Диплом. Вольтамперометрическое определение холекальциферола в биологическиактивных добавках
 Скачать 1.99 Mb.
|
|
1. Подбор материала рабочего электрода 2. Подбор модификатора 3. Подбор условий нанесения слоя модификатора на поверхность рабочего электрода 4. Подбор электрохимических условий определения вещества 5. Исследование кинетических и термодинамических параметров процесса. Научная новизна Разработана методика количественного определения холекальциферола в составе БАД разной лекарственной формы. Подобраны условия проведения электроокисления холекальциферола на модифицированном углеродсодержащем композитном электроде вводной фазе. Разработана методика пробоподготовки анализируемых объектов исходя из особенностей лекарственной формы. Практическая значимость Разработанная методика вольтамперометрического определения холекальциферола может быть использована для количественного определения данного вещества в различных БАД и применяться в лабораторной практике фармацевтической отрасли. 18 Глава 1. Литературный обзор 1.1 Физические и химические свойства холекальциферола Холекальциферол представляет собой бесцветный порошок с молекулярным весом 385 г/моль, нерастворимый вводных средах. Относится к классу жирорастворимых витаминов. Стероидный гормон состава C 27 H 44 O, существует в кристаллическом виде, температура плавления которого 83 С [1]. На рисунке 1 представлена структурная формула вещества. Холекальциферол является прекурсором кальцитриола. Рисунок 1 – Структурная формула холекальциферола Кальциферолы (витамины группы D) неустойчивы к действию ультрафиолетового облучения. Происходящий при этом фотохимический процесс необратим. Реакция фотоизомеризации кальциферолов приводит к образованию супрастерина-I, супрастерина-II и токсистерина. Холекальциферол чувствителен к повышенным температурами неустойчив при комнатной температуре. Нагревание при 200 С без доступа воздуха приводит к разложению кальциферолов с образованием пирокальциферола-3 и изопирокальциферола-3 [1]. Благодаря наличию в своей структуре гидроксильной группы кальциферолы активно вступают в реакции этерификации с образованием сложных эфиров. Также кальциферолы окисляются кислородом воздуха, в 19 результате образуются различные продукты. Кальциферолы устойчивы к щелочам, но чувствительны к действию кислот. Холекальциферол окисляется трет-бутилатом аммония в смеси с бензолом и ацетоном и образует «изокетовитамин D 3 ». При действии хлоранила холекальциферол подвергается дегидрогенизации (процесс дегидрирования. Витамин D 3 (имеющий 5,6-цис-конфигурацию) при каталитическом участии йода или эозина (BF 3 ) в нейтральной или щелочной среде превращается в 5,6-транс-холекальциферол. Который, в свою очередь, может быть подвергнут транс, цис-фотоизомеризации при действии ультрафиолетового света с иверсией в холекальциферол) [1]. Существует ряд цветных качественных реакций на кальциферолы. Одна из них взаимодействие холекальциферола с раствором брома в хлороформе (соотношение 1:60). Цвет раствора постепенно приобретает зеленовато-голубое окрашивание. 1.2 Метаболизм витамина D 3 и пути реализации его основных функций Витамины группы D относятся к группе жирорастворимых витаминов. Холекальциферол витамин D 3 ) представляет собой общепринятую форму витамина D, синтезирующуюся у животных. Эргокальциферол (витамин D 2 ) представляет собой форму, которая синтезируется главным образом в растительных источниках, например, в грибах. В немногочисленных необогащенных продуктах питания витамин D присутствует в очень ограниченном количестве, а самостоятельная выработка витамина в организме человека возможна только при определенных условиях. Вовремя пребывания на солнце под воздействием ультрафиолетовых лучей, падающих под определенным углом, находящийся в коже человека 7-дегидрохолестерол (7-DHC) трансформируется в 20 провитамин D 3 (PRED3) [6]. Окончательный этап биотрансформации провитамина осуществляется под воздействием тепла. Витамины D 2 и D 3 имеют сходное химическое строение и этапы метаболизма в организме. Холекальциферол представляет собой неактивную биологически инертную форму витамина. Его активация и превращение в форму гормона ОН) осуществляется посредством специфического метаболизма в организме, который заключается в двух этапах ферментативного гидроксилирования [7]. Первый этап биотрансформации в 25-гидроксихолекальциферол происходит в печени под действием фермента 25-гидроксилазы. Данный метаболит также имеет второе название кальцидиол по наличию двух гидроксигрупп в структуре. Рисунок 2 – Схема метаболизма витамина D и альфакальцидиола [8] Вторая реакция гидроксилирования происходит преимущественно в почках под действием другого фермента – 1α-гидроксилазы. Результатом 21 второго этапа является синтез физиологически активного 1,25-дигидроксивитамина D, или так называемого гормона [8]. Другое