калия и тиосульфата находят количество брома, пошедшего на реакцию с аминокислотой, а значит и количество аминокислоты. Метионин определяют аналогично. Метионин при этом окисляется до сульфона:  Эта реакция при определенных условиях позволяет очень точно определить содержание метионина. 2.3.4. Определение аминокислотного состава Определение аминокислотного состава белков может быть осуществлено различными методами: химическим, хроматографическим, микробиологическим и изотопным. Чаще используются хроматографические методы. Бумажная хроматография. Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и три-пептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов. Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H2SO4). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)2, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра. Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем, подвижной фазой, которая движется вдоль листа вверх или вниз. В качестве подвижной фазы используется смесь бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с различной скоростью и легко могут быть разделены. По окончании хроматографии бумагу высушивают и обрабатывают проявителем (0,5% раствор нингидрина в смеси ацетон-ледяная уксусная кислота-вода) и нагревают в течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях. Бумажная хроматография может быть использована для количественной оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический (нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны концентрациям аминокислот в разделяемой смеси. Тонкослойная хроматография. Для разделения и определения аминокислот может быть также использована тонкослойная хроматография. ТСХ, как известно, существует в двух вариантах. Распределительная ТСХ сходна с распределительной на бумаге и адсорбционная ТСХ, основана совершенно на других принципах. При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных носителях можно использовать такие же системы растворителей и такие же проявляющие реагенты, как и при хроматографии на бумаге. Разделение с помощью АТСХ определяется способностью растворителя (этот растворитель не обязательно является бинарной или более сложной смесью) элюировать компоненты образца с места его адсорбции на активированном сорбенте. Например, на нагретом силикагеле. АТСХ применима для разделения таких неполярных соединений, как липиды, но не для разделения аминокислот и большинства пептидов. Для разделения аминокислот используют РТСХ, которая позволяет достаточно быстро разделять и определять 22 аминокислоты белковых гидролизатов. Аминокислоты в белковом гидролизате могут быть определены также методом газовой хроматографии, но перед хроматографическим анализом аминокислоты как правило переводят в летучие соединения. -Взаимодействие с нингидрином. Образуются соответствующие альдегиды.  Таким образом, получают смесь альдегидов и анализируют ее. Это простейший случай, пригоден лишь для некоторых аминокислот. -Переводят аминоксилоты в летучие эфиры (алкильные эфиры, метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.). Выбор производных зависит от исследуемой смеси аминокислот. Ионообменная хроматография. В настоящее время аминокислотный состав пищевых продуктов определяется исключительно с помощью автоматической ионообменной хроматографии.
В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Na+ – форме. Когда кислотный гидролизат при рН = 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с ионами натрия. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях рН и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную – двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком. Высоковольтный электрофорез на инертных носителях. В биохимии широкое применение нашло разделение аминокислот, полипептидов и других амфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под действием наложенного постоянного электрического поля. Это метод высоковольтного электрофореза на инертных носителях. При разделении аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение 0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов амфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более легкие мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот, низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов. Образец помещают на носитель, смачивают буфером при соответствующем рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают стеклянной пластинкой или погружают в углеводородный растворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут положительный заряд, – к катоду. Далее высушенную электрофореграмму «проявляют» нингидрином (при работе с аминокислотами, пептидами) или измеряют поглощение в УФ-свете (при работе с нуклеотидами). Выбор рН определяется значениями рК диссоциирующих групп, входящих в состав молекул смеси. При рН 6,4 глутамат и аспарат несут заряд –1 и движутся к аноду; разделение их осуществляется благодаря различию в молекулярной массе. Лизин, аргинин и гистидин движутся в противоположном направлении, а все другие аминокислоты, входящие в состав белка, остаются вблизи места нанесения. При разделении пептидов, образовавшихся в результате ферментативного расщепления, уменьшение рН до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных групп и обеспечивает лучшее разделение.
