Матричный синтез. В. И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая ню. Лекция
 Скачать 299.56 Kb.
|
|
СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. Лекция №2. Тема Матричные биосинтезы: репликация, транскрипция, трансляция План. 1. Характеристика матричных синтезов. 2. Репликация – самоудвоение ДНК. Репарация ДНК. 3. Транскрипция. Посттранскрипционный процессинг. 4. Трансляция. Посттрансляционные модификации полипептидной цепи. 5. Регуляция экспрессии генов у эукариот 1. Характеристика матричных синтезов. Делению клетки предшествует процесс самоудвоения ДНК (репликация, необходимый для передачи генетической информации в дочерние клетки. Генетическая информация, закодированная в последовательности дезоксинуклеотидов ДНК, реализуется через считывание, или транскрипцию генов, в форме полинуклеотидных последовательностей мРНК и перевод (трансляцию) информации, заключенной в мРНК, на язык аминокислот. Таким образом происходит передача информации от ДНК через РНК на белок, характерная для подавляющего большинства живых организмов (за исключением некоторых РНК-вирусов). Все матричные синтезы проходят в три основных стадии инициацию (начало, элонгацию (удлинение) и терминацию (окончание. Репликация – самоудвоение ДНК. Репарация ДНК Репликация процесс самоудвоения ДНК в составе хромосом в процессе фазы клеточного цикла. Репликация – это полуконсервативный процесс, т.к. вновь образованная двойная спираль ДНК содержит одну материнскую и одну дочернюю цепи, которые связаны друг с другом водородными связями между комплементарными азотистыми основаниями. Репликация проходит в 3 стадии инициацию, элонгацию и терминацию. 1. Инициация репликации – образование репликативной вилки. В определенном участке (сайте) ДНК цепи ДНК расходятся и образуются 2 репликативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях. У эукариот в хромосомах репликацию осуществляют несколько репликативных вилок. В инициации репликации участвуют различные белки и ферменты 1. Топоизомераза – препятствует суперспирализации двойной спирали ДНК впереди репликативной вилки 2. ДНК-хеликаза (helix - спираль) – расплетает двойную спираль ДНК с использованием энергии АТФ (разрывает водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями 3. ДНК-связывающие белки – взаимодействуют с каждой расплетенной цепью ДНК, препятствуя образованию двойной спирали. 2. Элонгация репликации – синтез полидезоксирибонуклеотидной цепи на матрице ДНК. Субстратами для синтеза являются дезоксирибонуклеотиды: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ. Синтез новой (дочерней) цепи ДНК возможен только в направлении 5` → 3`, те. очередной нуклеотид присоединяется к ОН группе предыдущего нуклеотида. Цепи ДНК антипараллельны и поэтому синтезируемые цепи всегда антипараллельны материнским (матричным) цепям (схема 1). В синтезе ДНК эукариот принимают участие 5 ДНК-полимераз (α, β, γ, δ и ε). СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. ДНК-полимераза α, которая начинает репликацию, синтезирует небольшой РНК- нуклеотид (праймер длиной 8-10 нуклеотидов. На основе этого праймера эта ДНК-полимераза α синтезирует фрагмент цепи ДНК, состоящий примерной из 60 нуклеотидов. Дальнейший синтез доцерней цепи ДНК осуществляет ДНК-полимераза δ. Дезоксирибонуклеотиды всегда присоединяются к ОН группе предыдущего нуклеотида с образованием 3`-5`- фосфодиэфирной связи. Для образования связи требуется энергия гидролиза макроэргической связи (дАТФ →дАМФ+Н 4 Р 2 О 7 ). Однако только одна дочерняя цепь синтезируется непрерывно в направлении движения репликативной вилки – лидирующая цепь. Синтез другой цепи всегда идет в направлении от репликативной вилки (отстающая цепь. Синтез отстающей цепи начинается у репликативной вилки. ДНК-полимераза α синтезирует РНК-праймер и ДНК-нуклеотид. Затем ДНК-полимераза ε удиняет дочернюю цепь ДНК до встречи с предыдущим праймером. ДНК-полимераза β постепенно вырезает нуклеотиды праймера, а на их место присоединяет соответствующие дезоксирибонуклеотиды по принципу комплементарности. Два фрагмента Оказаки сшиваются ферментом ДНК-лигазой (с затратой энергии АТФ. В 1969 г. Оказаки доказал, что синтез ДНК на одной из нитей происходит не непрерывно, а в виде фрагментов ДНК (фрагменты Оказаки). Они начинают синтезироваться от репликативной вилки (те. в обратном направлении. 