Диплом. Вольтамперометрическое определение холекальциферола в биологическиактивных добавках
 Скачать 1.99 Mb.
|
|
Газовая хроматография. Для определения витаминов группы D газовая хроматография (ГХ) не так популярна вследствие высокой термической неустойчивости и низкой летучести аналита. Однако методики ГХ все равно существуют, и их принято разделять на две большие группы без применения предобработки и с предварительной химической обработкой чаще всего это предварительная изомеризация. Наиболее часто применимыми являются методики первой группы. Их суть сводится к термической циклизации витамина в пирокальциферол или изопирокальциферол в зоне испарителя хроматографа и их последующего 30 детектирования. В результате получаются двойные пики, отношение которых не зависит от экспериментальных условий (температуры и т.д.) в широком интервале. В конечном итоге сумма площадей пиков или площадь главного пика хорошо коррелирует с исходной концентрацией витаминов D. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). На сегодняшний день ВЭЖХ является самым быстрыми селективным методом хроматографии и благодаря этому широко применяется в решении различных аналитических задач, касающихся, в том числе, определения витаминов группы D. Объясняется это рядом преимуществ, которыми обладает ВЭЖХ, а именно а) высокая разрешающая способность ВЭЖХ – селективное разделение изомеров и метаболитов б) отсутствие длительной пробоподготовки в виде предварительного разделения от подобных соединений или значительное сокращение ее продолжительности в) отсутствие предварительной дериватизации; г) отсутствие химического видоизменения и разрушения структуры аналита по сравнению с ГХ и ТСХ; д) высокая чувствительность последующего детектирования на УФ-детекторе вследствие высокого значения молярного коэффициента поглощения аналита (ε = 18461 ммоль) при длине волны λ = 265 нм, предел обнаружения 1 нг/мл [18]. Предложен [22] ВЭЖХ метод определения витаминов группы D в пищевых продуктах с использованием внутреннего стандарта и различных регламентированных вариантов подвижных фаз как для нормально-фазовой, таки для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Указанная методика включает в себя последовательные этапы гомогенизации пробы, омыление водно-этанольным раствором с добавлением антиоксиданта (аскорбиновая кислота) в колбе с обратным холодильником, экстракции смесью растворителей (от двух до пяти раз, концентрировании экстракта при пониженном давлении и 31 температуре не выше 40 С, подготовка раствора для определения, градуировка хроматографических систем, анализ пробы и обработка результатов. Авторами работы [23] представлен способ совместного определения жирорастворимых витаминов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в пищевых продуктах, витаминно-минеральных комплексах и сыворотке крови. В работе применялся детектор с фотодиодной матрицей, в качестве подвижной фазы раствор ацетонитрил-вода 98:2 (по объему, температура процесса разделения 25 СВ данной работе использовалась программа регистрирования, позволяющая одновременно проводить параллельное интегрирование хроматографических пиков при разных заданных длинах волн (при максимуме интенсивности для каждого витамина. Это дает возможность одновременного детектирования витаминов и позволяет снизить предел их обнаружения. Подготовка проб со сложными матрицами к вводу в хроматограф осуществлялась методом твердофазной экстракции. Пределы детектирования составили соответственно витамин А 0,002 мкг/мл, витамин D 3 0,0025 мкг/мл, витамин E 0,04 мкг/мл. Таблица 1 – Характеристические параметры хроматограмм различных аналитов Компонент Время удержания (t R ), мин Степень разделения (R S ) Витамин Е 23,5 4,9 Витамин А 4,4 - Витамин А 5,6 2,7 Витамин D 3 17,6 15,7 В работе [24] сообщается также о возможности совместного детектирования витаминов Аи Е методом УльтраВЭЖХ на колонке Waters Acquity UPLC BEH C18 с размерами частиц 1,7 мкм. В качестве подвижной фазы 100%-ный метанол, температура разделения 25 С. Из жидкой матрицы премиксов витамины экстрагировали изопропанолом – для простых матриц, содержащих только витамины или гексаном с последующим гидролизом для более сложных матриц. Сведения о других наиболее характерных методах ВЖЭХ представлены в таблице 2 [18]. 