название метаболита по аналогии с предыдущим – кальцитриол. Свое биологическое воздействие кальцитриол начинает уже в процессе всасывания в тонком кишечнике, путем взаимодействия со специфическими рецепторами витамина D (так называемые, VDR), в результате чего усиливается кишечная абсорбция кальция, и с рецепторами остеобластов – регулируется фосфорно-кальциевый метаболизм. Для предотвращения появления избыточного содержания кальция и фосфора в организме существует обратная связь в виде фермента 24-гидроксилазы, активность которой возрастает при достижении повышенной или нормальной концентрации данных ионов в сыворотке крови [8]. Действие 24- гидроксилазы заключается в подавлении синтеза активной формы кальцитриола путем превращения ОН в альтернативный метаболит — ОН, обеспечивающий фиксацию кальция и фосфора в костной ткани. Процесс регуляции синтеза в почках ОН осуществляется при непосредственном участии циркулирующего в крови паратиреоидного гормона (ПТГ), посредством изменения активности 1α-гидроксилазы. На концентрацию ПТГ в свою очередь по механизму жесткой обратной связи оказывает влияние, как уровень данного метаболита, таки концентрация ионизированного кальция в плазме крови. Эта отрицательная обратная связь замыкается ингибированием 1α-гидроксилазы высокими концентрациями самого кальцитриола и фактора роста фибробластов 23 (FGF23). Некоторые ткани организма способны к самостоятельной выработке для локальных целей активного метаболита ОН. На интенсивность внутриклеточного синтеза кальцитриола преимущественно оказывает влияние уровень 25(OH)D 3 в окружающих тканях, а не концентрация 1,25(OH) 2 D 3 в системном кровотоке [9]. 22 1.3 Биологические функции витамина D в организме Основной и наиболее важной функцией, выполняемой витамином D в организме, является регулирование обмена кальция и фосфора. Эти процессы протекают в два этапа, а именно поступление иона в слизистую оболочку и его переход в серозную оболочку. Оба этапа находятся под контролем активной формы витамина D 3 – кальцитриола, который специфически действует как на структуру, таки свойства липопротеидной мембраны микроворсинок слизистой ткани кишечника, повышая её проницаемость для пассивно диффундирующего кальция и одновременно увеличивая проникающую и транспортную функции кальциевого катиона [6,7]. Процесс минерализации костных тканей в организме осуществляется через активацию кальцитриолом процессов абсорбции ионов кальция и фосфора в кишечнике, что способствует поддержанию необходимых уровней этих ионов в крови. Этот процесс оказывает непосредственное влияние в случае необходимости нарост и регенерацию костных тканей, поддерживая работу остеобластов и остеокластов, и предотвращает появление различных костных заболеваний, в частности, гипокальциемической тетании. Многие исследователи сходятся во мнении о том, что функции витамина D в организме чрезвычайно широки и не ограничиваются только поддержанием кальций-фосфорного обмена [10]. Доказано, что рецепторы VDR расположены во многих клетках и тканях различных систем организма, например, это сердечно-сосудистая система, репродуктивные органы, головной мозги многие другие. Более того в функциональный ряд некоторых из этих тканей входит возможность локального синтеза 1α-гидроксилазы для выработки и накопления D- гормона. В результате происходит локальное повышение концентрации кальцитриола, который расходуется непосредственно для покрытия собственных нужд без увеличения его концентрации в общем кровотоке [11]. 23 До некоторого времени действие витамина D на иммунную систему не было изучено, однако сегодня современные исследования подтверждают этот факт, поскольку рецепторы присутствуют практически во всех клетках данной системы. Более того, они имеют собственную 1α-гидроксилазу. В частности, это активированные лимфоциты, мононуклеары, антиген представляющие клетки и дендритные клетки, на которые по современным данным активная форма витамина оказывает прямое действие, включая недифференцированные и инактивированные Т–хелперы и Т–регуляторы. Кроме того, одной из функций витамина D в организме является предотвращение чрезмерного выброса провоспалительных цитокинов, модулируя ответ макрофагов и влияя тем самым на скрытые воспалительные процессы [12]. Вот еще несколько примеров внескелетных эффектов витамина D [13]: влияние на процесс обновления волосяных фолликулов в коже через рецептор VDR; влияние на сердечно-сосудистую систему посредством повсеместного распространения рецепторов и ферментов, необходимых для процессов метаболизма витамина D, в артериальных сосудах, сердце и практически всех клетках и тканях, которые, так или иначе, влияют или связаны с проявлениями патогенеза заболеваний сердца и кровеносной системы влияние на когнитивные функции через локализованные в головном мозге рецепторы и аналогично иммунной системе локализации собственных ферментов. Снижение риска развития когнитивных расстройств, например, такого распространенного заболевания, как деменция, посредством интенсификации фагоцитоза амилоидных бляшек и регуляции нейротрофинов; влияние на течение беременности и репродуктивное здоровье посредством сосредоточения VDR и локализованных источников 1a- гидроксилазы в тканях репродуктивных органов – яичниках, матке, плаценте, яичках и гипофизе. 