3. Терминация репликации. Репликация продолжается до встречи со следующей репликативной вилкой. Расстояние между первой репликативной вилки до следующей называется репликоном. По окончании репликации небольшая часть (1-8%) нуклеотидных остатков в составе ДНК подвергаются метилированию (с участием S-аденозин-метионина) как правило по N7 аденина или гуанина. Метилирование необходимо для формирования структуры хромосомы, а также для регуляции транскрипции. Вероятность ошибок при репликации 10 -9 -10 -10 . Однако, если происходят такие ошибки, то синтезируемая ДНК подвергается репарации. Репарация ДНК – процесс восстановления повреждений, возникших в ДНК. Входе репарации выявляется некомплементарный нуклеотид, вырезается, а на его место присоединяется соответствующий комплементарный нуклеотид. При нарушении репарации развиваются мутации ДНК, приводящие к развитию патологий например, пигментная ксеродерма, трихотиодистрофия). 3. Транскрипция. Посттранскрипционный процессинг. Транскрипция – первая стадия реализации генетической информации в клетке. Транскрипция – это синтез РНК на матрице ДНК. Синтез РНК начинается в определенных участках (сайтах) – промоторах, а заканчивается в сайтах терминации. Участок ДНК от промотора до сайта терминации называется транскриптон. У эукариот 1 транскриптон = 1 ген. Цепь ДНК, которая транскрибируется называется матричной, а вторая, комплементарная ей цепь – кодирующей. В транскрипции участвуют белки - транскрипционные факторы и ферменты РНК-полимеразы I, II, III. РНК-полимераза I синтезирует рРНК; РНК-полимераза II – мРНК; РНК-полимераза III – тРНК. 1. Инициация транскрипции. Промотор содержит большую последовательность ТАТА (ТАТА-бокс), к которой присоединяется специальный белок ТАТА-фактор. Этот фактор облегчает связывание РНК-полимеразы с промотором. Факторы инициации СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. транскрипции и РНК-полимераза раскручивают 1 виток спирали ДНК с образованием транскрипционной вилки. РНК-полимераза считывает только одну цепь ДНК и только в направлении 5` → 3`. 2. Элонгация транскрипции. Факторы элонгации увеличивают активность РНК- полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК (примерно 18 пар нуклеотидов. Считывание продолжается в направлении 5` → 3`. 3. Терминация транскрипции. Факторы терминации связываются с расплетенным сайтом терминации и способствуют отщеплению РНК-полимеразы и первичного транскрипта от матрицы ДНК. Посттранскрипционных процессинг. Модификация м-РНК начинается еще на стадии элонгации. 1. Образование кэпа. Сначала к концу мРНК с помощью 5`-5`-фосфодиэфирной связи присоединяется ГТФ и затем происходит метилирование по N7 гуанина. Эта структура называется кэп (“cap”). Функции кэпа: а) участвует в инициации трансляции б) защищает мРНК от разрушения нуклеазами в) активирует сплайсосому. 2. Присоединение полиА-хвоста (около 100-200 АМФ) к концу мРНК. 3. Сплайсинг (у эукариот) – удаление бессмысленных последовательностей (интронов) и сшивание смысловых последовательностей (экзонов) (схема 2). Альтернативный сплайсинг – образование различных мРНК в разных тканях на основе одного первичного транскрипта. Процессинг т-РНК заключается в отщеплении нуклеотидов от конца до тех пор пока РНК-аза не достигнет последовательности ЦЦА – одинаковая последовательность на конц всех тРНК. Затем происходит сплайсинг и формируется антикодон (связывается по принципу комплементарности с кодоном на мРНК). Процессинг рРНК. В результате транскрипции образуется нуклеотид длиной примерно 13000 нуклеотидов (45S). После процессинга образуются рРНК 28S, 18S, 4,8S, которые участвуют в построении рибосомы. 4. Трансляция. Посттрансляционные модификации полипептидной цепи. Трансляция – перевод последовательности рибонуклеотидов РНК в последовательность аминокислот белка - или синтез белка. Местом синтеза белка являются рибосомы. Кодирующими элементами РНК являются кодоны или трплеты (64), из которых 61 кодируют АК, и 3 кодона являются – стоп-кодона трансляции. У человека только 2 АК кодируются одним окдоном – мети три, тогда как лей, сер и арг – ю кодонами, ала, вал, про, тремя кодонами. Избыточность кодонов – ценнейшее свойство генетического кода, т.к. она снижает вероятность развития патологии при ошибке считывания в процессе транскрипции. Кодоны читаются водном направлении и не перекрываются. Трансляция начинается с Кодона- инициатора - АУГ и заканчивается кодоном-терминатором (УАА, УАГ или УГА). Особенности генетического кода. 1. генетический код состоит из х последовательных нуклеотидов. 