ФЕРМЕНТЫ. Учебное пособие введение

• Название: Учебное пособие введение
• Анкор: ФЕРМЕНТЫ
• Дата: 16.03.2022
• Размер: 2.87 Mb.
• Имя файла: ФЕРМЕНТЫ.doc
• Тип: Учебное пособие; #399119
• страница: 2 из 4

4. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической литературе, фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. Это знаменитое правило было сформулировано Э. Фишером в 1894 г. исходя из того, что специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием геометрической структуры субстрата и активного центра фермента.

В 50-е годы нашего столетия это статическое представление было заменено гипотезой Д. Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента. Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может быть выражено формулой “перчатка - рука”. При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи и он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки.

Обратите внимание на домены А и Б. Домены А и Б участвуют в связывании субстратов и препятствуют проникновению воды (которая бы способствовала гидролизу нуклеотидов, а не переносу фосфатных групп). Связывание субстрата запускает конформационные изменения, которые видны на рис. б. Обратите внимание, что домены сблизились и их конформация изменилась. Домен Б приобрел более упорядоченную вторичную структуру, в нем появились -складчатые элементы. На рис. б видно, что оба домена прикрывают субстрат.

Рис. 5 Конформационные изменения в аденилаткиназе при связывании синтетического аналога субстратов. а — пространственная структура аденилаткиназы; б— аденилатциклаза, связанная с синтетическим аналогом субстратов.
В настоящее время гипотеза Кошланда получила дальнейшее развитие в гипотезу топохимического соответствия. Сохраняя основные положения гипотезы взаимоиндуцированной настройки субстрата и фермента, она фиксирует внимание на том, что специфичность действия ферментов объясняется в первую очередь узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и субстратным центром фермента возникают многочисленные точечные гидрофобные взаимодействия и водородные связи.

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Любая ферментативная реакция протекает через ряд промежуточных стадий. Различают три основных этапа ферментативного катализа:


1 этап. ОРИЕНТИРОВАННАЯ СОРБЦИЯ СУБСТРАТА НА АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ ФЕРМЕНТА С ОБРАЗОВАНИЕМ ОБРАТИМОГО E-S КОМПЛЕКСА (ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО). На этом этапе происходит взаимодействие адсорбционного центра фермента с молекулой субстрата. При этом и субстрат подвергается конформационной перестройке. Все это происходит за счет возникновения слабых типов связей между субстратом и адсорбционным центром фермента. В результате этого молекула субстрата подается на каталитический центр в наиболее удобном для него положении. Этот этап является легко обратимым, потому что здесь участвуют только слабые типы связей.

2 этап. ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ СУБСТРАТА В СОСТАВЕ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА С ОБРАЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТА С ХИМИЧЕСКИ ПРЕОБРАЗОВАННЫМ СУБСТРАТОМ. На этом этапе разрываются одни ковалентные связи и возникают новые. Поэтому этот этап протекает значительно медленнее, чем 1-й и 3-й этапы. Именно скорость второго этапа определяет скорость всей ферментативной реакции в целом.

3 этап. ДЕСОРБЦИЯ ГОТОВОГО ПРОДУКТА ИЗ ЕГО КОМПЛЕКСА С ФЕРМЕНТОМ. В результате образования продукта, комплементарность снижается (или исчезает), а после диссоциации продукта фермент возвращается в исходное состояние. Он, как и 2-й этап, тоже необратим. Исключение - обратимые ферментативные реакции.

В общем виде ход ферментативного катализа представлен ниже, где ES* — комплекс между ферментом и субстратом в переходном состоянии, ЕР - комплекс фермента и продукта: Е + S  Е S  ES*  ЕР  Е+Р. Энергетический профиль реакции представлен на рисунке 6.



Рис. 6

Активность ферментов – способность в разной степени ускорять скорость реакции.

Кинетика ферментативных реакций

1. ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА ([E]) при постоянной и довольно большой концентрации субстрата ([S]>>[E], [S]=const) имеет такой вид:



Отклонение от линейности графика при очень высокой концентрации фермента возникает из-за нехватки субстрата, поэтому снижается скорость поступления субстрата на активный центр фермента. Определять скорость ферментативной реакции надо только в том диапазоне концентраций фермента, в котором график линеен.

Линейность этого графика позволяет выразить его одной цифрой - тангенс угла наклона к оси абсцисс. Этот тангенс представляет собой величину активности фермента. Именно работа (эффективность) каждого фермента количественно характеризуется величиной его активности, то есть величиной скорости ферментативной реакции в расчете на единицу количества фермента. Единицы активности могут быть различными: мкмоль S/мин^.мг или мкмоль S/мин^.мл сыворотки крови.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ АКТИВНОСТЬ - это количество молекул субстрата, которые превращаются одной молекулой фермента за одну минуту при 30^оС и прочих оптимальных условиях. Преимущество этой единицы - в том, что можно сравнивать не только активность ферментов из разных источников, но и эффективность разных ферментов. Например, молекулярная активность фермента каталазы составляет 5*10⁶, а карбоангидразы - 36*10^6­­.

Из линейности графика следует, что по скорости реакции можно судить о количестве фермента.

КАТАЛ - это количество фермента, которое обеспечивает превращение 1 моля субстрата за 1 секунду.

ЮНИТ - это количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за 1 минуту. 1 Юнит = 16,67 нкатал

ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА ПРИ [E] = const и [S] >> [E].

Чем выше концентрация субстрата, тем выше скорость реакции. Эта зависимость гиперболическая.



Предельное значение, к которому стремится гипербола - V_max данной реакции - характеризует максимальную работоспособность фермента:
V_max=k₊₂^.[E]
Таким образом, V_max - это предел, к которому стремится скорость реакции при бесконечном повышении концентрации субстрата.

К_м - это КОНСТАНТА МИХАЭЛИСА. Она численно равна той концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимального значения.

Эта кривая описывается уравнением Михаэлиса-Ментен:



ФИЗИЧЕСКИЙ СМЫСЛ К_м заключается в том, что она представляет собой константу равновесия между двумя реакциями, приводящими к распаду фермент-субстратного комплекса и той реакцией, которая ведет к образованию этого комплекса.



Поскольку значение k₊₂ всегда намного ниже, чем k_-1, то



K_s - субстратная константа. Характеризует константу равновесия 1-го этапа ферментативной реакции. Следовательно, К_м обычно тоже довольно близка к К_s. Следовательно, К_м, как и К_s, характеризует сродство субстрата к данному ферменту. Но экспериментально определить k_-1 и k₊₂ очень трудно, поэтому трудно определить и К_s. С помощью К_м можно характеризовать сродство данного фермента к данному субстрату. Чем меньше К_м, тем больше сродство фермента к данному субстрату, а значит тем больше равновесие первого этапа ферментативной реакции сдвинуто вправо - в сторону образования фермент-субстратного комплекса. Значит, будут созданы наилучшие условия для протекания и второго этапа ферментативного процесса. При таких условиях для достижения эффективного превращения субстрата требуется малая концентрация субстрата. Значит, и V_max теоретически может быть достигнута при малых количествах субстрата.

Если К_м высока, то это означает, что сродство фермента к такому субстрату низкое и реакция при небольших концентрациях субстрата протекает неэффективно.