32 Таблица 2 – Определение витаминов D и их метаболитов ВЭЖХ Авторы Разделяемые соединения Происхождение образца для анализа Тип хроматографической колонки Элюент Примечания Вильямс и др. Витамины D 3 , A, E, K Лекарственные препараты Пермафаз ODS Градиентное элюирование сначала водой, в конце метанолом (5%) или смесью метанол-вода (78:22) Т С Кроль и др. Витамин D 3 и превитамины D 3 , витамины D, E и эфиры витамина А Синтетические смеси и смеси после изомеризации Видак Пентан- тетрагидрофуран (39:1) Штейерле Витамин D 3 и его изомеры Смолообразные продукты и лекарственные препараты Алокс Т (Al 2 O 3 ) Хлороформ Джонс и Де-Люка Витамины D 2 , D 3 и их метаболиты Плазма Зорбакс SIL 1-2%-ный раствор 2- пропанола в скеллизольве Предварительное разделение на сефадексе LH-20 Мулдер, Де-Фрис, Борсье Витамины и Лекарственные препараты Лихросорб SI-60, партисил 5 Гексан-амиловый спирт Колонка для очистки с RP-8; внутренний стандарт – 4,6- холестадиенол Коэн, Лапойнт Витамин Продукты питания, премиксы Лихросорб Гексан- хлороформ (7:3) Уолкер и др. Витамины D 2 , Лекарственные препараты Силмкагель SI-5A Гексан (частично насыщенный водой- хлороформ- тетрагидрофуран- уксусная кислота (40:60:1,5:0,4) Внутренний стандарт – прогестерон Окано и др. ОН ОН Плазма крови Зорбакс SIL Гексан- 2- пропанол (94,5:4,5) Предварительное ВЭЖХ разделение на нуклеосиле С Электрохимическое определение холекальциферола Электрохимические методы анализа, благодаря простоте исполнения, высокой чувствительности, экспресности, широко применяются для анализа 33 различных объектов. В том числе, данная группа методов нашла свое применение в анализе биологически активных веществ. Для анализа холекальциферола может применяться полярографичекое определение витамина D 3 на ртутном капающем электроде (РКЭ) , в основу которого положено восстановление сопряженной триеновой системы до диеновой [25]. Показано также, что полярографический метод позволяет одновременно определять витамины Аи, в том числе в масляных препаратах [26]. Также разработана осциллополярографическая методика определения витамина D 3 в масляных препаратах с предварительной экстракцией смесью триэтиламмония в изопропаноле и диметилформамиде (1:1). Получен сигнал в виде полуволны с потенциалом пика +2,52 В. Измерения проводились с использованием РКЭ в качестве рабочего электрода и насыщенного каломельного электрода – в качестве электрода сравнения. Однако применение ртутных электродов нежелательно из соображений безопасности (ртуть отличается высокой токсичностью, кроме того, потенциалы пиков и волн, выступающих в качестве аналитических сигналов, имеют высокое значение, что может приводить к окислению- восстановлению в сходном диапазоне прочих биологически активных веществ. Таким образом, может наблюдаться существенное искажение получаемых результатов. Таким образом, применение ртутных электродов, а также электродов, изготовленных из углеродных материалов и благородных металлов (золота, серебра, а также металлов платиновой группы) весьма затруднено из-за ряда недостатков 1) необратимость протекания ряда электрохимических на поверхности таких электродов 2) недостаточная селективность протекающих электрохимических реакций (невозможность определения веществ, имеющих близкие потенциалы восстановления (окисления 34 3) недостаточная коррозионная стойкость материалов электрода 4) необходимость приложения значительного перенапряжения для протекания электрохимической реакции. Применение модификаторов (промоторов) поверхностей электродов позволяет снять указанные недостатки [27]. Под термином модифицированный электрод понимается электрод, поверхность которого обработана специальным образом с целью изменения электрохимического отклика. Модификация предполагает нанесение на поверхность электрода химическими, либо физическими методами) химических соединений, либо полимерных пленок, обеспечивающих высокую скорость протекания и снижение величин перенапряжения в процессе переноса электронов. Для определения холекальциферола применяются следующие модификаторы 1) ферментативные системы 2) наночастицы 3) полимерные пленки 4) углеродные нанотрубки. 