2. генетический код не перекрывается. 3. генетический код универсален для всех живых организмов. 4. генетический код является вырожденным, т.к. ряд АК шифруются не одним кодом, а несколькими. Три и мет – имеют по 1-му коду (УГГ и АУГ соответственно. Поэтому АК – 20, а кодонов – 61. СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. Трансляция происходит в 5 этапов активация АК (происходит в цитозоле), инициация, элонгация, терминация (происходят на рибосоме) и процессинг (происходит в цитозоле). 1. Активация АК - образование аминоацил-тРНК. Каждая из 20-ти АК ковалентно присоединяется к определенной тРНК. Каждой АК соответствует хотя бы одна т-РНК. Для активации АК необходимо набор АК, тРНК, аминоацил-тРНК-синтазы для каждой АК, АТФ, Mg 2+ 2. Инициация тансляции. Для инициации трансляции необходимо метионил-тРНК (формилметионил-тРНК для прокариот, мРНК, рибосома, ГТФ, ионы Mg 2+ , K + , белковые факторы инициации (IF). Эукариотические рибосомы имеют константу седиментации 80S и состоят из 40S (малой) и 60S (большой) субъединиц. Каждая субъединица включает рРНК и белки. В рибосоме есть 2 центра для присоединения молекул т-РНК: аминоацильный (Аи пептидильный (П) центры, в образовании которых принимают участие обе субъединицы. Вместе Аи П центры включают участок м-РНК, равный двум кодонам. Входе трансляции А- центр связывает аминоацил-т-РНК, строение которой определяет кодон, находящийся в области этого центра. В структуре этого кодона зашифрована природа аминокислоты, которая будет включена в растущую полипептидную цепь. Центр П занимает пептидил-т-РНК, те. РНК, связанная с пептидной цепочкой, которая уже синтезирована. Образование инициирующего комплекса:Малая субъединица рибосомы связывается с IF3, который препятствует объединению большой и малой субъединиц рибосомы. Мет-т-РНК связывается с малой субъединицей. 5`-cap (кэп) м-РНК также связывается с малой субчастицей и первый кодон АУГ спаривается с антикодоном мет-т-РНК. Метионин (мет) инициирует синтез белков у человека. Мет-т-РНК загружается в П-центр малой субъединицы. А-центр пока пустой (схема 4.1). Далее загруженная малая субчастица закрывается большой субъединицей с образованием инициирующего комплекса. Для образования инициирующего комплекса требуются затраты энергии. Источником энергии входе инициации трансляции служат а) гидролиз АТФ, необходимый для соединения П-участка малой субъединицы с АУГ и б) комплекс ГТФ с IF2, необходимый для загрузки П-центра мет-т-РНК. ГТФ гидролизуется до ГДФ и Фн с выделением энергии. В результате белковые факторы инициации освобождаются из инициирующего комплекса. 3. В элонгации трансляции участвуют инициирующий комплекс, аминоацил-тРНК, соответствующая следующему кодону мРНК, факторы элонгации (EF-1,2,3), ГТФ и ферменты пептидилтранфераза и пептидилтранслоказа. Включение каждой аминокислоты в белок происходит в три этапа. 1. Сначала аминоацил-тРНК (лей-тРНК) связывается си ГТФ. Этот комплекс поступает в А-участок рибосомы. ГТФ гидролизуется с выделением энергии и затем ГДФ, Фн и EF-1 покидают рибосому. Аминоацил-т-РНК связывается с А-участком рибосомы (схема 4.2). 2. Под действием пептидилтрансферазы мет переносится из П-участка в А-участок, где образуется пептидная связь между мети лей-тРНК за счет использования энергии гидролиза ГТФ. Пептидилтрансфераза – это р-РНК большой субъединицы рибосомы (схема 4.3). 3. й этап элонгации - транслокация (перемещение рибосомы в направлении 5`→3`) происходит под действием пептидилтранслоказы и EF-2 (схема 4.4). Для этого процесса необходима энергия гидролиза ГТФ. Свободная тРНК отделяется от П-участка и покидает рибосому. Теперь в П-участке рибосомы находится дипептидил-тРНК (мет-лей-тРНК), а в А- участке находится следующий кодон. Рибосома готова к новому циклу трансляции. СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. 