24 1.4 Методы определения витамина Актуальность определения витаминов группы D, ив частности, холекальциферола, обусловлена как целями клинического анализа мониторинг содержания аналита в биологических жидкостях пациента, таки в целях контроля препаратов на фармацевтическом производстве. Несмотря на то, что витамины группы D являются очень сложными аналитами, на сегодняшний день имеется множество методов их определения, которые можно объединить в несколько больших групп биологические методы, оптические методы, хроматографические методы, электрохимические. 1.4.1 Биологические методы определение витаминов группы D В основе данных методов лежит сравнение исследуемого образца с международным стандартом, который представляет собой раствор холекальциферола в каком-либо растительном масле (чаще всего, оливковое) с содержанием активной субстанции 0,025 мкг/мл или 1 МЕ. Также в данной группе методов используются различные биосенсоры. В частности, в работе [15] использовались два метода плазмонный резонанс и электрохимический биосенсор для обнаружения связи 25-ОН-витамина D. Авторами был изготовлен иммуносенсор, в основе которого лежало применение плазмонного резонанса. За счет применения антитела к витамину D осуществлялось прямое определение его содержания по связи 25-OH и косвенное определение с помощью связующего белка. Также был изготовлен электрохимический биосенсор на основе модифицированного 4- ферроценилметил-1,2,4-триазолин-3,5-дионом золотого электрода, изготовленного методом трафаретной печати. 25 1.4.2 Оптические методы определения холекальциферола УФ-спектрофотометрия. Данный метод анализа позволяет определять холекальциферол в различных растворителях путем регистрации интенсивности поглощения от длины волны падающего излучения. Максимум поглощения наблюдается при 265 нм, удельный показатель поглощения в среде этанола равен Е см % = 485 [16]. Спектрофотометрический анализ может быть эффективно применен для решения простых аналитических задач. Вследствие того, что позволяет работать исключительно в простых, чаще всего, однокомпонентных, матрицах, не содержащих других аналитов [17]. Данный метод хорошо комбинируется с хроматографическими методами анализа, которые позволяют устранить мешающие и искажающие результат факторы посредством разделения исходной матрицы. Тем не менее, в ряде случаев не менее эффективны иные методики, позволяющие отделить холекальциферол от мешающих компонентов, в частности, посредством омыления. Но применение подобных операций сопровождается использованием реактивов и повышением температуры, что может привести к деструкции или изомеризации части витамина. ИК-спектроскопия. Методы количественного определения с помощью инфракрасной спектроскопии отличаются высокими погрешностями и на практике малоприменимы. В большинстве случаев ИК- спектроскопию используют для подтверждения подлинности биологически активных соединений. В частности, разработанные на данный момент методики определения холекальциферола относятся к качественному анализу и позволяют лишь обнаружить его наличие, ноне выявить содержание. Авторы [18] сообщали о количественном анализе эргокальциферола в смеси, содержащей 3 родственных соединения, который включал предварительное бромирование и нитрование образцов с последующей регистрацией ИК- спектров в интервале 750-900 см. Также авторами [19] предложена 26 идентификация витамина D 3 вводных растворах. Данная методика позволяет провести экспресс оценку наличия холекальциферола в обогащенных сахаристых кондитерских изделиях. Колориметрические методы. В основу данной группы методов положены цветные реакции холекальциферола с последующим определением интенсивности поглощения полученных растворов. Чаще всего в данной группе методов используется способность кальциферолов реагировать с хлоридом сурьмы) в среде хлороформа с образованием окрашенного комплекса с дальнейшим измерением его поглощения при 500 нм. Чувствительность указанного метода превышает чувствительность УФ- спектрофотометрического определения примерно в 4 раза. Впоследствии оригинальная методика была усовершенствована добавлением ацетилхлорида в реакционную смесь, что повысило скорость появления окраски и устойчивость образовавшегося комплекса, и применением дихлорэтилена в качестве растворителя для повышения устойчивости реагента [20]. Наряду с реакцией с хлоридом сурьмы, известны другие цветные взаимодействия [18] – серная