Анциферов_автореферат (Final). Выделение из кислых шахтных отходов и культивирование сульфатредуцирующих бактерий, перспективных для образования сульфидов металлов
 Скачать 1.83 Mb.
|
|
На правах рукописи Анциферов Дмитрий Викторович ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ КИСЛЫХ ШАХТНЫХ ОТХОДОВ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ ОБРАЗОВАНИЯ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ Специальность 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2018 Работа выполнена в лаборатории биохимии и молекулярной биологии Кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического института Томского государственного университета.
Защита состоится __ _________ 2018 г. в __:__ на заседании диссертационного совета Д002.247.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, на соискание ученой степени кандидата наук на базе Федерального государственного учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук», Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН (117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2) и на сайте ФИЦ Биотехнологии РАН http://www.fbras.ru/. Автореферат разослан «_____» _______________ 2018 года Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Хижняк Татьяна Владимировна ОБЩАЯ ХАРАКТРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Образование сульфидов металлов сульфатредуцирующими бактериями (СРБ) - известный биогеохимический процесс. В его основе лежит химизм диссимиляционной сульфатредукции. Конечный продукт восстановления сульфата, высокореакционный H2S, связывает металлы в сульфиды с низкой растворимостью. Этот процесс биоминерализации используется для очистки содержащих металлы стоков как путем создания искусственных ветландов, так и осаждением в биореакторах (Rabus et al., 2015; Важной характеристикой биогенных сульфидов металлов является их минералогический состав. Для биогеотехнологических процессов очистки стоков от металлов тип кристаллизации имеет второстепенное значение. Однако минералогическая характеристика твердой фазы является определяющим фактором при целенаправленном получении наноразмерных и наноструктурированных сульфидов металлов. В частности, сульфид меди Cu2S является важным полупроводником р-типа и имеет большой потенциал в качестве катодного материала для литий-ионных аккумуляторов, абсорбентов для солнечных батарей и нелинейных оптических материалов (Lai et al., 2012). Наноразмерные ориентированные сульфиды кобальта (Co9S8) - важные катализаторы гидрообессеривания нефти. В настоящее время наноразмерные кристаллические сульфиды металлов получают с использованием реакций, проходящих при высоком давлении, температурах и с использованием токсичных соединений. В промышленности существует запрос на создание безопасных и недорогих методов «зеленой химии». Биоминерализация с использованием СРБ может представлять такой путь. Таким образом, актуальность исследования определяется необходимостью выделения новых штаммов и консорциумов ацидофильных/ацидотолерантных СРБ и изучения их взаимодействия с металлами. Устойчивые к металлам ацидофильные СРБ могут быть использованы для разработки биотехнологий очистки кислых шахтных отходов, а также в качестве штаммов-продуцентов кристаллических и наноструктурированных сульфидов металлов. Для выделения устойчивых форм СРБ могут быть использованы новые подходы, направленные на преодоление ограничений традиционных методов культивирования. Культивирование в биореакторе позволяет контролировать доминирование ацидофильных форм путем изменения параметров среды, и может быть использовано для накопления и выделения ацидофильных/ацидотолерантных СРБ. Непрерывное культивирование сульфидогенов и изучение процессов образования биогенных сульфидов металлов в условиях биореактора необходимо для разработки пилотных установок для промышленного производства. Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выделение новых СРБ, устойчивых к металлам и низким рН и изучение образования ими сульфидов металлов для разработки основ биотехнологии получения биогенных кристаллов сульфидов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: Получить накопительные культуры и выделить новые ацидофильные/ацидотолерантные изоляты СРБ из отходов добычи полиметаллических руд в Забайкальском крае. Разработать и использовать новые подходы для выделенияx чистых культур ацидофильных/ацидотолерантных представителей рода Desulfovibrio. Определить последовательность генома (драфт) для одного из ацидофильных/ацидотолерантных изолятов СРБ и провести поиск механизмов устойчивости к металлам и низким значениям рН в геноме. Изучить устойчивость к ионам кобальта и других металлов у новых изолятов СРБ и исследовать образование ими кристаллических фаз сульфидов кобальта (II) при периодическом культивировании. Изучить возможность образования кристаллических сульфидов меди и кобальта при непрерывном культивировании ацидофильных СРБ в биореакторе. Научная новизна работы. Выделены новые ацидофильные и ацидотолерантные СРБ, относящихся к родам Desulfovibrio (Deltaproteobacteria) и Desulfosporosinus (Firmicutes). Чистые культуры ацидотолерантных Desulfovibrio были выделены с