4. Терминация трансляции происходит, когда в А-участок рибосомы попадает один из кодонов-терминаторов мРНК. Кодоны-терминаторы – УАА, УГА, УАГ. Кодоны-терминаторы не кодируют аминокислоты. При попадании кодона-терминатора в А-участок рибосомы начинают действовать факторы терминации (RF). Они вызывают 1) гидролитическое отщепление полипептида от конечной т-РНК и его освобождение, 2) отделение от П-участка свободной т-РНК, 3) диссоциацию субъединиц рибосомы, которые готовы к синтезу новой полипептидной цепи. Таким образом, матричная природа процесса трансляции проявляется в том, что последовательность поступления аминоацил-тРНК в рибосому строго детерминирована мРНК, те. порядок расположения кодонов мРНК задает структуру синтезируемого белка. Процесс трансляции очень энергозатратный. Для активации присоединения одной аминокислоты к синтезируемой полипептидной цепи требуется энергия гидролиза х молекул макроэргов: 1 АТФ и 3 ГТФ. Если из тканей, активно синтезирующих белок, например, из ткани поджелудочной железы, выделить рибосомы, то будет видно, что они собраны в группы, состоящие из множества рибосом (до 80). Такие образования называют полисомы. На одной м-РНК сразу несколько рибосом синтезируют несколько ППЦ. 5. Процессинг (посттрансляционные модификации ППЦ) включает себя 1. формирование уникальной третичной и четвертичной структур белка. 2. частичный протеолиз – активации белка после удаления пептида-ингибитора под действием специфических эндо- и/или экзопротеаз например, активация протеолитических ферментов пепсина, трипсина, формирование активных гормонов инсулина и глюкагона). 3. ковалентные модификации a. фосфорилирование белков по гидроксильным группам серина и треонина характерно для ферментов, b. гликозилирование - присоединение углеводных цепей по гидроксильным группам серина и треонина (О-гликозидная связь) или амидной группе аспарагина (N-гликозидная связь) при синтезе гликопротеинов, c. добавление простетических групп (гем, флавины, активные формы витаминов - коферменты и др. 5. Регуляция экспрессии генов у эукариот может быть результатом изменений в генах или действия механизмов, влияющих на скорость транскрипции, процессинга и транспорта м- РНК, скорость трансляции м-РНК или ее стабильность. - Гены могут быть утрачены, амплифицированы и рекомбинированы. - Модификации оснований ДНК влияют на транскрипционную активность генов, например, метилирование цитозина снижает скорость транскрипции гена глобина в неэритроидных тканях. Регуляция на уровне транскрипции 1. гистоны являются неспецифическими репрессорами транскрипции генов. На разных этапах клеточного цикла происходит изменение степени конденсации хроматина. 2. активация специфических генов индукторами, например, стероидными гормонами либо регуляторными белками, которые связываются с особыми регуляторными последовательностями ДНК. СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. 3. Некоторые гены имеют несколько промоторов, которые разные типы клеток могут использовать в разных физиологических условиях. Регуляция вовремя процессинга транскрипта м-РНК 1. Альтернативные кэпирование, полиаденилирование и сплайсинг могут изменить последовательность аминокислот или количество белков, синтезированных на матрице м-РНК. Иногда замена азотистых оснований либо удаление/добавление нуклеотидов может происходить по завершении синтеза транскрипта м-РНК. В результате в разных тканях образуются разные белки. 2. м-РНК могут разрушаться клеточными нуклеазами до начала их трансляции в ЦЗ. Белки, которые транспортируют м-РНК из ядра препятствуют их быстрой деградации. Стабильность м-РНК (те. время их полужизни) регулируют также поли-А-хвосты на конце молекул и шпилечные структуры на конце м-РНК. Регуляция на уровне трансляции Синтез белков регулируется на уровне трансляции, вовремя инициации и элонгации. Например, IF2 является объектом такой регуляции. Он ингибируется путем фосфорилирования. Гем препятствует фосфорилированию IF2, следовательно, гем активирует инициацию синтеза глобина. Напротив, интерферон стимулирует фосфорилирование IF2 и подавляет инициацию трансляции вирусные белков в клетках хозяина. Ингибиторы трансляции Тетрациклины, левомицетин, эритромицин ингибируют элонгацию трансляции, стрептомицин – инициацию. Яд бледой поганки (аманитин) ингибируют РНК-полимеразы. Дифтерийный токсин ингибирует элонгацию трансляции. СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. Наглядный материал к теме Матричные синтезы. Схема 1. Репликация. Синтез лидирующей и отстающей цепей ДНК. Схема 2. Транскрипция. Сплайсинг мРНК. СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. Схема 3. Трансляция. Активация аминокислот (образование аминоацил-тРНК) Акцепторный стебель -к ОН АМФ присоединяется АК. Псевдоуридиновая и дополнительная петля – взаимодействует с рибосомой. Дигидроуридиновая – предполагают, что она взаимодействует с ферментом аминоацил- тРНК-синтазой. Антикодоновая петля – содержит антикодон. СГМУ им. В.И. Разумовского лектор Кафедра биохимии Русецкая НЮ. Схема 4. Элонгация трансляции 1. 2. 3. 4. |