кислота-фурфурол, хлорная кислота- анисовый альдегид, соляная кислота-тетрахлорметан, трифторуксусная кислота-пероксид водорода и другие. Применение колориметрических методик сопряжено со сложной пробоподготовкой, поэтому традиционно предпочтение отдается другим методам. Масс-спектрометрия – метод исследования вещества путем определения отношения массы к заряду и количества заряженных частиц, образующихся притом или ином процессе воздействия на вещество. На сегодняшний день имеется большое количество методик определения холекальциферола при помощи масс-спектрометрии. Можно сказать, что самыми первыми разработчиками в указанной области были Окано и др. и Халкета и др. [18]. Первая группа занималась масс-спектрометрическим детектированием в сочетании с газожидкостной хроматографией продуктов облучения 7-дегидрохолестерина, полученного из кожи крыс, вторая – 27 детектированием гидроксилированных метаболитов. Масс-спектро- метрическим методом анализа в присутствии мешающих компонентов – жирорастворимых витаминов – занимались Цукида и Сакаи [18]. Поляриметрия Оптическая активность холекальциферола и его гомологов является основанием использования указанных методов анализа. Поляриметрические методики часто используются для оценки подлинности фармацевтических субстанций, а также для определения степени их чистоты, что активно применяется и для холекальциферола. В частности, данный метод рекомендует Европейская Фармакопея [21]. Оценка чистоты и подлинности осуществляется по показателю удельного вращения, который для 0,8%-ного спиртового раствора холекальциферола при длине кюветы 1 дм находится в интервале [𝛼] 𝐷 20 = от + 105° до + 112°. Главным недостатком поляриметрии является ее низкая селективность, поскольку показатели удельного вращения для некоторых веществ могут находиться всхожих интервалах или даже совпадать. Таким образом, совместное определение водной смеси изомеров без их предварительного разделения крайне затруднено. 1.4.3 Хроматографические методы анализа витаминов D Колоночная хроматография являлась первым методом, используемым для предварительного разделения смеси различных компонентов, включающих холекальциферол, для дальнейшего детектирования. Тем не менее, сегодня наиболее предпочтительны иные хроматографические методики, такие как тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография. Наиболее применим метод Мулдера, который включает в себя несколько последовательных стадий [18]: хроматографирование экстагированного и подверженного гидролизу витамина D в виде раствора в петролейном эфире на колонке с оксидом алюминия, обработанным фосфатом, в основном с целью отделения витамина D от больших количеств витамина Е 28 последовательное элюирование 8 % -ным раствором диэтилового эфира иным раствором диэтилового эфира в петролейном эфире для окончательного удаления витамина Е распределительное хроматографирование с целью отделения полимеров витамина А элюирование изооктаном или полиэтиленгликолем 600 на колонке, заполненной смесью целита 545; элюирование бензолом витамина D на колонке с деактивированным гранулированным флорексом с целью удаления последних следов продуктов разложения витамина Аи полиэтиленгликоля Тонкослойная хроматография. Одним из наиболее часто используемых экспресс методов разделения смесей и отделения витаминов D от других жирорастворимых биологически активных соединений, в том числе от витаминов Аи Е, является тонкослойная хроматография (ТСХ). Обзор на наиболее популярные методики представлен на рисунке 3. Рисунок 3 – Существующие методики разделения витаминов группы D и родственных соединений методом ТСХ [18] 29 Как видно из рисунка, наиболее предпочтительным адсорбентом в отделении витаминов группы D является силикагель. Удобно применять готовые пластинки силуфол в системах хлороформ – метанол (96:4 или 90:10), хлороформ, циклогексан – эфир (1:1), бензол – ацетон (9:1), гексан – бензол (1:1 или 2:1), ацетон – вода (4:1). Для последующего выявления пятен, принадлежащих кальциферолам, используют чаще всего раствор хлорида сурьмы) в уксусной кислоте. Поскольку процесс разделения может быть сопряжен с разложением идентифицируемого соединения ввиду его малой устойчивости и последующих искажений в количественных результатах, существуют определенные правила работы при анализе витаминов D методом ТСХ [18]: 1) работа при температурах ниже комнатной 2) отсутствие воздействия прямых солнечных лучей, в случае если это необходимо, минимальная продолжительность облучения 3) введение в растворитель веществ-антиоксидантов – трилон Б 0,05%, бутилокситолуол 0,002% и др 4) высокий класс чистоты растворителей 5) незамедлительное внесение пластинки с помещенными каплями образцов в хроматографическую камеру без предварительного высушивания 6) детектирование и элюирование разделенных пятен без предварительного испарения растворителя. |