использованием нового подхода, основанного на создании временного градиента рН в биореакторе, совмещенного с молекулярным мониторингом изменений в сообществе микроорганизмов. Впервые ацидофильный представитель рода Desulfosporosinus был успешно культивирован в непрерывном режиме путем создания бинарной культуры с ацидотолерантным Desulfovibrio. Впервые показана биоминерализация микро- и макрокристаллов сульфидов кобальта чистыми культурами микроорганизмов. Впервые продемонстрирована возможность образования биогенных ярровита (Cu9S8) и линнеита (Co3S4) микроорганизмами. Практическая значимость работы. Ацидофильные и ацидотолерантные штаммы СРБ, выделенные и охарактеризованные при выполнении работы, являются потенциальными продуцентами сульфидов металлов, которые могут найти применение при создании биотехнологий. Процессы, основанные на штаммах СРБ, могут быть использованы в промышленности, добывающей и перерабатывающей металлы. Данные по культивированию штаммов-продуцентов в биореакторе и в условиях периодической культуры в совокупности с физико-химической характеристикой образованных осадков являются заделом для создания биотехнологических схем по получению сульфидов меди и кобальта с использованием чистых и смешанных культур СРБ. Результаты экспериментов по получению осадков сульфидов металлов разного минералогического состава путем варьирования условий культивирования могут лечь в основу разработки метода целенаправленного дизайна кристаллических сульфидов металлов в промышленных целях. Личный вклад соискателя. Автором выделены чистые культуры СРБ, выполнены все эксперименты по изучению роста СРБ в биореакторе, получены сульфиды металлов при непрерывном и периодическом культивировании штаммов СРБ, на основе данных энергодисперсионного анализа охарактеризован элементный состав осадков. Расшифровка данных дифракционного анализа выполнена совместно с О.П. Иккерт. Отдельные этапы выделения штаммов Desulfovibrio spp. и Desulfosporosinus sp. NP и их характеристики выполнены при участии сотрудников Лаборатории биохимии и молекулярной биологии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета. Эксперименты по изучению устойчивости СРБ к кислороду и механизмов защиты выполнены автором совместно с д-ром Гелем Брассйером. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 11-м международном конгрессе «Extremophiles-2016» (Киото, Япония, 2016 г.), Х молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, Россия, 2015 г.), Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием «Биотехнология, биоинформатика и геномика растений и микроорганизмов» (Томск, Россия, 2016 г.), V Съезде биохимиков России (Сочи-Дагомыс, Россия, 2016 г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 экспериментальные статьи в международных рецензируемых журналах. Финансовая поддержка. Исследования поддержаны грантом Министерства науки и образования РФ в рамках Федеральной Целевой Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2014-2020 годы» (приоритетное направление «Живые системы»), соглашение № 14.575.21.0067. Изучение устойчивости штаммов-продуцентов к кислороду поддержаны грантом РФФИ 16-54-150011. Работы по образованию наноразмерных сульфидов кобальта поддержаны грантом РНФ № 14-14-00427. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка использованных источников. Список литературы включает 218 источников. Материалы диссертации представлены на 135 листах и содержат 39 рисунков и 7 таблиц. Место проведения работы. Работа выполнена в Лаборатории биохимии и молекулярной биологии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Биологического института Томского государственного университета. Определение последовательности генома было проведено группой проф. Н.В. Равина в ФИЦ Биотехнологии РАН (Москва). Эксперименты по исследованию устойчивости к кислороду проведены в Лаборатории химии бактерий Института микробиологии Средиземноморья Национального Исследовательского Центра Франции, CNRS (Марсель, Франция). Благодарности. Автор признателен коллегам, в соавторстве с которыми были проведены эксперименты, М.Р. Авакяну, Г. Брассейру, П.А. Бухтияровой, А.Л. Герасимчук, Д.А. Ивасенко, О.П. Иккерт, Е.А. Латыголец, А.П. Лукиной, А.А. Ковалевой, Т.С. Федоровой и Ю.А. Франк. Благодарю Н.В. Равина и сотрудников его группы в ФИЦ Биотехнологии РАН В.В. Кадникова и А.В. Марданова за секвенирование генома. Дэвида Бэнкса за помощь в проведении химического анализа проб. Особую благодарность автор выражает научному руководителю О.В. Карначук за неоценимую помощь в работе, обсуждении результатов и написании диссертации. Сокращения. СРБ – сульфатредуцирующие бактерии; ТЕМ - трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия; SEM – сканирующая электронная микроскопия; ICP-MS – масспектральный анализ с индуктивно связанной плазмой; XRD – рентгенофазовый анализ; ПЦР – полимеразная цепная реакция; ДГГЭ – денатурирующий гель электрофорез; NADH – восстановленный никотинамидадениндинуклеотид; ОВП – окислительно-восстановительный потенциал; ATP – аденозинтрифосфат; ЭДС (EDS) – энергодисперсионный анализ. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Объекты исследования. Для выделения культур СРБ были использованы пробы воды и микробных обрастаний, отобранные в 2014 году из отходов Акатуйского месторождения полиметаллических руд и месторождения Шерловая гора в Забайкальском Крае. Из отобранных проб были получены накопительные культуры и выделены новые изоляты СРБ. Также были использованы чистые культуры ацидофильных/ацидотолерантных СРБ из коллекции Лаборатории биохимии и молекулярной биологии при Кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета. При проведении исследований по устойчивости к кислороду в качестве референсной культуры использовали штамм Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, который был любезно предоставлен сотрудниками Лаборатории химии бактерий Национального Исследовательского Центра Франции (Марсель, Франция). Отбор проб и полевые исследования. Образцы воды и матов, предназначенные для культивирования, отбирали в стерильные флаконы объемом 50 мл. Во время отбора проб измеряли температуру, кислотность и окислительно-восстановительный потенциал воды и осадка. Для измерения использовали портативный рН-метр HANNA HI 8314F. Образцы воды для химического анализа фильтровали через стерилизующий фильтр-насадку Millipore Выделение и культивирование СРБ в периодической культуре. Накопительные и чистые культуры СРБ выращивали анаэробно в жидкой пресноводной среде Видделя (Widdel and Bak, 1992) с сульфатом в качестве акцептора электронов при 28 °С. Лактат (6 мМ) и фруктозу (5 мM) использовали как источники углерода и доноры электронов. Чистые культуры выделяли методом предельных разведений или изолируя отдельно лежащие колонии из столбика агаризованной среды. Для изучения устойчивости полученных штаммов СРБ к металлам их культивировали в анаэробных условиях в присутствии металлов по разработанной ранее методике (Karnachuk et al., 2008). При определении предельных и оптимальных значений рН для роста штаммов использовали 1М растворы H2SO4 и NaHCO3, при этом из среды Видделя удаляли карбонатный буфер. Удельную скорость роста рассчитывали по приросту биомассы, эксперименты проводили в трех биологических повторностях. Культивирование в биореакторе. Для проведения экспериментов использовали биореактор Sartorius Biostat B plus. Для создания анаэробных условий среду продували азотом высокой степени очистки (99.98%). Культивировали в полунепрерывном и непрерывном (проточном) режиме со скоростью замены среды 13 мл/час при 28 °С. Микроскопия. Микрофотосъемку и элементный анализ осадков проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа Philips SEM 515 (Philips Export BV, Нидерланды), оборудованного микрозондом для элементного анализа, как описано Ikkert et al. (2013), и с использованием 3D-сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 (FEI Company, США) с интегрированной системой для энергодисперсионного анализа.Ультраструктуру бактериальных клеток изучали методом просвечивающей электронной микроскипии (ТЕМ) на электронном микроскопе JEM-100 CXII (JEOL, Япония) при 80 кВ. Срезы и микрокопирование проводили по разработанной в нашей лаборатории методике (Ikkert et al., 2013). Распределение элементов в бактериальных клетках исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-2100 (JEOL), оснащенного детектором для элементного картирования X-Max EDS (Oxford Instruments, Великобритания). Живые клетки СРБ наблюдали с использованием фазово-контрастной микроскопии на микроскопе Axio Star (Сarl Zeiss, Германия). Микрофотографии получали с помощью микроскопа Axio Imager A1 (Сarl Zeiss, Германия) с цифровой камерой Axio Cam HRc и программным обеспечением Axio Vision. Аналитические методы. Концентрацию сероводорода в культуральной жидкости определяли спектрофотометрически с N,N-диметилпарафенилдиамином (Cline,1969). Концентрацию белка в культуральной жидкости определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Спектральный анализ с целью определения цитохромов проводили на спектрофотометре SLM Aminco™ DW-2000 UV-VIS в диапазоне длин волн 350 нм – 750 нм. Восстановление кислорода штаммами СРБ исследовали с помощью милиамперметра Gilson medical electronics, при контроле рН и температуры. Для проверки устойчивости к окислительному стрессукультуры СРБ культивировали в пробирках Хангейта в оптимальных условиях. Питательную среду продували смесью газов, приготовленной с помощью смесителя газов PEGAS 4000 MF. Концентрацию растворенного кислорода измеряли с помощью регистратора Mettler-Toledo M700, оснащенного модулем O2 ppb 4700 и полярографическим сенсором растворенного кислорода InPro 6900. Оптическую плотность измеряли с помощью лабораторного цифрового колориметра Biochrom WPA CO7000 при длине волны 600 нм. Количественное содержание элементов в пробах шахтных отходов и в культуральной жидкости определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) и ионной хроматографии. Состав кристаллических фаз в осадках, полученных в результате культивирования СРБ в присутствии металлов, исследовали с помощью дифрактометра Shimadzu XRD 6000 с рентгенофазовым анализом. Данные обрабатывали в программном обеспечении Crystallographica-Search Match с использованием базы данных PDF-4 (International Center Diffraction Data, http://www.icdd.com). |