1.4.5 Прочие методики определения холекальциферола Помимо вышеперечисленных методов существуют также и другие. Грин [18] описал титрование витамина D 3 трихлоридом иода. В процессе титрования образуется гексахлорпроизводное и конечную точку можно обнаружить фотометрически по окраске освобождающегося иода. В анализе витаминов D флуориметрия не играет столь заметной роли, как в анализе некоторых других стероидов. Чен и др. [18] определяли витамины D в трихлорэтиленовом растворе, используя в качестве реагента смесь уксусного ангидрида и серной кислоты. Максимумы спектров возбуждения и испускания лежат соответственно при 390 и 470 нм. 35 Гергели с соавторами [18] описали количественный спектрополяриметрический метод определения витаминов D в масляных препаратах. Также для определения содержания витамина D 3 применяются иммуноферментные методы анализа [28]. Основным недостатком данной группы методов является применение ферментов и антител, как метки, поэтому несмотря на высокую селективность, чувствительность и отсутствие пробоподготовки, подобные системы, как правило, характеризуются сложностями в отношении получения удовлетворительных метрологических характеристик. Данный факт обусловлен склонностью ферментов (как и антител) к денатурации. 36 Глава 2. Аппаратура и методика эксперимента 2.1 Оборудование, ячейка, электроды и растворы Оборудование Экспериментальная разработка методики в данном исследовании осуществлялась на анализаторе вольтамперометрическом ТА («Томьаналит», г. Томск. Данный анализатор имеет множество областей применения в лабораторных целях, в частности в рутинном анализе, а также позволяет проводить исследовательские работы. Имеет небольшой размер и требует малых количеств реактивов при использовании. Рабочие параметры типы форм разверток поляризующего напряжения постоянно-токовая, квадратно- волновая, ступенчатая и дифференциально-импульсная; режимы вывода данных прямой и дифференциальный режим работы двух- и трехэлектродный. Основные особенности возможность работы стремя образцами одновременно, встроенный канал для подачи инертного газа для дегазации анализируемого раствора, возможность устранения мешающего влияния кислорода встроенным источником УФ-излучения, возможность перемешивания раствора в ячейке без применения магнитной мешалки, посредством вибрации индикаторного электрода, наличие программы электрохимической очистки электродов. Технические характеристики чувствительность – А, воспроизводимость аналитических сигналов – 10-15 Спектрофотометрические измерения проводились на спектрофотометре Agilent Technology Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies, США, подключенном к персональному компьютеру. Технические характеристики диапазон измерений от 190 до 1100 нм максимальная скорость сканирования 24000 нм/мин; воспроизводимость длины волны ±0,1 37 нм точность установки длины волны ±0,5 нм фотометрический диапазон 3,3 А. Все оборудование перед работой проходило проверку и подготовку, согласно инструкции по эксплуатации и техническому описанию соответствующего прибора. Оценку pH среды проводили при помощи рН-метра/иономера ИТАН («Томьаналит», г. Томск) с электродом ЭС-10308 («Томьаналит», г. Томск, имеющим сферическую мембрану и эффективным при работе с пробами малого объема. При записи циклических вольтамперограмм удаление кислорода осуществлялось посредством барботажа рабочего объема газообразным азотом с содержанием кислорода не более 0,003%. Подача компрессированного азота проводилась через силиконовый шланг со съемным наконечником из баллона. Взвешивание точных навесок веществ осуществлялось на лабораторных аналитических весах общего назначения ВЛ-210 (класс точности