Методы бумажной, тонкослойной хроматографии, микробиологические, газохроматографические и ряд других, в настоящее время практически не используются вследствие худшей воспроизводимости и большой длительности. Современные хроматографы позволяют определять аминокислотный состав смеси, содержащей лишь 10–7–10–9 моль каждого компонента с воспроизводимостью до 5% за 2–4 часа. Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Поскольку при нейтральных рН пептидные связи стабильны, применяют кислотный или щелочной катализ. Ферментативный катализ для полного гидролиза менее пригоден. Полный гидролиз белка на составляющие аминокислоты неизбежно сопровождается частичной потерей некоторых аминокислотных остатков. Для гидролиза обычно используется 6 н. водный раствор соляной кислоты (110ºС), в вакуумированной ампуле. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких анализаторов смесь аминокислот разделяют на сульфокатионитах, а детектирование осуществляют спектрофотометрически по реакции с нингидрином или флуориметрически с о-фталевым диальдегидом. Однако данные по аминокислотному составу однотипных продуктов, полученные в разных лабораториях по отдельным аминокислотам, иногда различаются до 50%. Эти различия обусловлены не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6 н. HСl, 110–120ºС, 22–24 часа) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 10–15% и тем больше, чем дольше проводится гидролиз) и особенно метионина (30–60%) и цистина 56–60%, а также практически полное разрушение триптофана и цистеина. Этот процесс усиливается в присутствии больших количеств углеводов в продукте. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное их окисление надмуравьиной кислотой. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин в метионин-сульфон, которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе.  Цистин Цистеиновая кислота Трудной задачей в аминокислотном анализе является определение триптофана. Как уже говорилось, при кислотном гидролизе происходит почти полное его разрушение (до 90%). Поэтому для определения триптофана проводят один из вариантов щелочного гидролиза 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 часов в присутствии 5% хлорида олова или 2 н. гидроокиси бария, при которых он разрушается незначительно (до 10%). Минимальное разрушение происходит в присутствии тиогликолевой кислоты и предварительно гидролизованного крахмала. (При щелочном гидролизе происходит разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина). Гидролизат после нейтрализации смесью лимонной и соляной кислот немедленно (во избежание студнеобразования) анализируют на аминокислотном анализаторе. Что касается многочисленных химических методов определения триптофана, то они, как правило, в пищевых продуктах плохо воспроизводимы и поэтому их использовать не рекомендуется. Для мясных продуктов дополнительной необходимой аминокислотой является оксипролин, который характеризует количество соединительных тканных белков в мясе. Его можно определять ионообменной хроматографией с помощью автоматических анализаторов или химическим колориметрическим методом. Метод основан на нейтрализации кислотного гидролизата до рН 6,0, последующем окислении оксипролина с помощью 1,4% раствора хлорамина Т (или хлорамина Б) в смеси пропилового спирта и буфера, колориметрическом определении при 533 нм продуктов окисления оксипролина после реакции с 10%-ным раствором пара-диметиламинобензальдегида в смеси хлорной кислоты и пропилового спирта (1:2). В связи с тем, что тирозин, фенилаланин и пролин в присутствии кислорода могут частично окисляться, стандартный кислотный гидролиз рекомендуется проводить в атмосфере азота. Ряд аминокислот, в том числе лейцин, изолейцин и валин, требуют для своего полного выделения из белков более длительного кислотного гидролиза – до 72 ч. В биохимии при анализе белков гидролизуют параллельные пробы в течение 24, 48, 72 и 96 ч. Для точного количественного определения всех аминокислот требуется проводить 5 различных гидролизов, что весьма удлиняет определение. Обычно же проводят 1–2 гидролиза (стандартный с соляной кислотой и с предварительным оксилением надмуравьиной кислотой). Во избежание потерь аминокислот удаление избытка кислоты при кислотном гидролизе следует проводить немедленно многократным выпариванием в вакуум-эксикаторе с добавлением дистиллированной воды. При правильной работе анализатора ионообменные колонки работают без замены смолы довольно долго. Однако, если образцы содержат заметные количества красящих веществ и липидов, то колонка быстро забивается и для восстановления ее разделительных способностей требуется многократная регенерация, иногда с перенабивкой колонки. Поэтому, для продуктов, содержащих более 5% жира, рекомендуется предварительно удалять липиды экстракцией. В таблице 2.3 приведены условия пробоподготовки основных пищевых продуктов при анализе аминокислотного состава. Таблица 2.3. – Условия подготовки проб пищевых продуктов к анализу
Контрольные вопросы: Дайте определение понятию «белки». На какие группы делят белки по их функциям в организме? Какова роль белков в питании человека? Каковы рекомендуемые нормы белка в питании? Каково рекомендуемое соотношение белков растительного и животного происхождения и как белки различного происхождения отличаются по своему аминокислотному составу? Какие незаменимые аминокислоты вы знаете и какие аминокислоты могут стать незаменимыми? Как определяют содержание общего азота в продуктах питания? Как определяют аминокислотный состав белков? Какие методы определения аминокислот вы знаете? |