г, «Госметр», Россия. Получение дистиллированной воды производилось с использованием аквадистиллятора «ДЭ-4» («ТюменьМедико», г. Тюмень) и системы водоочистки Milli-Q Advantage A10 I типа с фильтром Миллипак (Merck Millipore, Германия. Электрохимические ячейки представляют собой кварцевые стаканчики объемом 20 см 3 В работе использовалась следующая мерная лабораторная стеклянная посуда цилиндры вместимостью 10.0 и 20.0 см, также колбы наливные, объемом 50 и 25 см, пробирки пластиковые центрифужные объемом 15 см и пробирки типа Эппендорф объемом 1,5-2 см 3 При приготовлении используемых для анализа растворов и для добавки исследуемых аналитов использовали одноканальные механические дозаторы переменного объема вместимостью 100-1000, 20-200, 1000-5000 38 мкл типа «Колор» BK44759 и TheroScientific BP59599 соответственно. Точность отбора проб для всех дозаторов соответственно составляет ±0,4 мкл, ±0,14 мкл и ±0,25 мкл. Для каждой пробы использовали сменный наконечник дозатора. Чистоту посуды и используемого фонового электролита проверяли вольтамперометрически, посредством проведения холостого опыта перед каждой серией опытов. Электроды и электрохимические ячейки В процессе работы использовали схему стремя электродами рабочий индикаторный, сравнения и вспомогательный электрод. Схема установки, использованной для проведения анализа, представлена на рисунке 4. Рисунок 4 – Схема экспериментальной установки 1 – анализатор вольтамперометрический (АТ, TA-Lab); 2 – электрохимическая ячейка 3 – фоновый электролит 4 – хлорсеребряные электроды 5 – рабочий индикаторный) электрод. В работе в качестве индикаторных электродов использовались модифицированные углеродсодержащие композитные электроды с обновляемой поверхностью (площадь поверхности составляет 0,060 см. Данный вид электродов представляет собой полиэтиленовый корпус, заполненный электропроводящей смесью термостабилизированного 39 полиэтилена высокого давления и технического углерода марки N220 в соотношении 30% масс. углерода и 70% масс. полиэтилена. В качестве электрода сравнения, а также вспомогательного электрода в данной работе применялись хлоридсеребряные электроды (ХСЭ), представляющие собой полые цилиндры, заполненные насыщенным раствором хлорида калия (KCl), c опущенной в него серебряной проволокой, покрытой труднорастворимой солью хлорида серебра. Используемые реактивы Перечень веществ, используемых в данной работе ГСО СОП 102-010 холекальциферола, кристаллический порошок белого цвета, о.с.ч., Sigma Aldrich (Германия стандарт-титры для приготовления стандартных буферных растворов («УралХимИнвест», Уфа, Россия - гидрофталат калия KHC 8 H 4 O 4 (рН=4,01); - эквимолярная смесь дигидрофосфата калия KH 2 PO4 и гидрофосфата натрия Na 2 PO 4 (рН=6,86); - тетраборат натрия водный Na 2 B 4 O 7 *10H 2 O (рН=9,18); изопропиловый спирт, о.с.ч., Sigma Aldrich (Германия октоксинол-9, о.с.ч., Sigma Aldrich (Германия лиофилизированный порошок ДАГУДФК, синтезированный на кафедре органической химии и полимеров КарГУ им. Е.А. Букетова под руководством д.х.н. Салькеевой Л.К. 2.2. Объекты исследования и методика пробоподготовки В качестве объектов исследования использовались следующие биологически-активные добавки различных производителей в разных лекарственных формах - «АкваДетрим» – водный раствор (MEDANA PHARMA, S.A. Польша - «Natural Factors Vitamin D 3 » – таблетки (Natural Factors, Канада 40 - капли масляные и капсулы желатиновые (Now Foods, США. Для подготовки образцов в форме таблеток проводили их измельчение в фарфоровой ступке, далее проводили двойное квартование и отбор пробы необходимой массы, затем проведение жидкостной экстракции растворением навески в 10 см изопропилового спирта в центрифужной пробирке объемом 15 см, последующее центрифугирование при 20 С со скоростью 4000 об/мин в течение 5 минут и смешение с поверхностно- активным веществом Triton X-100 для дальнейшего перевода вводную фазу. Подготовка образцов в виде масляного раствора осуществлялась последовательным проведением нескольких этапов 1) отбор дозатором необходимого количества объекта 2) жидкостная экстракция в 10 см 3 изопропилового спирта путем смешения с ним объекта 3) центрифугирование при 20 С со скоростью 4000 об/мин 15 минут 4) отделение надосадочной части и его смешение с Triton X-100. 2.3 Методика определения холекальциферола методом вольтамперометрии Подготовка фонового электролита осуществлялась посредством разведения содержимого фиксанала в мерной колбе на 1000 см 3 Подготовка стандартного раствора холекальциферола взвешивание навески массой 0,0050 гс точностью дог внесение в мерную колбу объемом 50 см доведение до метки изопропанолом – получение раствора с концентрацией 100 мкг/см 3 ; разбавление раствора до концентрации 50 мкг/см 3 смешением исходного раствора св соотношении 1:1. Вольтамперометрические измерения проводили при помощи трехэлектродной ячейки, в которой в качестве рабочего применялся МЭ ДАГУДФК и НЧ Ni. В качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода использовались ХСЭ. Выбор материала вспомогательного электрода обусловлен тем, что ХСЭ отвечает требованиям, предъявляемым к 41 вспомогательному электроду, изложенным в [29]: обладает большой площадью поверхности за счет применения витой серебряной проволоки, эффективно стабилизирует получаемые сигналы и не участвует в электрохимической реакции (продукты его окисления остаются в объеме электродного корпуса. Вольтамперометрические измерения проводили следующим образом кварцевый стаканчик, заполненный фоновым электролитом, помещали в гнездо анализатора и вводили в электролит закрепленные в специальных разъемах электроды. После чего, проводили съемку в диапазоне от 0 до +В со скоростью развертки потенциала, равной 70 мВ/с в режиме постоянно- токовой вольтамперометрии. Таким образом, получали фоновую вольтамперную кривую. Отсутствие пиков на данной кривой свидетельствует об отсутствии в системе загрязняющих веществ, в том числе поверхностно активных. Затем в электрохимическую ячейку вводили добавку пробы и проводили регистрацию вольтамперной кривой. Затем проводили измерения тока электроокисления для дальнейшего построения градуировочного графика. В связи с чем, осуществляли последовательное введение приготовленного раствора холекальциферола в ячейки и проводили регистрацию аналитического сигнала в диапазоне потенциалов от 0 до +В. Полученные кривые подвергались обработке программным обеспечением анализатора вольтамперомерического TA-Lab с целью вычисления предельного тока электроокисления холекальциферола. По результатам измерения предельного тока окисления растворов стандартной (градуировочной) серии строили график зависимости предельного тока окисления растворов (I) от концентрации холекальциферола (С, мкг/см 3 ). Уравнение прямой линии рассчитывается методом наименьших квадратов [30]. Общий вид уравнения I = k·C + b, (2.1) где I – предельный ток окисления, АС концентрация определяемого вещества в анализируемом растворе, мкг/см 3 ; k и b – 42 коэффициенты. Коэффициент k – тангенс угла, образуемого калибровочным графиком и осью абсцисс, коэффициент b – расстояние между началом координат и гипотетической точкой пересечения калибровочного графика с осью ординат, выраженное в единицах оптической плотности. Аппроксимация полученных данных с целью построения градуировочного графика осуществлялась средствами программного пакета Microsoft Office Excel. Анализ содержания холекальциферола в объектах исследования проводили аналогично с применением соответствующих подготовленных растворов. Результаты обработки – вычисленные значения предельного тока окисления – использовали для определения концентрации в исходном объекте с помощью ранее построенного градуировочного графика. Качественная оценка содержания витамина D 3 в объектах анализа проводилась по стандартной методике [31], которая приведена далее. К раствору 0,5 мг препарата в 5 см хлороформа добавляют 0,3 см уксусного ангидрида и 0,1 см серной кислоты, смесь энергично встряхивают появляется ярко-красное окрашивание, которое быстро переходит в фиолетовое, синее, а затем в зеленое. |